CN109364085B - 白芨寡糖及其组合物在调节糖脂代谢紊乱中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白芨寡糖及其组合物在调节糖脂代谢紊乱中的应用。本发明的白芨寡糖聚合度为2‑20,分子量范围为200‑5000Da。本发明的白芨寡糖或其组合物具有抑制脂肪生成,降低血液葡萄糖浓度等作用,同时可调节糖脂代谢紊乱,对于因高热量饮食引起的葡萄糖不耐受及肥胖导致的糖尿病等均具有较好改善作用。可用于糖脂代谢紊乱及其肠道菌群紊乱的疾病防治。
Description
技术领域
本发明具体涉及白芨寡糖及其组合物在调节糖脂代谢紊乱中的应用。
背景技术
现代都市的生活日趋快速化,过多的高热量饮食和较少的耗能锻炼,使得城市居民患有肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、脂肪肝等糖脂代谢紊乱疾病人数逐年增加。根据国家卫计委统计数据,我国居民的膳食脂肪供能比高达30%,2015年公布数据显示,成年人的超重率大于30%,肥胖率高于12%,糖尿病的患病率高达9.7%,对国民的健康生活产生巨大影响。高脂高热饮食和缺乏锻炼是导致肥胖和糖尿病等糖脂代谢紊乱疾病发生的重要原因,肥胖又可以进一步导致糖尿病的发生。现有的口服糖尿病药物主要针对身体的不同器官:提高胰岛细胞的胰岛素分泌能力,增加肌肉、脂肪、肝脏组织的胰岛素敏感性,降低肝脏组织的糖异生过程,减少肠道的葡萄糖吸收功能,抑制肾脏对葡萄糖的重吸收,最终达到降低血糖的效果。这些药物靶点主要作用于内脏器官,在不同程度上存在药物依赖性和肝肾毒副作用,且均不能最终根治糖尿病。近年来肠道菌群研究方面的快速发展,提示肠道菌群紊乱是导致慢性代谢疾病的重要原因,靶向肠道菌群的治疗方式被认为是治疗糖脂代谢紊乱疾病极具潜力的发展方向。
白芨(Bletilla Striata),为兰科植物白及属植物的干燥块茎,主产于华南地区、长江一带。作为我国的传统珍稀名贵中药,该药味苦、甘、涩、微寒;归肺、肝、胃经;具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌的作用具有收敛止血、消肿生肌的功效。常用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂烧伤及、胃及十二指肠溃疡出血等疾病。现代生物活性研究表明白芨具有明显的抗肿瘤、抗氧化、抗菌、促进伤口愈合等作用。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了白芨寡糖及其组合物在制备调节糖脂代谢紊乱的制剂中的新应用。
白芨寡糖在制备调节糖脂代谢紊乱的制剂中的新应用。
具体地,所述白芨寡糖的聚合度为2-20,分子量范围为200-5000Da。
按上述方案,所述的白芨寡糖的制备方法,包括如下步骤:
(1)白芨块茎经研磨成粉,白芨粉末与水按一定比例混合,在一定温度条件下浸润抽提一
定时间;
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-90%乙醇,静置一定时间;
(3)步骤(2)所得沉淀用水复溶,加入一定浓度的强酸或多糖水解酶降解,加入碱性试剂或升温终止反应,将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
按上述方案,步骤(1)中白芨块茎经研磨成粉的粒径大于70目。
按上述方案,所述多糖水解酶包括葡萄糖糖苷类水解酶如葡聚糖酶、甘露糖糖苷类水解酶如甘露聚糖酶、半乳糖糖苷类水解酶等。
优选的,所述白芨寡糖可按如下步骤制备:
(1)白芨块茎经研磨成粉,加入10-60倍体积水进行混合,在10-100℃条件下浸润抽3-12 h,得到抽提液;
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-90%乙醇,静置8-24小时,所得沉淀即为白芨多糖;
