CN110128561B - 一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法 - Google Patents

一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法，包括如下步骤：将龙须菜粉末加入水溶液中，搅拌提取，得龙须菜多糖提取液；浓缩，向浓缩液中加入乙醇，搅拌离心过滤得到沉淀物；对所得的沉淀物进行干燥、粉碎，得到龙须菜粗多糖；放入反应釜中，加水搅拌，反应，冷却，得到龙须菜粗多糖水解液；将龙须菜粗多糖水解液离心过滤，滤液过超滤膜纯化，得到透过液；将透过液旋蒸浓缩，加入乙醇静置，离心过滤，得到沉淀物；对沉淀物进行干燥，研磨，包装。本发明制备的龙须菜低聚糖能够促进益生菌生长增殖并产酸，具有益生活性，是一种功能性低聚糖。该方法简单、经济、环保，应用范围广。

Description

一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法
技术领域
本发明属于本发明属于食品制备技术领域，涉及一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法。
背景技术
益生元在调节机体肠道菌群方面发挥着重要的作用。大量研究数据、临床实验结果和报告表明益生元在预防和干预治疗肠易激综合征、糖尿病、肥胖症等免疫系统和慢性疾病方面均具有促进作用。
低聚糖通常是指含有2-10个糖苷键的，包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖是指能够促进人体内有益细菌增殖，抑制腐败菌生长，调节肠道菌群的生理功能的低聚糖，具有多种益生活性，是一种潜在益生元。目前，功能性低聚糖的生产通常是对富含糖类的原料进行酶解处理得到，由于酶的专一性导致其对原料中多糖的结构有选择性，并且能够制得的低聚糖种类较少。
据江苏省饮料协会统计，目前，中国功能性低聚糖的实际产能只有7万吨左右，世界市场需求量却高达135万吨。国内市场上的功能性聚合糖主要以低聚木糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖为主，占到低聚糖市场份额的70％左右。低聚木糖是由以木二糖、木三糖、木四糖为主要成分的混合物；主要以玉米芯、甘蔗渣、秸秆等为原料，经酶解、纳滤等先进工艺精制而成。目前低聚果糖的生产工艺主要有2种：第一种是以蔗糖为原料，通过β-果糖基转移酶或转化酶生成蔗果糖类，副产物蔗糖和葡萄糖较多；第二种是通过内切型菊粉酶水解菊粉，产品纯度较高。低聚异麦芽糖的生产大致有以下两种途径：第一种利用糖化酶(glucoamylase)的逆合作用，在高浓度的葡萄糖溶液中将之逆合生成异麦芽糖、麦芽糖等低聚糖，但该方法生产有产率低、产物复杂、生产周期长等缺点而难以工业化大量推广；第二种是以淀粉制得的高浓度葡萄糖浆为底物，通过α-葡萄糖转移酶催化发生葡萄糖基转移反应而得。其它低聚糖如水苏糖等生产主要是从自然界的植物中提取；低聚半乳糖工业化生产是利用牛乳中的乳糖为原料，通过β-半乳糖苷酶催化而成；低聚甘露糖的工业化生产也是通过酶解魔芋精粉得到。
龙须菜是一种红藻门、江篱属的海藻，广泛种植于广东、海南、山东等地的沿岸地带；其总糖含量很高，干重总糖含量约占60％。但由于其多糖结构复杂、支链占比较高，导致其粘度大、溶解性较差，很难被益生菌直接利用，这大大限制其在食品等领域的应用范围。通过一定手段将龙须菜粗多糖进行降解，获得聚合程度更小的低聚糖，能够扩大其在食品领域的应用范围，例如作为一种添加剂添加到酸奶、饮料、蛋糕制品等食品中。另外，经研究验证，龙须菜低聚糖作为一种能促进双歧杆菌增殖的功能性低聚糖，是一种良好的功能食品材料，具有广阔的市场应用前景。
发明内容
