CN113181236B - 一种夏枯草抗hsv活性部位及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种夏枯草抗HSV活性部位，是由夏枯草通过水提醇沉和盐析法获得的。本发明还提供了上述夏枯草抗HSV活性部位的制备方法，同时提供了上述夏枯草抗HSV活性部位在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。本发明提供的夏枯草抗HSV活性部位具有显著的体内外抗HSV作用，其体外抗HSV的活性较水提物增强了三倍，且对ACV耐药的HSV临床株及耐药株也有同样良好且稳定的抑制作用。同时，对治疗HSV‑1及HSV‑2感染引起的皮肤及生殖器疱疹均有良好的疗效。

Description

一种夏枯草抗HSV活性部位及其制备方法和应用
技术领域
本发明医药技术领域，涉及一种夏枯草，具体来说是一种夏枯草抗HSV活性部位及其制备方法和应用。
背景技术
单纯疱疹病毒(HSV)分为I型(HSV-1)和II型(HSV-2)，病毒经口腔及生殖器等侵入体内，长期潜伏和反复发作，其发病率呈上升趋势，会引发多种疾病及严重的并发症。临床治疗药物主要为阿昔洛韦(ACV)等核苷类似物，对于严重及频繁复发的病例，需大剂量长期给药，易产生耐药。因此，迫切需要研发与阿昔洛韦结构及作用机制不同的抗HSV药物。
申请人团队前期建立了中药抗病毒筛选平台，并对具有清热解毒功效及文献报道有抗病毒活性的中药进行系统的筛选，发现夏枯草水提醇沉部位及部分多糖类成分具有显著抗HSV作用。
夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，功能清火、明目、散结、消肿。用于目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等，具有悠久的临床用药史。清·《验方新编》记载对口疮，用新鲜夏枯草入盐，津唾少许，捣烂敷患处，已成留头，未成满敷，三次即愈。
中国发明专利申请(201410561972.8)公开了一种夏枯草提取物，所述夏枯草提取物用如下方法制得：将夏枯草果穗加水10-22倍量，加热回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，滤液过0.45μm水膜微滤，收集过0.45μm水膜微滤后的滤液，将所收集的过0.45μm水膜微滤后的滤液再过截留分子量为3-500kDa的超滤膜，收集未透过超滤膜的药液，浓缩，干燥。该夏枯草水提物抗疱疹病毒活性 IC50为93.11±23.46μg/mL；经超滤纯化后的多糖提取物IC50为77.56±4.19μg/mL。
中国发明专利申请(201610066061.7)公开了一种夏枯草均一多糖，所述均一多糖的总糖含量为53％-65％；所述均一多糖的分子量为23.4kDa-41.7kDa；且所述均一多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，该均一多糖IC50为84.84±1.94μg/mL。
鉴于现有技术的状况，需要寻找具有更强抗疱疹病毒活性、活性部位更集中、制备工艺更安全、高效，更适宜于工业化生产的夏枯草抗HSV提取物组分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效部位集中、提取工艺简便、抗HSV活性强的夏枯草抗HSV活性部位及其制备方法和应用。
本发明提供了一种夏枯草抗HSV活性部位，通过如下的方法制备而成：取夏枯草果穗或其粉末，然后加入夏枯草果穗或其粉末体积10-22倍量的水，加热至80-100℃，回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，再加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置 6-24小时后离心，得到的沉淀用10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀干燥后即得水提醇沉样品，然后将制得的水提醇沉样品溶于纯水，加入中性盐，使溶液饱和度达70-100％后，析出沉淀，离心收集沉淀后再复溶于水，置透析袋内透析除盐后，收集透析袋内溶液，浓缩干燥而得夏枯草抗HSV活性部位。
进一步的，加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇至乙醇浓度为30％v/v 进行沉淀，得到的沉淀用30％v/v的乙醇洗涤至少两次。
进一步的，向水提醇沉制得样品水溶液中加入中性盐硫酸铵固体，使其溶解在样品水溶液中，直至样品水溶液硫酸铵的饱和度达70-100％。
进一步的，该活性部位为一类水溶性的多组分大分子物质，分子量范围在3.5kDa-25.0kDa之间，以质量百分比计，所述活性部位包括35.0-55.0％的总糖， 10.0-30.0％的蛋白质，15.0-30.0％的多酚类成分。
