CN109010349B - 白芨寡糖在改善肠道微生态中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白芨寡糖及其组合物在改善肠道微生态中的应用。本发明的白芨寡糖聚合度为2‑20，分子量范围为200‑5000Da。本发明的白芨寡糖可降低急性结肠炎的免疫反应，抑制结肠炎的典型症状，改善肠道的微环境，优化肠道菌群组成，增强肠道屏障功能。本发明的白芨寡糖及其组合物可用于改善多种原因导致的肠道微生态紊乱的疾病防治。

Description

白芨寡糖在改善肠道微生态中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种白芨寡糖在改善肠道微生态中的应用。
背景技术
肠道微生态是指宿主肠道与其邻近微生物形成的一个庞大的生态系统。肠道细菌占肠道内容物的1/3，数目庞大，种类繁多，各自特性并不相同，对宿主产生的影响也不尽一致，超过宿主细胞数量10倍的肠道细菌在稳定肠道屏障、调节代谢、参与免疫等方面具有重要作用。现有证据表明，肠道菌群的紊乱可导致肥胖、糖尿病、炎性肠病、抑郁等疾病。而肠道屏障功能的破损又将进一步恶化肠道菌群的组成。肠道菌群和宿主之间存在着互相影响、此消彼长的相互利相生的紧密联系。肠道炎症则是肠道菌群的失衡导致疾病的典型代表，临床表现主要有腹痛、腹泻、稀水便或黏液脓血便。部分病人可有发热及里急后重感觉，故亦称感染性腹泻。肠炎按病程长短不同，分为急性和慢性两类。慢性肠炎病程一般在两个月以上，临床常见的有慢性细菌性痢疾、慢性阿米巴痢疾、血吸虫病、非特异性溃疡性结肠炎和限局性肠炎等。目前治疗肠炎的药物为抗生素和直接作用于肠道粘膜的氨基水杨酸类，虽对疾病有治疗效果，但在不同程度上引起肠道菌群紊乱、耐药性、药物依赖型、肝肾损伤等副作用。因此，开发具有改善肠道微生态且无毒副作用药物或保健食品具有重要的应用前景。
白芨，兰科植物白及属(Bletilla Striata)的干燥块茎，是我国的传统珍稀名贵中药，主产于华南地区、长江一带。该药味苦、甘、涩、微寒；归肺、肝、胃经；具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌的作用具有收敛止血、消肿生肌的功效。常用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂烧伤及、胃及十二指肠溃疡出血等疾病。现代生物活性研究表明白芨具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抗菌、促进伤口愈合等作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，而提供白芨寡糖在制备改善肠道微生态的制剂中的新应用。
白芨寡糖在制备改善肠道微生态的制剂中的应用。
具体地，所述应用为白芨寡糖在制备改善肠道组织炎症、肠道屏障功能受损及肠道菌群紊乱制剂等中的应用。
具体地，所述的肠道组织炎症疾病包括非特异性肠炎、溃疡性肠炎、肠胃炎、慢性肠胃炎等疾病。
具体地，所述肠道菌群紊乱为肠道菌群多样性相比于正常情况为降低状态。菌群多样性可为通过计算机算法chao1或observed species或PD whole tree或shannon等得到的数值。白芨寡糖及其组合物可改善肠道菌群紊乱，具体表现为肠道菌群多样性恢复，促进有益菌和有害菌比例平衡等。所述有益菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌、Akkermansia等等，所述有害菌包括脱硫弧菌、梭菌等。
具体地，所述肠道屏障功能受损为肠道粘蛋白降低，或肠道紧密连接蛋白含量下降或肠道上层粘液受损。
具体地，所述白芨寡糖的聚合度为2-20，分子量范围为200-5000Da。
具体地，所述白芨寡糖的制备方法包括如下步骤：
(1)白芨块茎经研磨成粉，白芨粉末与水按一定比例混合，在一定温度条件下浸润抽提一定时间；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置一定时间；