为了解决现有酶法技术无法酶解具有复杂多糖结构的原料的问题，本发明的目的是提供了一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现。
本发明提供了一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)将龙须菜洗净烘干，粉碎过筛备用，得龙须菜粉末；
(2)将龙须菜粉末加入水溶液中，加热提取，得龙须菜多糖提取液；
(3)将龙须菜多糖提取液过滤，得滤液1，浓缩，得浓缩液1，向浓缩液1中加入乙醇，搅拌，得悬浊液1，静置，将悬浊液1离心过滤得到沉淀物；
(4)对所得的沉淀物进行干燥、粉碎，得到龙须菜粗多糖；
(5)称取龙须菜粗多糖，放入反应釜中，加水搅拌，反应，冷却，得到龙须菜粗多糖水解液；
(6)将龙须菜粗多糖水解液离心过滤，得滤液2，滤液2过超滤膜纯化，得到透过液；
(7)将透过液旋蒸浓缩，得浓缩液2，向浓缩液2中加入乙醇，得悬浊液2，静置，将悬浊液2离心过滤，得到沉淀物；
(8)对沉淀物进行干燥，研磨，包装。
优选地，步骤(2)中所述龙须菜粉末与水溶液的比例为1：(30-80)g/ml。
优选地，步骤(2)中提取时水溶液的温度为60-100℃，提取时间为1-5h。
优选地，步骤(2)中所述提取为水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法，超声波辅助提取法、脉冲电场提取法和微波提取法中的一种；水提取法使用的水溶液为蒸馏水；酸提取法中使用的水溶液为酸溶液，所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、柠檬酸、高氯酸、磷酸或甲酸中的一种或一种以上；碱提法使用的水溶液为碱溶液，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化铵中的一种或一种以上；所述酶提法使用的水溶液为酶溶液，所述酶为淀粉酶、果胶酶、纤维素酶中的一种或一种以上。
优选地，所述酸溶液的pH为1-3；所述碱溶液的浓度为(0.01-1)mol/L，滤液1的pH为6-8。
优选地，步骤(3)中悬浊液1中乙醇的质量分数为50-95％；步骤(7)的悬浊液2中乙醇的质量分数为80-97％。
优选地，步骤(5)中龙须菜粗多糖与水的质量体积比为1:(0.1-10)g/ml；反应温度为160-220℃，反应时间为反应釜的原料中心温度达到反应温度后18-90min。
优选地，步骤(6)中的超滤膜的孔径为1000-5000Da。
优选地，滤液1和浓缩液1的体积比为(1.5-5):1；透过液和浓缩液2的体积比为(3-6):1。
优选地，步骤(6)和步骤(7)的先后顺序可以调换，即将龙须菜粗多糖水解液离心过滤，得滤液，向滤液中加入乙醇，得悬浊液，静置，将悬浊液离心过滤，得沉淀物，将沉淀物复溶后过超滤膜纯化，得透过液，将透过液旋蒸浓缩，干燥。
和现有技术相比，本发明具有以下的有益效果和优点：
本发明以粗多糖为原料，采用高温自水解的工艺对粗多糖的进行降解制备低聚糖。其制备过程简单环保，对原料中多糖结构没有要求，制备出的低聚糖结构可以为单一或者混合。经试验验证，益生菌能够在以制备的低聚糖为唯一碳源的培养基生长增殖并产酸，其生长速度和产酸量与在以葡萄糖为碳源的培养基相近。因此，该方法所制备的低聚糖可以在医学、食品、化工、材料等领域广泛应用，挖掘制备具有不同结构、活性的功能性低聚糖。
附图说明
图1a为龙须菜低聚糖A和粗多糖GLP1对双歧杆菌的活菌数的影响对比图；
图1b为龙须菜低聚糖A和粗多糖GLP1对双歧杆菌的pH值的影响对比图；
图2a为龙须菜低聚糖B和粗多糖GLP2对双歧杆菌的活菌数的影响对比图；
图2b为龙须菜低聚糖B和粗多糖GLP2对双歧杆菌的pH值的影响对比图；
图3a为龙须菜低聚糖C和粗多糖GLP3对双歧杆菌的活菌数的影响对比图；
图3b为龙须菜低聚糖C和粗多糖GLP3对双歧杆菌的pH值的影响对比图；
图4a为龙须菜低聚糖D和葡萄糖对双歧杆菌的菌液浓度的影响对比图；