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成0.8%-5%的溶液,加入浓度0.5-3M的强酸或多糖水解酶在25-50℃温度条件下降解,加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应,将产物冻干成粉即为白芨寡糖;所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加1-30mg多糖水解酶;所述强碱可为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等。
更优选的,所述白芨寡糖可按如下步骤制备:
(1)白芨块茎经研磨成粉,加入20-40倍体积水进行混合,在20-90℃条件下浸润抽4-8h,得到抽提液;
(2)步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-80%乙醇,静置12-20h,所得沉淀即为白芨多糖;
(3)步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成1%-3%的溶液,加入浓度1-2M的强酸或多糖水解酶在25-40℃温度条件下降解,加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应,将产物冻干成粉(即为白芨寡糖);所述多糖水解酶的用量为每克白芨多糖添加2-20mg多糖水解酶。
本发明还提供一种白芨寡糖组合物,包括白芨寡糖和其他功能寡糖,其中:所述的其他功能寡糖为果寡糖、木寡糖、半乳寡糖、壳寡糖等中的一种或以上的组合;所述白芨寡糖在组合物中的占比为1wt%-80wt%,其他功能寡糖占比2wt%-30wt%。
更进一步的,所述白芨寡糖组合物为水剂、散剂、冲剂、胶囊剂、泡腾剂等多种口服制剂,其可以按常规方法通过添加常规辅料制成。
本发明提供了上述含白芨寡糖的组合物在制备调节糖脂代谢紊乱的制剂中的新应用,所述组合物可由白芨寡糖和其他功能寡糖按比例配制而成。
优选的,所述糖脂代谢紊乱是指血糖、血脂、内脏脂肪、脂肪率偏离正常范围的非健康状态。所述非健康状态包括肥胖、糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝等疾病。
本发明的有益效果
本发明通过灌胃肥胖小鼠一定剂量的白芨寡糖,检测肥胖小鼠糖脂代谢变化和肠道菌群影响。实验结果表明,一定浓度的白芨寡糖能显著促进肥胖小鼠减重,减少白色脂肪含量,降低肝脏组织的脂肪堆积,促进葡萄糖代谢平衡,降低血糖,改善肠道菌群紊乱,增加有益菌含量,抑制有害菌增殖。不同组合物对糖脂代谢紊乱均有一定调控作用,可进一步开发用于糖脂代谢紊乱的疾病或其它情况。
附图说明
图1.酸水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图,结果表明:酸水解法制备的白芨寡糖的主要成分为三糖、四糖、五糖,其中:1三糖,2四糖,3五糖,经分析计算:三糖、四糖、五糖所含比例分别为40%,30%,20%,分子量200-1000;
图2.酶水解法制备的白芨寡糖的高效液相色谱图,酶水解法制备的白芨寡糖的的主要成分为三糖、四糖、五糖,其中:1三糖,2四糖,3五糖,经分析计算:三糖、四糖、五糖所含比例分别为28%,49%,20%,分子量200-1000;
图3.白芨寡糖对肥胖的调节作用(TG:甘油三酯,CHO:胆固醇,“*”或“**”代表模型组与对照组相比有统计差异,“#”或“#”代表处理组与模型组之间存在显著差异)。其中:小鼠的体重增加(A),脂肪细胞的大小萎缩(G),糖脂代谢平衡(B)。肠道菌群的多样性(C),乳酸杆菌(D)的含量、双歧杆菌(E)的含量、Akkermansia(F)的含量。图中各实验组从左到右的顺序为,CD,HFD,CD-BO,HFD-BO。
