CN1435421A

CN1435421A - 卡拉胶低聚糖的制备方法

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Publication number: CN1435421A
Application number: CN 02135275
Authority: CN
Inventors: 王长云; 顾谦群; 管华诗
Original assignee: Ocean University of Oingdao
Current assignee: Ocean University of Oingdao
Priority date: 2002-07-22
Filing date: 2002-07-22
Publication date: 2003-08-13
Anticipated expiration: 2022-07-22
Also published as: CN1194981C

Abstract

一种卡拉胶低聚糖的制备方法，其特征是先将卡拉胶经KCl分级法纯化，干燥，加水配成水溶胶，在搅拌下加入稀硫酸或稀盐酸，加热回流水解，冷却至室温终止水解，调pH值至中性，过滤，脱盐和初分级，浓缩，干燥，继用凝胶柱层析分离纯化。用本发明的方法制取的卡拉胶低聚糖，分子量低，溶解度高，可增加其生物利用度，增强抗病毒、抗癌、抗菌等生物活性和药理活性。本方法获得了不同分子量(聚合度)的系列卡拉胶低聚糖，且其基本结构未发生改变，为卡拉胶构效关系研究提供了基础资料，为抗病毒、抗癌、抗菌等多糖药物及保健品的筛选、研制、开发和生产提供了候选化合物和原料药。

Description

卡拉胶低聚糖的制备方法

本发明涉及一种卡拉胶低聚糖的制备方法。

卡拉胶(carrageenan)是一类硫酸多糖，包括κ-，λ-，μ-，ι-，ν-，ξ-，π-，β-，γ-，δ-，α-，ω-，θ-卡拉胶等类型，具有多种生物活性，特别是作为一类硫酸半乳聚糖，其显著的抗病毒活性，尤其是抗艾滋病毒(HIV)活性，已引起医药界广泛关注。作为一种聚阴离子，卡拉胶分子量大小及硫酸基含量对其抗病毒等生物活性和药理活性产生影响。然而，目前的各类卡拉胶因分子量过大，其应用受到了限制。众所周知，多糖的生物活性或药理活性与其初级结构、高级结构、分子量、溶解度等有关。因此多糖经降解成为低聚糖是多糖构效关系研究的重要手段，也是发现和研制糖类药物的重要途径。

本发明的目的是提供一种卡拉胶低聚糖的制备方法，它能获得分子量低、溶解度高的不同分子量的系列卡拉胶低聚糖，为抗病毒、抗癌、抗菌等多糖药物及保健品的筛选、研制和开发提供候选化合物和原料药。能满足现有技术的上述需求。

一种卡拉胶低聚糖的制备方法，其特征是先将卡拉胶经KCl分级法纯化，干燥，加水配成水溶胶，在搅拌下加入稀硫酸或稀盐酸，加热回流水解，冷却至室温终止水解，调pH值至中性，过滤，脱盐和初分级，浓缩，干燥，继用凝胶柱层析分离纯化。

用本发明的方法制取的卡拉胶低聚糖，分子量低，溶解度高，可增加其生物利用度，增强抗病毒、抗癌、抗菌等生物活性和药理活性。未经降解的卡拉胶与血纤维蛋白形成不溶性复合物；而其降解物与血纤维蛋白则形成可溶性复合物，毒性比未降解的明显减小。本方法获得了不同分子量(聚合度)的系列卡拉胶低聚糖，且其基本结构未发生改变，为卡拉胶构效关系研究提供了基础资料，为抗病毒、抗癌、抗菌等多糖药物及保健品的筛选、研制、开发和生产提供了候选化合物和原料药。

下面通过实施例说明本发明。

本实施例所用的卡拉胶为κ-卡拉胶，为烟台海藻工业公司产品。κ-卡拉胶为多种卡拉胶类型中的一种，由β-D-半乳糖-4-SO₄ ^-(β-D-G-4-SO₄ ^-)和α-D-3，6-内醚半乳糖(α-D-3，6-AG)通过1→3和1→4糖苷键形成线型链状分子。实验时，先将κ-卡拉胶经KCl分级法纯化，干燥，加水于80-100℃下配成重量百分浓度为1-7的水溶胶。在搅拌下加入稀硫酸或稀盐酸(两者的浓度均0.1-0.8mol·L^-1)，50-100℃回流水解1-6h。用冷水浴冷却至室温终止水解，调pH值至中性，过滤。滤液用超滤法脱盐，然后用超滤法初分级(超滤条件：超滤装置为Millipore ProFlux M12，分子量范围分别为Mw＜1,000；1,000＜Mw＜3,000；3,000＜Mw＜5,000；5,000＜Mw＜10,000；Mw＞10,000)，浓缩，冷冻干燥。继用凝胶柱层析分离纯化：层析柱SephadexG-100，φ3.4×100cm，Mw＞10,000；层析柱Sephadex G-50，φ2.6×100cm，5,000＜Mw＜10,000；层析柱Sephadex G-25，φ1.6×80cm，Mw＜5,000；Sephadex G-15，φ1.6×80cm，Mw＜3,000(洗脱液均为蒸馏水)；层析柱Bio-gel P-6，φ1.6×80cm，1,000＜Mw＜6,000(洗脱液为0.25M NH₄HCO₃)，0.2％蓝色葡聚糖-2000作内标，以改进的苯酚-硫酸比色法及全自动层析系统UV214nm检测，收集样品级分，浓缩，冻干。