图4b为龙须菜低聚糖D和葡萄糖对双歧杆菌的pH值的影响对比图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。
实施例1
本实施例以热水提取龙须菜粗多糖为原料用高温自水解方法制备龙须菜功能性低聚糖。
称取龙须菜粉末100g加入8L蒸馏水中，98℃搅拌提取2h，得到龙须菜多糖提取液。龙须菜多糖提取液用8层纱布过滤，滤液1旋蒸浓缩后，得浓缩液1，滤液1和浓缩液1的体积比为3:1，向浓缩液1中缓慢加入95乙醇并不断搅拌至乙醇质量分数为60％，得悬浊液1，4℃静置沉淀12h后6000r/min离心10min得沉淀；对所得的沉淀物进行冷冻干燥、粉粉碎后即龙须菜粗多糖GLP1，测定其平均分子量为1860kDa。
取1g龙须菜粗多糖GLP1，放入25mL反应釜中，加水6mL去离子水搅拌均匀，185℃反应50min后于冰浴中迅速冷却，得到龙须菜粗多糖水解液。将粗多糖水解液滤纸过滤，滤液2过3000Da超滤膜超滤纯化，得到透过液。将透过液旋蒸浓缩，得浓缩液2，透过液和浓缩液2的体积比为6:1，向浓缩液2中加入无水乙醇至乙醇终浓度为95％，4℃静置沉淀12h后8000r/min离心10min得沉淀物。对沉淀物进行干燥，研磨，包装即为龙须菜低聚糖A，测定其平均分子量为4565Da(28.09％),2587Da(24.66％)，1119Da(15.00％),504(32.25％)。
分别以热水提取龙须菜粗多糖GLP1、龙须菜低聚糖A为碳源，配置BBL液体培养基(其中总糖添加量为0.5％)，调节pH至6.8，121℃灭菌20min。培养基冷却后，在超净工作台分别接种1％(v/v)的短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌，置于三菱厌氧密封培养罐培养。在培养24h后测定培养基菌液活菌数和pH。最终结果如图1a和图1b所示。
从图1a和图1b可以看出，与粗多糖GLP1为碳源的培养液相比，双歧杆菌在以龙须菜低聚糖A为碳源的培养液中生长，活菌数更高，pH更低，表明龙须菜低聚糖A可以显著促进双歧杆菌的生长增殖，同时产生更多的酸，证明制备的龙须菜低聚糖A具有益生活性，是一种功能性低聚糖。同时也证明高温自水解是一种制备功能性低聚糖的有效方法之一。
实施例2
本实施例以酸提取龙须菜粗多糖为原料用高温自水解方法制备龙须菜功能性低聚糖。
称取100g龙须菜粉末，加入3L的pH为2.0的柠檬酸溶液，100℃下提取3h，取出，待冷却至室温后以6000r/min转速离心10min，取上清过滤，弃滤渣，滤液用NaOH调节pH至7.0，得滤液1，随后在60℃下减压浓缩，得浓缩液1，滤液1和浓缩液1的体积比为5:1。向浓缩液1缓慢加入无水乙醇至并不断搅伴至乙醇质量分数为85％，得悬浊液1，放置于4℃冰箱中，过夜。悬浊液1以6000r/min转速离心10min，过滤，收集滤渣，用少量水将滤渣复溶，采用截留分子量为1000Da的透析袋以蒸馏水透析72h，浓缩后真空冷冻干燥、粉碎后得粗多糖GLP2，测定其平均分子量为30.4kDa。
称取1g龙须菜粗多糖GLP2，放入25mL反应釜中，加水6mL去离子水搅拌均匀，175℃反应48min后于冰浴中迅速冷却，得到龙须菜粗多糖水解液。将龙须菜粗多糖水解液滤纸过滤，滤液2过2000Da超滤膜超滤纯化，得到透过液。将透过液旋蒸浓缩，得浓缩液2，透过液和浓缩液2的体积比为6:1，向浓缩液2中加入无水乙醇至乙醇终浓度为96％，得悬浊液2，4℃静置沉淀12h后8000r/min离心10min得沉淀物。对沉淀物进行干燥，研磨，包装即为龙须菜低聚糖B，测定其平均分子量为,2652Da(39.25％)，1066Da(26.74％),504(34.01％)。
