CN112076175A - 一种蛹虫草多糖泡腾片、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药组合物制备技术领域,公开了一种蛹虫草多糖泡腾片、制备方法及应用,采用热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取,并对提取的蛹虫草粗多糖进行分离纯化;将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片。本发明将蛹虫草多糖制成适合的剂型,能在一定程度上提高多糖资源利用率,为开发多糖新剂型奠定基础,同时可为食用菌制剂提供前沿的参考思路,具有较好的市场发展前景。本发明确定的泡腾片制备工艺操作方便、简单,黏冲少,出片顺利。本发明的蛹虫草多糖泡腾片能有效改善CCl4引起的肝损伤,具有抗氧化活性,提示蛹虫草多糖泡腾片具有开发为抗氧化及保肝类保健品的潜力,也为蛹虫草多糖的后续开发利用提供了参考。
Description
技术领域
本发明属于中药组合物制备技术领域,尤其涉及一种蛹虫草多糖泡腾片、制备方法及应用。
背景技术
目前:蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Link)又称北虫草、北冬虫夏草、蛹草、蛹草菌、东北虫草等,是我国重要的食药用菌之一,隶属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草科(Cordycipitaceae),是虫草属(Cordycps)真菌的模式种。蛹虫草的宿主不十分专一,可寄生于鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫的幼虫或蛹体上,它是由子座(草部分,即子实体)与菌核(虫或蛹的尸体部分)两部分组成的复合体。蛹虫草的分布范围极广,在北美洲、南美洲以及欧洲等地区均有报道。我国是蛹虫草分布范围最广、虫草资源最丰富的国家,野生蛹虫草在黑龙江、吉林、辽林、河北、内蒙古、陕西、西藏、云南、四川、贵州、湖北、山东、浙江、广东、福建、台湾等省均有分布。蛹虫草虽然分布广泛,但天然产量其实较为稀少。目前经过多年的技术研究,蛹虫草已经实现了较大规模的人工培养,其人工培养方法主要有三种:一是固体培养基培养获得蛹虫草子实体,二是柞蚕、家蚕或活蛹等作培养基质得到虫与菌的复合体,三是液体发酵培养得到蛹虫草菌丝体。蛹虫草中含有与冬虫夏草类似的如核苷类、虫草多糖、虫草甾醇和糖醇类、脂肪酸和氨基酸等多种活性成分,相关研究表明两者在生物活性上也存在相似之处,具有免疫调节、抗肿瘤以及抗氧化等多种药理作用。目前,由于野生的冬虫夏草资源减少、价格高昂,所以蛹虫草已经逐渐作为冬虫夏草的理想替代品被开发利用。随着虫草知名度的提高,蛹虫草被研究得越来越多,并且已在中、日、韩成为仅次于冬虫夏草的第二大商业化药用子囊真菌。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:
(1)现有蛹虫草多糖的提取方法蛹虫草多糖纯度不高。
(2)现有技术制备的蛹虫草多糖的泡腾片泡腾片色泽不均匀,且崩解效果不佳。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种蛹虫草多糖泡腾片制备方法。
本发明是这样实现的,一种蛹虫草多糖泡腾片制备方法,所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法包括:
步骤一,采用热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取,并对提取的蛹虫草粗多糖进行分离纯化;
步骤二,将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片。
进一步,步骤一中,所述热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取包括:
(1)将蛹虫草在60℃真空干燥箱中放置24h,取出后粉碎、过80目筛;
(2)准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1:20的比例加入蒸馏水,于90℃水浴锅中浸提1.5h后,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次;
(3)上清液浓缩后加入无水乙醇至醇浓度为80%,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到粗多糖。
进一步,步骤一中,所述蛹虫草粗多糖分离纯化方法包括:
1)DEAE-52填料预处理:称取100g的DEAE-52离子交换剂填料于烧杯中,加入大量蒸馏水洗涤除去表面杂质;将洗涤后的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的HCl溶液中2h,用去离子水洗至中性,抽干,再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h,洗涤,抽干,真空干燥即获得处理好的DEAE-52;将填料真空干燥并再次置于蒸馏水中使用;
2)样品预处理:在蛹虫草粗多糖中加入多糖体积1/4的Sevage试剂,离心,并重复操作多次;用1.5%的活性炭对粗多糖进行脱色,加入4倍体积的无水乙醇,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到除去蛋白质和色素的蛹虫草粗多糖;
3)样品纯化分离:采用湿法上样,打开柱出液口,先加入1/3柱高的蒸馏水,再加入DEAE-52填料,并进行搅拌;装料完成后将柱出液口关闭,取预处理过的蛹虫草粗多糖样品500mg,用蒸馏水配制成50mg/mL的粗多糖溶液后,上柱;用蒸馏水和0.2mol/L~1.0mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为2mL/min,10mL/管收集洗脱液,每管取100μL洗脱液,测定吸光度值,以管数作为横坐标,相应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱曲线;根据洗脱曲线收集不同吸收峰段的多糖组分,将多糖组分洗脱液减压浓缩至原体积的1/4,再3000Da下透析48h,真空冷冻干燥得蛹虫草多糖;
4)取30mg得到的蛹虫草多糖,溶解于2mL蒸馏水中,5000r/min离心后上样,分别用蒸馏水和0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为0.5m L/min,10mL/管收集洗脱液,合并主要洗脱峰的洗脱液,浓缩,透析,真空冷冻干燥后得纯蛹虫草多糖。