本发明还提供了一种夏枯草抗HSV活性部位的制备方法，取夏枯草果穗或其粉末，然后加入夏枯草果穗或其粉末体积10-22倍量的水，加热至80-100℃，回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，再加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀干燥后即得水提醇沉样品，然后将制得的水提醇沉样品溶于纯水，加入中性盐，使溶液饱和度达 70-100％后，析出沉淀，离心收集沉淀后再复溶于水，置透析袋内透析除盐后，收集透析袋内溶液，浓缩干燥而得夏枯草抗HSV活性部位。
进一步的，向水提醇沉制得样品水溶液中加入中性盐硫酸铵固体，使其溶解在样品水溶液中，直至样品水溶液硫酸铵的饱和度达70-100％。
本发明还提供了一种药物组合物，含有上述的一种夏枯草抗HSV活性部位。
进一步的，含有药学上可以接受的辅料。
本发明还提供了上述的一种夏枯草抗HSV活性部位在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。
本发明的一种夏枯草抗HSV活性部位，其抗HSV体外活性较夏枯草其它提取部位有显著提高，对HSV-1及HSV-2的EC50分别为23.25±2.12μg/mL和 30.83±0.49μg/mL，选择性指数SI分别大于21.51和16.22，其抗HSV活性较夏枯草水提物增强了3倍。其对阿昔洛韦(ACV)耐药的HSV病毒株也有与标准株同样的抑制作用，抗HSV作用稳定，可以用于治疗ACV耐药的HSV病毒株引起的疱疹病毒感染。该活性部位中，单糖组成以木糖和半乳糖醛酸含量较高，氨基酸组成以谷氨酸和天冬氨酸含量较高，多酚类成分为木脂素单元组成的聚合体。该活性部位不含游离蛋白质及游离氨基酸，其中的蛋白质类成分不能被 savage法除去。
本发明利用多种化学成分分离方法和现代光谱学分析手段对该活性部位进行化学表征。通过体外CCK-8比色法及体内抗HSV表明：本发明提供的夏枯草抗HSV活性部位具有显著的体内外抗HSV作用，其体外抗HSV的活性较水提物增强了三倍，且对ACV耐药的HSV临床株及耐药株也有同样良好且稳定的抑制作用。同时，对治疗HSV-1及HSV-2感染引起的皮肤及生殖器疱疹均有良好的疗效。
《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》一文中公开了一种夏枯草水溶性多糖的提取方法：采用水提醇沉法从夏枯草果穗中得到夏枯草多糖，将所得多糖复溶于水，依次在乙醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％和 70％的条件下分级醇沉多糖，得到PVLP-1、PVLP-2、PVLP-3、PVLP-4、PVLP-5 和PVLP-6等六个多糖组分。测定各组分的糖含量、糖醛酸含量及蛋白质含量等基本理化指标，并用气相色谱法测定它们的单糖组成，同时对其进行紫外和红外光谱扫描考察其光谱性质。
本发明与现有的技术相比，其技术进步是显著的。本发明公开的夏枯草抗 HSV活性部位，抗HSV活性成分更集中，针对性更强，成药性更高，成分组成更明确；另外，在工艺上，该方法不涉及有毒试剂，更经济高效，适于工业化生产。与《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》一文中公开的制备方法相比，本发明涉及的30％醇沉部分在加入相应浓度乙醇沉淀后，再用同等浓度的乙醇对沉淀进行洗涤，可减少因为醇沉不完全引入其他醇沉浓度的沉淀。凝胶色谱显示，采取该方法处理得到的各分级沉淀部分分子量分布更集中；并且本发明在30％醇沉的基础上，采用盐析法进一步缩小了有效部位的范围，得到活性更强的PVG。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
附图说明
图1显示了夏枯草抗HSV活性部位。
图2显示了夏枯草抗HSV活性部位的紫外光谱扫描图(190-800nm)。
图3显示了夏枯草抗HSV活性部位的红外光谱扫描图。
图4显示了夏枯草抗HSV活性部位的HPGPC-RID色谱。
图5显示了夏枯草抗HSV活性部位中单糖组成的HPLC色谱图。
图6显示了夏枯草抗HSV活性部位中氨基酸的色谱图。
图7显示了夏枯草抗HSV活性部位中多酚部分的UPLC分析图谱。
图8显示了夏枯草抗HSV活性部位中多酚部分的UPLC-TOF-MS ES+总离子图。
图9显示了夏枯草抗HSV活性部位中多酚类成分的离子碎片信息及成分推测。
具体实施方式
实施例1
本发明的技术方案按照下列步骤进行：
一种夏枯草抗HSV活性部位的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)取夏枯草果穗或其粉末，加水10-22倍量体积，加热至80-100℃回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至适量；
(2)向上述浓缩液中加入乙醇至乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后，离心，然后采用浓度为10-50％v/v的乙醇洗涤沉淀至少两次后，收集沉淀干燥，编号PVE30。