分别以酸提取龙须菜粗多糖GLP2、龙须菜低聚糖B为碳源，配置BBL液体培养基(其中总糖添加量为0.5％)，调节pH至6.8，121℃灭菌20min。培养基冷却后，在超净工作台分别接种1％(v/v)的短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌，置于三菱厌氧密封培养罐培养。在培养24h后测定培养基菌液活菌数和pH。最终结果如图2a和图2b所示。
从图2a和图2b可以看出，与粗多糖GLP2为碳源的培养液相比，双歧杆菌在以龙须菜低聚糖B为碳源的培养液中生长，活菌数更高，pH更低，表明龙须菜低聚糖B可以显著促进双歧杆菌的生长增殖，同时产生更多的酸，证明制备的龙须菜低聚糖B具有益生活性，是一种功能性低聚糖。同时也证明高温自水解是一种制备功能性低聚糖的有效方法之一。
实施例3
本实施例以碱提取龙须菜粗多糖为原料用高温自水解方法制备龙须菜功能性低聚糖。
称取100g龙须菜粉末，加入5L的0.01M NaOH溶液，90℃下提取3h，取出，待冷却至室温后以6000r/min转速离心10min，取上清过滤，弃滤渣，滤液用HCl调节pH至7.0，得滤液1，将滤液1用HCl调节pH至7.0。随后在60℃下减压浓缩，得浓缩液1，滤液1和浓缩液1的体积比为5:1。向浓缩液1缓慢加入无水乙醇并不断搅拌至乙醇质量分数为80％，得悬浊液1，放置于4℃冰箱中，过夜。悬浊液1以6000r/min转速离心10min，过滤，收集滤渣，用少量水将滤渣复溶，采用截留分子量为1000Da的透析袋以蒸馏水透析72h，浓缩后真空冷冻干燥、粉碎后得粗多糖GLP3，测定其平均分子量为90.7kDa。
称取1g龙须菜粗多糖GLP3，放入25mL反应釜中，加水4mL去离子水搅拌均匀，180℃反应46min后于冰浴中迅速冷却，得到龙须菜粗多糖水解液。将龙须菜粗多糖水解液滤纸过滤，得滤液，向滤液加入无水乙醇至乙醇终浓度为96％，4℃静置沉淀12h后8000r/min离心10min得沉淀物。沉淀物水复溶过5000Da超滤膜超滤纯化，得到透过液。将透过液旋蒸浓缩，干燥，研磨，包装即为龙须菜低聚糖C，测定其平均分子量为4705Da(24.01％),2493Da(44.69％)，504(32.30％)。
分别以碱提取龙须菜粗多糖GLP3、龙须菜低聚糖C为碳源，配置BBL液体培养基(其中总糖添加量为0.5％)，调节pH至6.8，121℃灭菌20min。培养基冷却后，在超净工作台分别接种1％(v/v)的短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌，置于三菱厌氧密封培养罐培养。在培养24h后测定培养基菌液活菌数和pH。最终结果如图3a和图3b所示。
从图3a和图3b可以看出，与粗多糖GLP3为碳源的培养液相比，双歧杆菌在以龙须菜低聚糖C为碳源的培养液中生长，活菌数更高，pH更低，表明龙须菜低聚糖C可以显著促进双歧杆菌的生长增殖，同时产生更多的酸，证明制备的龙须菜低聚糖C具有益生活性，是一种功能性低聚糖。同时也证明高温自水解是一种制备功能性低聚糖的有效方法之一。
实施例4
本实施例将龙须菜低聚糖A、龙须菜低聚糖B和龙须菜低聚糖C以1：1：1的比例(w/w/w)混合得到龙须菜低聚糖D。
分别以葡萄糖、龙须菜低聚糖D为碳源，配置BBL液体培养基(其中总糖添加量为1％)，调节pH至6.8，121℃灭菌20min。培养基冷却后，在超净工作台接种1％(v/v)的短双歧杆菌，置于三菱厌氧密封培养罐培养。在培养48h后测定培养基菌液浓度和pH。最终结果如图4a和图4b所示。
从图4a和图4b可以看出，双歧杆菌可以在以龙须菜低聚糖D为碳源的培养液中生长增殖并产酸，其生长速度和产酸量与在以葡萄糖为碳源的培养基相近，表明益生菌对龙须菜低聚糖利用率达到单糖水平。证明制备的龙须菜低聚糖D具有益生活性，是一种功能性低聚糖。同时也证明高温自水解是一种制备功能性低聚糖的有效方法之一。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限定。凡本领域的技术人员利用本发明的技术方案对上述实施例作出的任何等同的变动、修饰或演变包括改变多糖来源等，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将龙须菜洗净烘干，粉碎过筛备用，得龙须菜粉末；