图4.白芨寡糖对糖尿病的调节作用(。“*”或“**”代表模型组与对照组相比有统计差异,“#”或“#”代表处理组与模型组之间存在显著差异)。其中:小鼠的增重(A),小鼠的空腹血糖(B),有益菌Akkermansia菌的含量(C),促炎菌脱硫弧菌的含量。其中图4(A)中: BWgain:代表体重增加情况Water:代表饮水变化Diet:代表饮食变化;图中各组从左到右的顺序为具体分组顺序为WT,DB,WT-BO,DB-BO。
图5.白芨寡糖对脂肪肝的调节作用(TG:甘油三酯,CHO:胆固醇,HDL:高密度脂蛋白, VLDL:极低密度脂蛋白,ALT:谷丙转氨酶,AST:谷草转氨酶,“*”或“**”代表模型组与对照组相比有统计差异,“#”或“#”代表处理组与模型组之间存在显著差异)。图中各组从左到右的顺序为,NCD,HFHS,NCD-BO,HFHS-BO。
图6.白芨寡糖组合物对糖尿病的调节作用(TG:甘油三酯,CHO:胆固醇,“*”或“**”代表模型组与对照组相比有统计差异,“#”或“#”代表处理组与模型组之间存在显著差异)。图中:体重(A)、采食饮水(B)的水平下降明显。小鼠血糖,甘油三酯和胆固醇含量(C),双歧杆菌含量(D),梭菌含量(E),图中各组顺序从左到右为,WT,DB,WT-BOC,DB- BOC。
具体实施方式
如下为本发明的实施例,其仅用作对本发明的解释而并非限制。
白芨寡糖的制备:
实施例1强酸法制备白芨寡糖
在本实施例中,提供一种强酸水解法制备白芨寡糖的方法,具体实施步骤如下:
(1)取25g白芨块茎研磨成80目粉末,加入500ml的水混匀,在80℃条件下溶解抽提8 h,得到抽提液;
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤,截留沉淀后获得滤出液,减压蒸馏成得到50ml的浓缩液;
(3)步骤(2)所述浓缩液加入150ml的95%乙醇,静置过夜12h。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤,截留后获得沉淀物;
(5)步骤(4)所述沉淀物复溶后,加入三氟乙酸(终浓度为1.0M)50℃进行水解2h,然后使用一定氨水中和其水解产物,直到pH到达6-8,减压浓缩后,冻干成白芨寡糖干粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图1所示。
实施例2酶解法制备白芨寡糖
在本实施例中,提供多糖水解酶制备白芨寡糖的一种方法,具体实施步骤如下:
(1)取40g白芨经块研磨料粉末,加入600ml的水混匀,在40℃条件下溶解抽提12h,得到抽提液;
(2)将步骤(1)所述抽提液进行过滤,截留沉淀后获得滤出液,减压蒸馏成得到60ml的浓缩液;
(3)步骤(2)所述浓缩液加入200ml的90%乙醇,静置过夜。
(4)将步骤(3)静置过夜后的浓缩液进行过滤,截留后获得沉淀物;
(5)步骤(4)所述沉淀物加50ml水复溶,加入1g甘露聚糖酶,在pH 6.8条件下40℃水解4小时,加入一定0.1M氢氧化钠溶液直到pH到达10终止反应;
(6)向步骤(5)所述反应液80℃加热10min,过滤所得滤液冻干成粉。所得白芨寡糖的高效液相色谱图如附图2所示。
白芨寡糖(实施例2的酶解法制备的白芨寡糖)及其组合物的应用
实施案例1白芨寡糖对肥胖的调节作用
在本实施例中,提供了白芨寡糖改善肥胖的应用,具体实施步骤如下:
(1)取C57BL/6J小鼠若干只,随机平均分配成四组(n>6):正常饮食组(CD),高脂饮食组(HFD),正常饮食联合白芨寡糖处理组(CD-BO),高脂饮食联合白芨寡糖处理组(HFD-BO)。
(2)白芨寡糖通过灌胃给药,给药浓度为100mg/kg/d,喂食和给药处理持续时间5个月。
(3)处理完成后,检测小鼠的体重、血脂变化,高通量测序分析肠道菌群组成。