(3)将PVE30溶于适量纯水中，向其的水溶液中加入适量中性盐硫酸铵固体，使溶液中盐的饱和度达70-100％，析出沉淀后离心，取沉淀复溶于纯水，置于透析袋内透析除盐后，将透析袋内溶液浓缩干燥即得，编号PVG。
下述实验，均采用本实施例获得的夏枯草抗HSV活性部位(PVG)进行。
实施例2
夏枯草抗HSV活性部位抗HSV-1/KOS、HSV-2/G标准株的活性与夏枯草水溶性多糖的对比
方法：
采用本发明申请的方法制备PVG。根据《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》一文中的方法制备夏枯草水溶性多糖，具体如下：采用水提醇沉法从夏枯草果穗中得到夏枯草多糖，将所得多糖复溶于水，依次在乙醇体积分数为20％、30％、40％、50％、60％和70％的条件下分级醇沉多糖，得到PVLP-1、 PVLP-2、PVLP-3、PVLP-4、PVLP-5和PVLP-6等六个多糖组分。选取其中30％醇沉部分PVLP-2进行对比分析。
采用CCK-8法检测夏枯草抗HSV活性部位及水提物对标准病毒株 HSV-1/KOS及HSV-2/G的体外抑制作用。
将Vero细胞计数后，以每孔两万个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，放置于恒温37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中，待细胞长满单层后，弃去上层培养液，加入含100×TCID50的病毒原液，吸附一小时后，加入不同浓度的夏枯草水提物及夏枯草抗HSV活性部位样品(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5 μg/mL)，每个浓度3复孔，200μL/孔，于37℃、5％CO2培养3天，3天后加入CCK-8，10μL/孔，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，按公式1计算出夏枯草抗HSV活性部位对病毒抑制，细胞存活率。
Figure GDA0003788601270000051
结果：夏枯草抗HSV活性部位对HSV-1及HSV-2的EC50分别为 23.25±2.12μg/mL和30.83±0.49μg/mL，选择性指数SI分别大于21.51和16.22，其抗HSV活性较夏枯草水提物(中国发明专利申请(201410561972.8)增强约三倍，且二者具有统计学差异(见表1)。
表1夏枯草水溶性多糖与PVG的抗HSV活性对比
Figure GDA0003788601270000061
用统计学软件graphpad prism进行t-test分析，P<0.05表示差异有统计学意义。(*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001)
据此我们提出一种具有更强活性的夏枯草抗HSV活性部位制备方法：取夏枯草果穗或其粉末，然后加入夏枯草果穗或其粉末体积10-22倍量的水，加热至 80-100℃，回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，再加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置 6-24小时后离心，得到的沉淀用30％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀部分，沉淀部分干燥后即得水提醇沉样品，然后将制得的水提醇沉样品溶于纯水，加入中性盐，使溶液饱和度达70-100％后，析出沉淀，再复溶于水，置透析袋内透析除盐后，收集透析袋内溶液，浓缩干燥而得夏枯草抗HSV活性部位。
实施例3
夏枯草抗HSV活性部位体外抗HSV耐药株的活性研究
方法：CCK-8法检测夏枯草抗HSV活性部位在体外对耐药株HSV-1/Blue 以及临床耐药株HSV-1/106与HSV-1/153的抑制作用。
计数Vero细胞，以2万/孔接种于96孔板，静置于恒温37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中，使Vero细胞长满单层后，除去上层培养液，分别接种上述各病毒原液1000倍的稀释液0.085mL(约含100×TCID50)，吸附一小时后，和不同浓度的夏枯草样品(100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)混合加入Vero细胞中，200μL/孔，各浓度3个复孔，同时设正常Vero细胞对照组、 HSV病毒对照组、ACV阳性药物对照组。静置于恒温37℃、CO2体积浓度为 5％的培养箱，3天后加入CCK-8，10μL/孔，使用酶标仪在450nm处测定吸光度，按公式1计算出夏枯草抗HSV活性部位对病毒抑制，细胞存活率。