用明胶比浊法测定制得的低聚糖的硫酸根含量；用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定各低聚糖的分子量(色谱柱TSK-GEL G2000PW，300×7.5i.d.mm；流动相为重蒸水；用示差折光检测器检测；以葡聚糖作标准品，标准曲线方程：lgMw＝-0.4639t_R+7.2721，R²＝0.9971)；平均聚合度计算公式：Mw＝383DP+23DP+17，式中，Mw：平均分子量；DP：平均聚合度；383：卡拉胶二糖单位分子量；23：卡拉胶钠盐中Na的原子量；17相当于端基-OH的原子量；红外光谱IR：KBr压片，Nicolet 510P FTIR傅立叶变换红外光谱仪测定；核磁共振波谱¹H-NMR和¹³C-NMR：Bruker DPX-400核磁共振波谱仪测定，溶剂D₂O。

κ-卡拉胶在稀硫酸溶液中于100℃下水解3h时，随酸浓度增加其主要级分的平均分子量减小；在0.1mol·L^-1硫酸100℃下水解，随时间延长，主要级分平均分子量下降，至4h时，平均分子量下降缓慢。用0.1-0.5mol·L^-1稀硫酸水解1-6h，分离纯化获得6个卡拉胶低聚糖组分SD-1，SD-2，SD-3，SD-4，SD-5和SD-6(表1)。类似地，用盐酸水解法获得2个卡拉胶低聚糖组分HD-1和HD＝2(表1)。

酸水解法获得的8个卡拉胶低聚糖组分为白色粉末，易溶于水，水溶液pH6.30-6.85，澄清，无色至微黄，比旋度与原卡拉胶的相近(表1)；HPGPC峰形对称单一，其分子量为窄分布。8个组分的平均分子量在1,750-11,500之间，平均聚合度DP4-28(表1)。用硫酸水解法获得的卡拉胶低聚糖含硫酸基量与原卡拉胶的相当，而用盐酸水解的含硫酸基量则低于原卡拉胶的(表1)。实验还表明，HD-1，SD-1和SD-2只形成微弱强度的凝胶，其他组分则不能形成凝胶。因此，制备获得的卡拉胶低聚糖分子间的缔合不稳定或很弱，难以或不能形成网状结构。

表1κ-卡拉胶酸降解产物卡拉胶低聚糖制备条件和理化性质级分水解条件 Mw^a DP^b [α]_D ²⁰ SO₄％κ-卡拉胶 +62.8 21.6HD-1 0.1mol·L^-1，HCl，100℃，3h 11,500 28 +60.3 16.28SD-1 0.1mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，3h 10,500 26 +60.6 21.02SD-2 0.2mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，3h 8,200 20 +59.6 21.08SD-3 0.1mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，4h 7,500 18 +60.6 22.10HD-2 0.2mol·L^-1，HCl，100℃，3h 4,100 10 +65.0 12.53SD-4 0.2mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，3h 3,400 8 +58.2 23.01SD-5 0.2mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，4h 2,500 6 +58.8 23.73SD-6 0.5mol·L^-1，H₂SO₄，100℃，5h 1,730 4 +59.7 22.00a：Mw，平均分子量；b：DP，平均聚合度。

表2κ-卡拉胶酸降解产物卡拉胶低聚糖红外光谱数据(cm^-1)级分 3700-3100 3000-2800 1370-1210 1150-1000 940-920 850-840 850/2920^aκ-卡拉胶 3416.4 2919.0 1261.3 1070.0 929.7 850.1 2.27HD-1 3418.2 2926.1 1261.2 1068.8 928.0 845.9 1.12