(3)步骤(2)所得沉淀用水复溶，加入一定浓度的强酸或多糖水解酶降解，加入碱性试剂或升温终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
按上述方案，步骤(1)中白芨块茎经研磨成粉的粒径大于70目。
按上述方案，所述多糖水解酶包括葡萄糖糖苷类水解酶如葡聚糖酶、甘露糖糖苷类水解酶如甘露聚糖酶、半乳糖糖苷类水解酶等。
优选的，所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入10-60倍体积水进行混合，在10-100℃条件下浸润抽3-12h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-90％乙醇，静置8-24小时，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成0.8％-5％的溶液，加入浓度0.5-3M的强酸或多糖水解酶在25-50℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加1-30mg多糖水解酶；所述强碱可为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等。
更优选的，所述白芨寡糖可按如下步骤制备：
(1)白芨块茎经研磨成粉，加入20-40倍体积水进行混合，在20-90℃条件下浸润抽4-8h，得到抽提液；
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液，加入70％-80％乙醇，静置12-20h，所得沉淀即为白芨多糖；
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成1％-3％的溶液，加入浓度1-2M的强酸或多糖水解酶在25-40℃温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉(即为白芨寡糖)；所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加2-20mg多糖水解酶。
本发明还提供白芨寡糖组合物在制备改善肠道微生态的制剂中的应用；所述的白芨寡糖组合物包括白芨寡糖、益生元，和/或治疗肠炎的药物氨基水扬酸，所述的益生元为木寡糖、果寡糖、壳寡糖、甘露寡糖、葡寡糖等。
按上述方案，所述的制剂剂型为水剂、粉剂、胶囊剂、冲剂等，可按常规生产方式添加对应常规辅料、填料、矫味剂制成。具体使用量按白芨寡糖的有效量计为2mg/kg-100mg/kg。
本发明的有益效果：
本发明利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎模型和利用噁唑酮(OXZ)诱导的溃疡性结肠炎对白芨寡糖在调节肠道微生态中的活性研究，实验结果表明，一定浓度的白芨寡糖能显著降低急性结肠炎的症状，提高结肠的长度，减少溃疡性结肠炎的炎症反应，改善便血情况。通过16S rRNA高通量测序发现，白芨寡糖可以显著提高肠炎小鼠的肠道菌群多样性，抑制肠道菌群失调。肠道组织水平实验表明，白芨寡糖可有效改善肠道的屏障功能，降低炎症因子的表达。可进一步开发用于肠炎及其他肠道微生态异常的疾病。
附图说明
图1.酸水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图，结果表明：酸水解法制备的白芨寡糖的主要成分为三糖、四糖、五糖，其中：1三糖，2四糖，3五糖，经分析计算：三糖、四糖、五糖所含比例分别为40％，30％，20％，分子量200-1000；
图2.酶水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图，酶水解法制备的白芨寡糖的的主要成分为三糖、四糖、五糖，其中：1三糖，2四糖，3五糖，经分析计算：三糖、四糖、五糖所含比例分别为28％，49％，20％，分子量200-1000；
图3.白芨寡糖对DSS处理小鼠的生理指标的影响(Ctrl：对照处理；BO：正常小鼠加白芨寡糖处理；DSS：葡聚糖硫酸钠处理；DSS+BO：白芨寡糖联合DSS处理)A.不同处理组小鼠的体重变化曲线；B.不同处理组小鼠的饮食量变化曲线；C.小鼠实验完成后，取结肠部分并测量其长度；D.根据小鼠大便、结肠、采食量、体重等对结肠炎病理打分。