(4)解剖小鼠,收集脂肪组织,进行免疫组织染色分析
实验结果见附图3。该结果显示,白芨寡糖可显著降低高脂饮食小鼠的体重增加(A),脂肪细胞的大小明显萎缩(G),促进糖脂代谢平衡(B)。肠道菌群的多样性大大提高(C),乳酸杆菌(D)、双歧杆菌(E)、Akkermansia(F)等有益菌细菌的比例明显提高。
实施案例2白芨寡糖对糖尿病的调节作用
在本实施例中,提供了白芨寡糖对糖尿病小鼠的改善作用,具体实施步骤如下:
(1)取C57BL/6J正常小鼠和db/db糖尿病小鼠若干只,分别分成4组(n>6):野生型组 (WT),糖尿病模型组(DB),野生型小鼠联合白芨寡糖处理组(WT-BO),糖尿病小鼠联合白芨寡糖处理组(DB-BO)。
(2)白芨寡糖通过饮水给药,给药浓度为200mg/kg/d,未给药组给予无菌水。
(3)处理时间2个月,期间检测小鼠的体重变化,饮水饮食变化。
(4)处理完成后检测小鼠空腹血糖,检测胰岛素敏感性。
(5)解剖时,收集肠道内容物,高通量测序检测肠道菌群组成。
实验结果见附图4。图4A结果显示图,白芨寡糖可有效减少糖尿病小鼠的增重(A),减少糖尿病小鼠多饮、多食的症状(A),降低小鼠的空腹血糖(B),提高胰岛素敏感性(B)。肠道菌群检测发现,白芨寡糖可大幅增加有益菌Akkermansia菌的含量(C),减少促炎菌脱硫弧菌的水平(D)。
上述表明:白芨寡糖可改善肠道菌群紊乱,改善糖脂代谢紊乱。具体表现为肠道菌群多样性恢复,促进有益菌和有害菌比例平衡。所述有益菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌、Akkermansia等,所述有害菌包括脱硫弧菌、梭菌等。
实施案例3白芨寡糖对脂肪肝的调节作用
在本实施例中,提供了白芨寡糖对小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用,具体实施步骤如下:
(1)取C57BL/6J正常小鼠若干只,分别分成4组(n>6):正常饮食组(NCD),高脂高糖饮食模型组(HFHS),正常饮食联合白芨寡糖处理组(NCD-BO),高脂高糖饮食联合白芨寡糖处理组(HFHS-BO)。
(2)白芨寡糖通过腹腔注射给药,给药浓度为250mg/kg/d,未给药组给予无菌生理盐水。
(3)处理时间5个月,期间检测小鼠血糖及体重变化。
(4)处理完成后,收集肝脏组织,进行组织染色和油红染色。
(5)收集小鼠的粪便,检测其肠道菌群变化。
实验结果见附图5。该结果显示,加药组小鼠体重增重明显降低(A),空腹血糖得到一定控制(B)。血液生化检测发现,白芨寡糖可有效降低血液中甘油三酯、胆固醇、极低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白浓度,降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平(C)。组织化学实验表明肝脏组织空泡较少,且肝细胞的肺泡样变性显著下调,炎性细胞浸润明显变少(D),油红染色表明,肝脏的脂滴堆积减少(E)。上述结果表明白芨寡糖可有效改善脂肪肝症状。
实施案例4白芨寡糖组合物对糖尿病的调节作用
在本实施例中,提供了白芨寡糖组合物对糖尿病的改善作用,具体步骤如下:
(1)将白芨寡糖和果寡糖3:1混合,制成带有白芨寡糖组合物的饲料,以下简称加药饲料。
(2)取C57BL/6J小鼠和对应db/db小鼠若干只,分别喂食正常标准饲料和加药饲料,分成4组(n>6):野生组(WT),糖尿病组(DB),野生加药处理组(WT-BOC),糖尿病加药处理组(DB-BOC)。
(3)处理时间为期3个月,小鼠自由选择饮食。
(4)处理期间,连续检测小鼠采食和饮水量的变化。
(5)实验完成后,检测小鼠血液中葡萄糖浓度、甘油三酯、胆固醇浓度。
(6)高通量测序分析小鼠肠道菌群变化。