结果：如表2所示，在两株临床株HSV-1/106、HSV-1/153和一株耐药株 HSV-1/Blue上，ACV的给药浓度需要提高约300倍后，才能发挥与抗HSV-1/KOS 标准株类似的抑制作用；故与ACV相比，夏枯草抗HSV活性部位抗ACV耐药的HSV-1感染作用比较稳定，抗耐药株的活性与标准株类似。
表2夏枯草抗HSV活性部位的体外抗HSV作用
Figure GDA0003788601270000071
实施例4
夏枯草抗HSV活性部位的化学表征
1.理化性质测定，包括色泽观察及溶解性测定：
结果：经观察和检测分析，夏枯草抗HSV活性部位呈棕黑色粉末状(见图 1)，易溶于水，不溶于有机溶剂，如高浓度的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等。
2.夏枯草抗HSV活性部位的鉴别反应
对以上各部分进行Molish反应(糖类)、碘液反应(淀粉)、考马斯亮蓝反应(蛋白质)、茚三酮反应(游离氨基酸)、FeCl3反应(鞣质)、醋酐浓硫酸反应 (皂苷)、Feigl反应(醌类)、盐酸镁粉反应(黄酮)、碘化钾沉淀反应(生物碱) 等。
结果：见表3
表3夏枯草抗HSV活性部位的化学成分鉴别
Figure GDA0003788601270000072
Figure GDA0003788601270000081
3.紫外光谱扫描
称取夏枯草抗HSV活性部位1mg，分别溶于纯化水中，制备成浓度为0.5 mg/mL的样品溶液，以纯化水为空白对照，于紫外波长190-800nm范围内进行扫描。
结果：夏枯草抗HSV活性部位的紫外光谱扫描在240-400nm范围内有吸收峰，显示可能存在富含酚羟基的成分；260nm附近的吸收提示可能存在蛋白质类成分；200nm附近为糖类成分的吸收，如图2。
4.红外光谱扫描
采用KBr压片法对夏枯草抗HSV活性部位进行傅里叶红外(FT-IR)光谱分析。称取5mg的夏枯草抗HSV活性部位样品于研钵中，加入干燥的KBr，充分研磨混匀，用压片机压成薄片，放入傅里叶变换红外光谱仪中进行测试，在 400-4000cm-1波长范围内进行扫描，获得光谱图谱。
结果：在FT-IR光谱中，存在OH拉伸振动，在3400cm-1附近有宽而强的谱带，在1514cm-1(C＝C)和1206cm-1(苯基OH)附近观察到酚类特征吸收带。1730cm-1和1617cm-1附近的谱带分别显示存在酯化和未酯化的羧基。2940 cm-1处的特征带显示存在C-H不对称振动。在1200-1000cm-1范围内的谱带显示存在C-OH拉伸振动和糖链中C-O-C糖苷键的振动，见图3。
5.HPGPC-RID测定分子量范围
①标准溶液的配置：精密称取普鲁兰(Pullulan)对照品D1，D2，D3，D4， D5，D6，D7，D8(分子量依次为6100、9600、21100、47100、107000、194000、 337000、642000)各1mg，加入0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取各离心后的标准溶液上清液，排序进样。
②供试品溶液配置：精密称取供试品2mg，精密量取1mL超纯水溶解，加入 0.22μm水相滤膜过滤后的0.02mol/L氯化钠水溶液1mL，配成1mg/mL的标准品溶液，充分溶解后10000rpm离心10min，吸取离心后的供试品上清液转入液相样品瓶，排序进样。
③色谱条件：Sugar KS-802、Sugar KS-804色谱柱串联；0.02mol/L氯化钠水溶液为流动相(0.22μm水相滤膜过滤)；流速0.8mL/min；进样体积20μL；分析时间25min；检测器为示差检测器(RID)；检测池温度40±0.1℃。
④标准曲线的绘制：取Pullulan D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8标准溶液，经0.45μm孔滤器过滤后,采用以上所选色谱条件，使用Agilent公司GPC软件采集数据并绘制标准曲线，以标准分子量为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性方程拟合。
⑤待测样品分子量的测定：按照上述色谱条件，使用Agilent公司GPC软件测定出样品的分子量分布范围。
结果：采用HPGPC-RID对夏枯草抗HSV活性部位分子量范围进行测定得出，色谱图见图4，夏枯草抗HSV活性部位重均分子量Mw为17.04kDa，数均分子量Mn为7.63kDa。
6.总糖，蛋白质，多酚含量测定
①总糖含量测定
对照品溶液的配制：葡萄糖标准品12.50mg，精密称定，置25mL量瓶中，加水适量溶解，稀释至刻度，摇匀；
供试品溶液配制：精密称取夏枯草抗HSV活性部位冻干粉末12.5mg至25 mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL)，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：精密量取对照品标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、 1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL分别置具塞试管中，分别加水补至2.0mL，各精密加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，摇匀，放置30分钟，冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