图4.白芨寡糖对OXZ处理小鼠的结肠炎症的抑制(Ctrl：对照处理；BO：正常小鼠加白芨寡糖处理；OXZ，噁唑酮处理，OXZ+BO,白芨寡糖联合OXZ处理)结肠组织炎症因子IL-1β(A),MCP-1(B),TNFα(C)，LPS(D)变化，检测血清中脂多糖水平变化。
图5.白芨寡糖对DSS处理小鼠的肠道菌群的重塑(Ctrl：对照处理；BO：正常小鼠加白芨寡糖处理；DSS：葡聚糖硫酸钠处理；DSS+BO：白芨寡糖联合DSS处理)。不同处理组小鼠的肠道菌群多样性差异，基于不同算法chao1,observed species,PD whole tree,shannon所得多样性数值，数值越高代表多样性越好。
图6.白芨寡糖对DSS处理小鼠的肠道粘蛋白的改善(Ctrl：对照处理；BO：正常小鼠加白芨寡糖处理；DSS：葡聚糖硫酸钠处理；DSS+BO：白芨寡糖联合DSS处理)
具体实施方式
如下为本发明的实施例，其仅用作对本发明的解释而并非限制。
白芨寡糖的制备：
实施例1强酸法制备白芨寡糖
在本实施例中，提供一种强酸水解法制备白芨寡糖的方法，具体实施步骤如下：
(1)取25g白芨块茎研磨成80目粉末，加入500ml的水混匀，在80℃条件下溶解抽提8h，得到抽提液；
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤，截留沉淀后获得滤出液，减压蒸馏成得到50ml的浓缩液；
(3)步骤(2)所述浓缩液加入150ml的95％乙醇，静置过夜12h。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤，截留后获得沉淀物；
(5)步骤(4)所述沉淀物复溶后，加入三氟乙酸(终浓度为1.0M)50℃进行水解2h，然后使用一定氨水中和其水解产物，直到pH到达6-8，减压浓缩后，冻干成白芨寡糖干粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图1所示。
实施例2酶解法制备白芨寡糖
在本实施例中，提供多糖水解酶制备白芨寡糖的一种方法，具体实施步骤如下：
(1)取40g白芨经块研磨料粉末，加入600ml的水混匀，在40℃条件下溶解抽提12h，得到抽提液；
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤，截留沉淀后获得滤出液，减压蒸馏成得到60ml的浓缩液；
(3)步骤(2)所述浓缩液加入200ml的90％乙醇，静置过夜。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤，截留后获得沉淀物；
(5)步骤(4)所述沉淀物加50ml水复溶，加入1g甘露聚糖酶，在pH 6.8条件下40℃水解4小时，加入一定0.1M氢氧化钠溶液直到pH到达10终止反应；
(6)向步骤(5)所述反应液80℃加热10min，过滤所得滤液冻干成粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图2所示。
白芨寡糖(实施例2酶法制备获得的白芨寡糖)的应用
实施案例1白芨寡糖减少DSS诱导的结肠炎表现
(1)在本实施例中，为评价白芨寡糖对结肠炎小鼠的改善作用，具体实施步骤如下：
(2)取4周龄C57BL/6J小鼠，喂食正常标准饲料和无菌饮水，小鼠在新环境中适应1周。
(3)开始实验，用3.5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)给小鼠灌胃处理，同时给药2％白芨寡糖灌胃处理。处理时间为10天。
(4)处理期间检测饮水、饮食、体重、大便成色情况，。
(5)总结小鼠的疾病评分情况，进行组织学打分。
实验结果见附图3。
该结果显示，小鼠经DSS处理后，小鼠体重下降明显，采食量显著下调，而白芨寡糖可以增加肠炎小鼠的采食量，提高小鼠体重。根据组织学评分，发现DSS小鼠的疾病得分高出正常组10倍，而白芨寡糖处理DSS小鼠后，该指标有一定程度下调，可以增加结肠的长度。上述结果表明，白芨寡糖可促进结肠炎病情好转。