实验结果见附图6。该结果显示,处理组小鼠的体重(A)、采食饮水(B)的水平下降明显。联合用药组的糖尿病小鼠血糖下降显著(C),甘油三酯和胆固醇也有较大幅度降低(C),肠道菌群分析发现,糖尿病小鼠的双歧杆菌水平明显减少(D),而梭菌显著上升(E),白芨寡糖组合物处理小鼠后,情况得到较大逆转,接近野生型小鼠。
Claims (6)
1.白芨寡糖在制备调节糖脂代谢紊乱的制剂中的应用,所述白芨寡糖的聚合度为2-5,分子量范围为200-1000 Da,制备方法包括如下步骤:
(1)白芨块茎经研磨成粉,白芨粉末与水按一定比例混合,在一定温度条件下浸润抽提一定时间;
(2)将步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-90%乙醇,静置一定时间;
(3)将步骤(2)所得沉淀用水复溶,加入甘露聚糖酶降解,加入碱性试剂或升温终止反应,将产物冻干成粉即为白芨寡糖;
所述糖脂代谢紊乱是指血糖、血脂、内脏脂肪、脂肪率偏离正常范围的非健康状态。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述白芨寡糖按如下步骤制备:
(1)白芨块茎经研磨成粉,加入10-60倍体积水进行混合,在10-100 ºC条件下浸润抽提3-12 h,得到抽提液;
(2)将步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-90%乙醇,静置8-24小时,所得沉淀即为白芨多糖;
(3)将步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成0.8%-5%的溶液,加入甘露聚糖酶在25-50 ºC温度条件下降解,加入氨水或其他强碱改变pH或高温加热使酶变性失活终止反应,将产物冻干成粉即为白芨寡糖;所述甘露聚糖酶的用量为每克白芨多糖添加1-30 mg甘露聚糖酶;所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述白芨寡糖按如下步骤制备:
(1)白芨块茎经研磨成粉,加入20-40倍体积水进行混合,在20-90 ºC条件下浸润抽4-8h,得到抽提液;
(2)将步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-80%乙醇,静置12-20 h,所得沉淀即为白芨多糖;
(3)将步骤(2)所得白芨多糖加水复溶成1%-3%的溶液,加入甘露聚糖酶在25-40 ºC温度条件下降解,加入氨水或其他强碱改变pH终止反应或高温加热使酶变性失活终止反应,将产物冻干成粉;所述甘露聚糖酶的用量为每克白芨多糖添加2-20 mg甘露聚糖酶。
4.一种白芨寡糖组合物,其特征在于:其包括白芨寡糖和其他功能寡糖,其中:所述的其他功能寡糖为果寡糖、木寡糖、半乳寡糖、壳寡糖中的一种或以上的组合;所述白芨寡糖在组合物中的占比为1wt%-80wt%,其他功能寡糖占比2 wt%-30wt%,所述白芨寡糖的聚合度为2-5,分子量范围为200-1000 Da,
制备方法包括如下步骤:
(1)白芨块茎经研磨成粉,白芨粉末与水按一定比例混合,在一定温度条件下浸润抽提一定时间;
(2)将步骤(1)所得抽提液过滤后获得滤液,加入70%-90%乙醇,静置一定时间;
(3)将步骤(2)所得沉淀用水复溶,加入甘露聚糖酶降解,加入碱性试剂或升温终止反应,将产物冻干成粉即为白芨寡糖。
5.根据权利要求4所述的白芨寡糖组合物,其特征在于:所述白芨寡糖组合物为水剂、散剂、冲剂、胶囊剂或泡腾剂。
6.权利要求4所述的白芨寡糖组合物在制备调节糖脂代谢紊乱的制剂中的应用,所述糖脂代谢紊乱是指血糖、血脂、内脏脂肪、脂肪率偏离正常范围的非健康状态。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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