总糖含量测定：精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，加水补至2.0mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入5％苯酚溶液1mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含总糖的重量，按照公式2 计算，即得。
Figure GDA0003788601270000101
②蛋白质含量测定
对照品溶液的配制：精密称取牛血清蛋白对照品10.12mg,置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.101mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取夏枯草抗HSV活性部位冻干粉末12.5mg至 25mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL)，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：取浓度为0.101mg/mL的牛血清蛋白照品溶液0.1mL、 0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL 于具塞试管中，加水补足至1.0mL，精密加入考马斯亮蓝试液5mL，摇匀，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(2020版《中国药典》四部通则0401)，在595nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
蛋白质含量测定：精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入考马斯亮蓝试液5mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含蛋白质的重量，按照公式3计算，即得。
Figure GDA0003788601270000102
③多酚含量测定
对照品溶液的配制：精密称取没食子酸对照品52.00mg,置500mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.104mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密称取夏枯草抗HSV活性部位冻干粉末12.5mg至 25mL容量瓶中(即浓度为0.5mg/mL，加纯水定容至刻度线，超声至完全溶解，摇匀。
标准曲线的绘制：精密量取浓度为0.052mg/mL的没食子酸对照品溶液0.5 mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL分别置25mL棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1mL，加水10mL，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，依照紫外-可见分光光度法(2020版《中国药典》四部通则0401)，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
多酚含量测定：精密量取夏枯草抗HSV活性部位供试液2mL，置25mL 棕色容量瓶中，自“加入磷钼钨酸试液1mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含多酚的重量，按照公式4计算，即得。
Figure GDA0003788601270000111
结果：见表4。
表4夏枯草抗HSV活性部位中总糖、蛋白质、多酚含量(n＝3)
Figure GDA0003788601270000112
7.夏枯草抗HSV活性部位中单糖的组成
①前处理方法：
完全酸水解：取适量夏枯草抗HSV活性部位冻干粉于水解管中，加入4mol/L 三氟乙酸水溶液1mL，将其静置于120℃恒温烘箱中，水解2小时后，取出，氮气吹干；
衍生化反应：经完全酸水解、氮气吹干处理后的夏枯草抗HSV活性部位样品中加入0.5mol/L PMP-甲醇溶液1mL以及0.3mol/L NaOH水溶液0.5mL，静置于70℃恒温水浴60分钟，取出冷却，加入0.3mol/L HCl水溶液0.5mL后，再加入0.5mL氯仿，振摇均匀后，放置20分钟，使溶液分层，弃去下层氯仿，再次加入氯仿如前法反复萃取三次后，取上层水溶液，定容至2mL后，依照样品浓度适当稀释，过0.22μm滤膜，转移至进样瓶，上机检测。