实施案例2白芨寡糖改善噁唑酮诱导的溃疡性结肠炎的保护作用
在本实施例中，为评价白芨寡糖及对溃疡性结肠炎的改善作用，具体实施步骤如下：
(1)取4周龄的C57BL/6J小鼠，喂食正常标准饲料和无菌饮水，小鼠在新环境中适应1周。
(2)开始实验，利用脱毛剂对小鼠进行局部脱毛，用3％噁唑酮(OXZ)溶液在脱毛局部涂抹，进行预敏处理5天。
(3)接着用1％噁唑酮溶液灌肠处理，同时给予1％的白芨寡糖灌胃处理。正常组用50％乙醇替代噁唑酮完成预敏和灌肠实验。
(4)药物处理8天后，处死小鼠，取其肠道组织，提取mRNA后用荧光定量PCR方法检测炎症因子IL-1β，TNFα，MCP-1等炎症因子的转录情况，检测血液中内毒素(LPS)的含量。
实验结果见附图4。结果显示，噁唑酮处理的结肠炎组的炎症因子大量表达，高于正常小鼠的数倍，而白芨寡糖处理结肠炎小鼠后可显著降低IL-1β、TNF-α及MCP-1表达，抑制血液中内毒素(LPS)的升高。但白芨寡糖本身对这些炎症因子和内毒素含量无明显影响。实施案例3白芨寡糖改善结肠炎小鼠的肠道细菌影响
在本实施例中，为评价白芨寡糖是改善结肠炎小鼠的菌群组成，具体步骤如下：
(1)取4周龄C57BL/6J小鼠，喂食正常标准饲料和无菌饮水，小鼠在新环境中适应1周。
(2)开始实验，用3％的葡聚糖硫酸钠(DSS)给小鼠灌胃处理，同时给药0.4％白芨寡糖灌胃处理，处理时间为10天。
(3)处理完成后，取小鼠的粪便，利用高通量测序对肠道细菌进行分析。
(4)通过chao1，observed species，PD whole tree，shannon等多种算法分析肠道菌群的多样性。
(5)检测分析不同菌属的丰度变化，包括有益菌乳酸杆菌、双歧杆菌、Akkermansia及有害菌包括脱硫弧菌、梭菌等。
实验结果见附图5和表1。结果显示，与对照组相比，DSS小鼠的菌群多样性显著降低，多种算法表明白芨寡糖处理的DSS小鼠的肠道细菌多样性明显提高。说明白芨寡糖可有效逆转结肠炎导致的菌群多样性降低。同时，表1提示DSS诱导的结肠炎小鼠的有益菌如Akkermansia、Lactobacillus(乳酸杆菌)、Bifidobacterium(双歧杆菌)等含量显著下调，条件致病菌如Desulfovibrio(脱硫弧菌)和Clostridium(梭菌属)的丰度明显升高，经过白芨寡糖处理的DSS小鼠，其有益菌含量得到大幅恢复，有害菌水平明显降低，说明白芨寡糖可有效改善肠道中有益菌及有害菌的比例，维持肠道菌群的稳态。
表1不同处理组小鼠肠道关键细菌含量差异
Figure BDA0001845916730000061
实施案例4白芨寡糖改善结肠炎小鼠的肠道微环境
在本实施例中，为评价白芨寡糖是否改善结肠炎小鼠的肠道微环境，具体步骤如下：
(1)取4周龄C57BL/6J小鼠，喂食正常标准饲料和无菌饮水，小鼠在新环境中适应1周。
(2)开始实验，用4％的葡聚糖硫酸钠(DSS)给小鼠灌胃处理，同时给药3％白芨寡糖灌胃处理，处理时间为7天。
(3)处理完成后，取小鼠的结肠组织，-80℃冻存。
(4)取出肠道组织，进行粘蛋白免疫荧光染色。
实验结果见附图6。免疫荧光检测表明，DSS小鼠肠道粘蛋白的减少，白芨寡糖正常小鼠的粘蛋白无明显影响，DSS小鼠经白芨寡糖处理后得到较好恢复。
白芨寡糖组合物的制剂制备
实施例1白芨寡糖组合物的胶囊剂
(1)取白芨寡糖10kg，加入3kg甘露寡糖；然后加入适量常规辅料混合均匀。
(2)冷冻干燥，粉碎，填充胶囊，分装，即得。
实施例2白芨寡糖组合物的水剂
(1)取白芨寡糖干粉15kg,加入300L水，然后加入1kg壳寡糖和1kg果寡糖，搅拌混匀；
(2)添加适量柠檬酸钠及柠檬酸、山梨酸钾等常规辅料对饮品进行矫味或防腐。
(3)搅拌均匀，60℃灭菌30分钟，按体积分装，即得。
实施例3白芨寡糖组合物的颗粒剂
(1)取白芨寡糖干粉8kg.加入1kg葡寡糖，100g氨基水杨酸粉末，添加适量常规塑形剂，溶于水中，搅拌混匀。
(2)将混合液置于65℃条件下进行喷雾干燥，形成固体颗粒，分装，即得。