2951.3SD-1 3422.5 1257.4 1046.3 920.8 848.8 2.32

2923.0SD-2 3415.2 2950.2 1262.4 1058.9 920.8 849.7 2.02

2956.7SD-3 3421.8 1257.0 1045.9 921.9 848.9 2.46

2911.6HD-2 3410.9 2928.3 1260.7 1053.3 927.1 848.4 1.02

2933.1SD-4 3421.3 1255.7 1046.6 922.2 849.0 2.46

2896.3SD-5 3420.5 2948.3 1256.3 1138.1 930.1 850.8 2.58SD-6 3400.1 2908.1 1258.0 1049.7 919.9 848.2 2.41a：官能团比率。表3κ-卡拉胶酸降解产物卡拉胶低聚糖HD-1，SD-1，SD-3和SD-4核

磁共振光谱数据(¹³C-NMR，D₂O，100MHz，δ，ppm)^a

(1→3)-β-D-Gal (1→4)-α-D-Gal

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C1 C2 C3 C4 C5 C6κ-卡拉 105.0 72.2 81.3 76.4 77.3 63.8 97.5 72.2 81.7 80.8 79.2 71.9胶HD-1 103.7 69.9 78.8 74.2 75.4 61.7 95.1 69.9 79.6 78.6 77.1 70.0SD-1 103.9 70.2 79.0 73.6 75.4 61.8 96.0 70.2 79.7 77.2 76.2 70.3SD-3 105.5 71.6 79.0 74.3 75.5 63.6 96.9 71.6 80.4 78.2 77.1 71.6SD-4 105.6 71.1 79.3 74.6 75.4 63.6 98.1 71.1 80.2 79.0 76.9 71.1

用本发明的硫酸水解方法获得的卡拉胶低聚糖SD-1至SD-6的IR图谱中，1370-1210cm^-1处代表总硫酸基的特征吸收(S＝O伸缩振动)，940-920cm^-1处代表α-D-3，6-AG特征吸收，850-840cm^-1处代表β-D-G的C₄-SO₄特征吸收(轴向C-O-S伸缩振动)与原卡拉胶的基本相同(表2)，其峰形、峰位和强度也相当，特别是表征β-D-G的C₄-SO₄相对含量的吸收强度比值(850/2920)也与原卡拉胶的相近(表2)，这与化学分析结果相仿(表1)。可见，硫酸只对卡拉胶具有降解作用，对其结构未见破坏作用。SD-1至SD-6的¹H-NMR与原卡拉胶的基本吻合(数据未列出)，SD-1，SD-3，SD-4的¹³C-NMR都显示出κ-卡拉胶重复二糖单位的12个碳共振信号，与原卡拉胶各碳原子的化学移值相近(表3)，表明硫酸水解时，随着酸浓度增加，水解程度加强，获得的产物分子量减小。这与凝胶层析分离和分子量测定结果一致。

在本发明中，盐酸水解法获得的卡拉胶低聚糖HD-1和HD-2的IR图谱与原卡拉胶的峰形和峰位相仿，表明用盐酸对卡拉胶进行降解时，对其主链结构未产生破坏作用。但HD-1和HD-2在850cm^-1处吸收较弱，吸收强度比值850/2920分别为1.12和1.02，比原卡拉胶的吸收强度比值2.27明显地低(表2)，表明其C₄-SO₄被部分脱去，这与化学分析结果相吻合(表1)。因此，盐酸水解时，除对卡拉胶产生降解作用，还有脱硫酸基作用。HD-1的¹³C-NMR谱中，12个碳共振信号也与原卡拉胶的相近，表明其骨架结构未受影响。

在多糖降解过程中，若水解条件过于强烈，则降解物结构可能遭到破坏。本方法获得了不同分子量(聚合度)的卡拉胶低聚糖，且其基本结构未发生改变，其初级结构仍为β-D-G-4-SO₄ ^-和α-D-3，6-AG通过1→3和1→4糖苷键形成线型链状分子。

本实施例所用的卡拉胶为κ-卡拉胶，所用的制备方法和条件也适于所有卡拉胶，其中包括λ-，μ-，ι-，ν-，ξ-，π-，β-，γ-，δ-，α-，ω-，θ-卡拉胶。

Claims

1、一种卡拉胶低聚糖的制备方法，其特征是先将卡拉胶经KCl分级法纯化，干燥，加水配成水溶胶，在搅拌下加入稀硫酸或稀盐酸加热回流水解，冷却至室温终止水解，调pH值至中性，过滤，脱盐并初分级，浓缩，干燥，继用凝胶柱层析分离纯化。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的硫酸和盐酸的浓度为0.1-0.8mol·L^-1。

3、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的酸水解温度为50-100℃。

4、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的酸水解时间为1-8h。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的卡拉胶为κ-，λ-，μ-，ι-，ν-，ξ-，π-，β-，γ-，δ-，α-，ω-，θ-卡拉胶。

6、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的脱盐和初分级采用超滤法。