(2)将龙须菜粉末加入水溶液中，加热提取，得龙须菜多糖提取液；
(3)将龙须菜多糖提取液过滤，得滤液1，浓缩，得浓缩液1，向浓缩液1中加入乙醇，搅拌，得悬浊液1，静置，将悬浊液1离心过滤，得沉淀物；
(4)对所得的沉淀物进行干燥、粉碎，得到龙须菜粗多糖；
(5)称取龙须菜粗多糖，放入反应釜中，加水搅拌，反应，反应温度为160-220℃，反应时间为反应釜的原料中心温度达到反应温度后18-90min，冷却，得到龙须菜粗多糖水解液；
(6)将龙须菜粗多糖水解液离心过滤，得滤液2，滤液2过超滤膜纯化，得到透过液；
(7)将透过液旋蒸浓缩，得浓缩液2，向浓缩液2中加入乙醇，得悬浊液2，静置，将悬浊液2离心过滤，得到沉淀物；
(8)对沉淀物进行干燥，研磨，包装。
2.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述龙须菜粉末与水溶液的比例为1：(30-80)g/ml。
3.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中提取时水溶液的温度为60-100℃，提取时间为1-5h。
4.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取为水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法、超声波辅助提取法、脉冲电场提取法和微波提取法中的一种；水提取法使用的水溶液为蒸馏水；酸提取法中使用的水溶液为酸溶液，所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、柠檬酸、高氯酸、磷酸或甲酸中的一种以上；碱提法使用的水溶液为碱溶液，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化铵中的一种以上；所述酶提法使用的水溶液为酶溶液，所述酶为淀粉酶、果胶酶、纤维素酶中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，所述酸溶液的pH为1-3；所述碱溶液的浓度为(0.01-1)mol/L，滤液1的pH为6-8。
6.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中悬浊液1中乙醇的质量分数为50-95％；步骤(7)的悬浊液2中乙醇的质量分数为80-97％。
7.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中龙须菜粗多糖与水的质量体积比为1:(0.1-10)g/ml。
8.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(6)中的超滤膜截留的分子量NMWCO为1000-5000Da。
9.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，滤液1和浓缩液1的体积比为(1.5-5):1；透过液和浓缩液2的体积比为(3-6):1。
10.根据权利要求1所述的龙须菜功能性低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(6)和步骤(7)的先后顺序相互调换，即将龙须菜粗多糖水解液离心过滤，得滤液，向滤液中加入乙醇，得悬浊液，静置，将悬浊液离心过滤，得沉淀物，将沉淀物复溶后过超滤膜纯化，得透过液，将透过液旋蒸浓缩，干燥。
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