②仪器方法：
色谱柱：SHISEIDO C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：A(0.1mol/L磷酸水溶液，pH 6.8)：B(乙腈)＝82：18
流速：1.0mL/min；柱温：25℃；
进样量：10μL；
波长：245nm。
结果：夏枯草抗HSV活性部位经酸水解及衍生化后，采用HPLC测定单糖组成，HPLC色谱见图5；根据单糖标准品计算得到夏枯草抗HSV活性部位中单糖含量由大到小分别为：半乳糖醛酸(GalUA)100.25mg/g、木糖(Xyl)90.83 mg/g、阿拉伯糖(Ara)66.71mg/g、半乳糖(Gal)64.11mg/g、葡萄糖(Glc) 44.82mg/g、甘露糖(Man)27.71mg/g、鼠李糖(Rha)17.01mg/g、岩藻糖(Fuc) 8.24mg/g、葡萄糖醛酸(GlcUA)5.74mg/g、核糖(Rib)4.73mg/g；计算各单糖摩尔百分比见表5。
表5夏枯草抗HSV活性部位中单糖组成的摩尔百分比(％)
Figure GDA0003788601270000121
8.夏枯草抗HSV活性部位中氨基酸的组成
对夏枯草抗HSV活性部位进行酸水解等前处理，采用氨基酸自动测试仪分析其中组成蛋白质的氨基酸类型及含量。
①前处理方法：
称取适量夏枯草抗HSV活性部位冻干粉，在水解管中加入6mol/L盐酸水溶液10-15mL，将水解管放入干冰冷冻剂中静置3-5min，充氮气保护，拧紧瓶盖，将水解管置于110±1℃的恒温电热鼓风箱中，水解22小时后取出，静置冷却至室温。将水解管打开，其中的水解液过滤，转移至50mL容量瓶中，继而用纯化水少量多次的冲洗水解管，水洗液同样转移至上述50mL容量瓶内，加纯化水定容至刻度线，振摇使混合均匀。准确吸取50mL容量瓶内的滤液1.0mL，转移至15mL试管内，于40℃减压使其干燥后，加入pH 2.2的柠檬酸钠缓冲溶液1.0mL使其复溶，充分振摇混合均匀后，过0.22μm滤膜，上机测定。
②仪器方法：
色谱柱：磺酸型阳离子树脂；
波长：570nm和440nm；
进样量：500μL；
反应温度：135±5℃
结果：采用氨基酸自动测试仪对夏枯草抗HSV活性部位中组成蛋白质的氨基酸种类及含量进行检测，结果表明夏枯草抗HSV活性部位中的蛋白质类成分知识由15种以上的常见氨基酸组成，其中酸性氨基酸谷氨酸及天冬氨酸含量较高，分别为3.90mg/g和2.50mg/g(见表6，图6)。
表6夏枯草抗HSV活性部位的氨基酸组成(mg/g)
Figure GDA0003788601270000131
9.夏枯草抗HSV活性部位中多酚类成分的水解及成分分析组成
取夏枯草抗HSV活性部位0.2g，溶于100mL 1mol/L HCl，静置30分钟后，加入等比例乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层减压蒸干至无酸味，运用 UPLC-DAD-QTOF-MS/MS分析表征多酚组成。
UPLC色谱条件(表7)：
色谱柱：ACQUITY BEH C18 1.7μm 2.1×100nm Column；柱温：25℃；
检测波长：254nm，365nm；流速：0.400mL/min
表7流动相比例
Figure GDA0003788601270000141
结果：
通过对夏枯草抗HSV活性部位进行温和酸水解，乙酸乙酯萃取其水解下来的多酚部分，UPLC分析见图7，该部分多酚在紫外光365nm，254nm均有较强的吸收，代表其结构中具有酚羟基类的发色团。
夏枯草抗HSV活性部位的ES+总离子图见图8，每个相邻峰的基峰间均相差一个m/z44的COO中性粒子，推测为链接各酚类单元的酯基。
由各峰的质谱列分可发现，许多峰含有m/z 89.06，133.09，177.11，221.14，317.15等离子碎片(表8)，这些碎片可能由下图二苄基并丁内酯型木脂素的聚合体(Polymers of dibenzylbutyrolactone-type lignans)组成(图9)。
表8夏枯草抗HSV活性部位离子碎片信息
Figure GDA0003788601270000142
Figure GDA0003788601270000151
综上所述，对夏枯草抗HSV活性部位进行温和酸水解和 UPLC-QTOF-MS/MS分析发现，夏枯草抗HSV活性部位富含酚羟基的基团主要由二苄基并丁内酯型木脂素的聚合体单元组成。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
实施例5
《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》(2016年4月1日33,No. 20,2012.张霞,聂少平*,李昌,谢明勇)中制备的水溶性多糖与PVG的单糖组成的对比：