显然，上述实施例仅是为清楚说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式给予穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.白芨寡糖在制备改善肠道微生态的制剂中的应用，所述的应用为白芨寡糖在制备改善肠道组织炎症、肠道屏障功能受损及肠道菌群紊乱制剂中的应用；所述肠道菌群紊乱为肠道菌群多样性相比于正常情况为降低状态；所述肠道屏障功能受损为肠道粘蛋白降低，或肠道紧密连接蛋白含量下降或肠道上层粘液受损；所述白芨寡糖的聚合度为2-20，分子量范围为200-5000 Da,所述白芨寡糖的制备方法包括如下步骤：
（1）白芨块茎经研磨成粉，白芨粉末与水按一定比例混合，在一定温度条件下浸润抽提一定时间；
（2）将步骤（1）抽提液过滤后获得的滤液，加入70%-90%乙醇，静置一定时间；
（3）步骤（2）所得的沉淀用水复溶，加入一定浓度的甘露糖糖苷类水解酶降解，加入碱性试剂或升温终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肠道组织炎症疾病包括非特异性肠炎、溃疡性肠炎、肠胃炎、慢性肠胃炎疾病。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述甘露糖糖苷类水解酶为甘露聚糖酶。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述白芨寡糖的制备方法为：
（1）白芨块茎经研磨成粉，加入10-60倍体积水进行混合，在10-100 ºC条件下浸润抽3-12 h，得到抽提液；
（2）步骤（1）所得抽提液过滤后获得滤液，加入70%-90%乙醇，静置8-24小时，所得沉淀即为白芨多糖；
（3）步骤（2）所得白芨多糖加水复溶成0.8%-5%的溶液，加入甘露糖糖苷类水解酶在25-50 ºC温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖；所述甘露糖糖苷类水解酶的用量为每克白芨多糖添加1-30mg甘露糖糖苷类水解酶；所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述白芨寡糖的制备方法为：
（1）白芨块茎经研磨成粉，加入20-40倍体积水进行混合，在20-90 ºC条件下浸润抽4-8h，得到抽提液；
（2）步骤（1）所得抽提液过滤后获得滤液，加入70%-80%乙醇，静置12-20 h，所得沉淀即为白芨多糖；
（3）步骤（2）所得白芨多糖加水复溶成1%-3%的溶液，加入甘露糖糖苷类水解酶在25-40ºC温度条件下降解，加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应，将产物冻干成粉；所述甘露糖糖苷类水解酶的用量为每克白芨多糖添加2-20 mg甘露糖糖苷类水解酶。
6.白芨寡糖组合物在制备改善肠道微生态的制剂中的应用，其特征在于：所述的白芨寡糖组合物包括白芨寡糖、益生元，和/或治疗肠炎的药物氨基水杨酸，所述的益生元为木寡糖、果寡糖、壳寡糖、甘露寡糖、葡寡糖中的一种或以上的组合；所述的应用为白芨寡糖组合物在制备改善肠道组织炎症、肠道屏障功能受损及肠道菌群紊乱制剂中的应用；所述肠道菌群紊乱为肠道菌群多样性相比于正常情况为降低状态；所述肠道屏障功能受损为肠道粘蛋白降低，或肠道紧密连接蛋白含量下降或肠道上层粘液受损，所述白芨寡糖的聚合度为2-20，分子量范围为200-5000 Da,所述白芨寡糖的制备方法包括如下步骤：
（1）白芨块茎经研磨成粉，白芨粉末与水按一定比例混合，在一定温度条件下浸润抽提一定时间；
（2）步骤（1）所得抽提液过滤后获得滤液，加入70%-90%乙醇，静置一定时间；
（3）步骤（2）所得沉淀用水复溶，加入一定浓度的甘露糖糖苷类水解酶降解，加入碱性试剂或升温终止反应，将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的制剂为水剂、粉剂、胶囊剂、冲剂。
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