按照《夏枯草水溶性多糖乙醇分级纯化及其理化性质研究》中所述：六个组分都含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中木糖和阿拉伯糖含量最高，甘露糖最低，不含核糖和岩藻糖，但各组分中单糖具体摩尔组成比例不同。其中30％醇沉部分PVLP-2的单糖组成量比为：鼠李糖：阿拉伯糖：木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.20：2.57：3.63：1.00：0.94：1.83。
而本发明中提出的PVG含有半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖，其中半乳糖醛酸和木糖含量较高，核糖含量最低。
夏枯草抗HSV活性部位PVG经酸水解及衍生化后，采用HPLC测定单糖组成， HPLC色谱见图5；根据单糖标准品计算得到夏枯草抗HSV活性部位中单糖含量由大到小分别为：半乳糖醛酸(GalUA)100.25mg/g、木糖(Xyl)90.83mg/g、阿拉伯糖(Ara)66.71mg/g、半乳糖(Gal)64.11mg/g、葡萄糖(Glc)44.82mg/g、甘露糖(Man)27.71mg/g、鼠李糖(Rha)17.01mg/g、岩藻糖(Fuc)8.24mg/g、葡萄糖醛酸(GlcUA)5.74mg/g、核糖(Rib)4.73mg/g；计算各单糖摩尔百分比见表5。

Claims (6)

1.一种夏枯草抗HSV活性部位，其特征在于通过如下的方法制备而成：取夏枯草果穗或其粉末，然后加入夏枯草果穗或其粉末体积10-22倍量的水，加热至80-100℃，回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，再加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，4℃静置6-24小时后离心，得到的沉淀用10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，收集沉淀干燥后即得水提醇沉样品，然后将制得的水提醇沉样品溶于纯水，加入中性盐硫酸铵固体，使其溶解在样品水溶液中，直至样品水溶液硫酸铵的饱和度达70-100％，析出沉淀，离心收集沉淀后再复溶于水，置透析袋内透析除盐后，收集透析袋内溶液，浓缩干燥而得夏枯草抗HSV活性部位；该活性部位为一类水溶性的多组分大分子物质，分子量范围在3.5kDa-25.0kDa之间，以质量百分比计，所述活性部位包括35.0-55.0％的总糖，10.0-30.0％的蛋白质，15.0-30.0％的多酚类成分。
2.根据权利要求1所述的一种夏枯草抗HSV活性部位，其特征在于：加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇至乙醇浓度为30％v/v进行沉淀，得到的沉淀用30％v/v的乙醇洗涤至少两次。
3.一种夏枯草抗HSV活性部位的制备方法，其特征在于：取夏枯草果穗或其粉末，然后加入夏枯草果穗或其粉末体积10-22倍量的水，加热至80-100℃，回流提取2-4次，每次0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩，再加入上述浓缩后的液体体积0.2-1倍的乙醇使得乙醇浓度为10-50％v/v，得到的沉淀用10-50％v/v的乙醇洗涤至少两次，4℃静置6-24小时后离心，沉淀部分干燥后即得水提醇沉样品，然后将制得的水提醇沉样品溶于纯水，加入中性盐硫酸铵固体，使其溶解在样品水溶液中，直至样品水溶液硫酸铵的饱和度达70-100％，析出沉淀，离心收集沉淀后再复溶于水，置透析袋内透析除盐后，收集透析袋内溶液，浓缩干燥而得夏枯草抗HSV活性部位；该活性部位为一类水溶性的多组分大分子物质，分子量范围在3.5kDa-25.0kDa之间，以质量百分比计，所述活性部位包括35.0-55.0％的总糖，10.0-30.0％的蛋白质，15.0-30.0％的多酚类成分。
4.一种药物组合物，其特征在于：含有如权利要求1或2任一权利要求所述的一种夏枯草抗HSV活性部位。
5.根据权利要求4所述的一种药物组合物，其特征在于：含有药学上可以接受的辅料。
6.权利要求1所述的一种夏枯草抗HSV活性部位在制备预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物中的应用。
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夏枯草抗单纯疱疹病毒活性研究;谭红胜等;《中华中医药学会中药实验药理分会2014年学术年会论文摘要汇编》;20140807;第64-66页 *
夏枯草抗疱疹病毒多糖的提取及纯化工艺研究;孔思远等;《世界中医药》;20160731;第11卷(第7期);第1145-1149页 *
多糖的提取纯化研究;马世民等;《新乡学院学报（自然科学版）》;20130831;第30卷(第4期);第258-262页 *

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