进一步,所述步骤4)之前还需进行:
首先,称取Sephadex G-100葡聚糖凝胶10g于烧杯中,加入蒸馏水过夜使其充分溶胀后,倾去上层悬浮颗粒,蒸馏水保存备用;
其次,将层析柱垂直固定在铁架台上,柱内加入1/3柱高的蒸馏水,将已活化的填料经脱气处理后缓慢加入柱中并进行搅拌,柱面平整,无气泡后,用洗脱缓冲液平衡过夜。
进一步,步骤二中,所述将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片包括:
将蛹虫草多糖粉碎后过100目筛,按比例称取乳糖、柠檬酸、碳酸氢钠、甜菊糖苷,与蛹虫草多糖粉末混合均匀,用无水乙醇溶液制粒,于50℃干燥,整粒,然后加入润滑剂PEG6000,压制成规格为1.0g/片的片剂即可。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法制备得到的蛹虫草多糖泡腾片,所述蛹虫草多糖泡腾片按照质量分数由20%的蛹虫草多糖、50%的柠檬酸与碳酸氢钠、2%的润滑剂PEG 6000、3%的甜菊糖苷以及乳糖组成;
所述柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1.4:1。
进一步,所述泡腾剂总量为50%。
本发明的另一目的在于提供一种所述蛹虫草多糖泡腾片在改善保护肝细胞损伤药物中的应用。
结合上述的所有技术方案,本发明所具备的优点及积极效果为:
本发明对蛹虫草多糖进行提取分离纯化,并进行了蛹虫草多糖泡腾片制备,同时探究其保肝作用,为相关食品、保健品的研发提供参考。蛹虫草作为药食两用的真菌,具有多种活性成分及药理作用,对蛹虫草的研究开发具有直接现实意义。
本发明采用热水浸提法对蛹虫草多糖进行提取,并采用DEAE-52柱层析和Sephadex G-100柱层析法进行了蛹虫草多糖的分离纯化组分(CMPn),其多糖含量为90.83%。
本发明确定的泡腾片制备工艺操作方便、简单,黏冲少,出片顺利。
本发明制备的蛹虫草多糖泡腾片外观、片重差异、崩解时限、脆碎度、硬度等指标均符合规定,溶解所得溶液平均pH值为(4.71±0.05)(RSD=1.04%),蛹虫草多糖泡腾片中多糖的含量为(15.45±0.17)%(RSD=1.10%)。稳定性试验结果表明,3、6、9、12个月后,蛹虫草多糖泡腾片片外观性状、崩解时限、pH、含量均无明显变化,稳定性较好。本发明确定的泡腾片制备工艺操作方便、简单,黏冲少,出片顺利。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍,显而易见地,下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的蛹虫草多糖泡腾片制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的葡萄糖标准曲线示意图。
图3是本发明实施例提供的浸提温度对多糖提取率的影响示意图。
图4是本发明实施例提供的浸提时间对虫草多糖提取率的影响示意图。
图5是本发明实施例提供的浸提时间对虫草多糖提取率的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的DEAE-52分离纯化蛹虫草多糖洗脱曲线示意图。
图7是本发明实施例提供的Sephadex G-100分离纯化中性多糖洗脱曲线示意图。
图8是本发明实施例提供的蓝色葡聚糖及葡萄糖经Sephadex G-100凝胶柱洗脱图。
图9是本发明实施例提供的蛹虫草多糖经Sephadex G-100凝胶柱纯化图。
图10是本发明实施例提供的碘标准曲线示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种蛹虫草多糖泡腾片、制备方法及应用,下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示,本发明实施例提供的蛹虫草多糖泡腾片制备方法包括:
S101,采用热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取,并对提取的蛹虫草粗多糖进行分离纯化;
S102,将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片。
本发明提供的蛹虫草多糖泡腾片制备方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施,图1的本发明提供的蛹虫草多糖泡腾片制备方法仅仅是一个具体实施例而已。
步骤S101中,本发明实施例提供的热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取包括:
(1)将蛹虫草在60℃真空干燥箱中放置24h,取出后粉碎、过80目筛;
(2)准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1:20的比例加入蒸馏水,于90℃水浴锅中浸提1.5h后,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次;
(3)上清液浓缩后加入无水乙醇至醇浓度为80%,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到粗多糖。
步骤S101中,本发明实施例提供的蛹虫草粗多糖分离纯化方法包括:
1)DEAE-52填料预处理:称取100g的DEAE-52离子交换剂填料于烧杯中,加入大量蒸馏水洗涤除去表面杂质;将洗涤后的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的HCl溶液中2h,用去离子水洗至中性,抽干,再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h,洗涤,抽干,真空干燥即获得处理好的DEAE-52;将填料真空干燥并再次置于蒸馏水中使用;
2)样品预处理:在蛹虫草粗多糖中加入多糖体积1/4的Sevage试剂,离心,并重复操作多次;用1.5%的活性炭对粗多糖进行脱色,加入4倍体积的无水乙醇,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到除去蛋白质和色素的蛹虫草粗多糖;
3)样品纯化分离:采用湿法上样,打开柱出液口,先加入1/3柱高的蒸馏水,再加入DEAE-52填料,并进行搅拌;装料完成后将柱出液口关闭,取预处理过的蛹虫草粗多糖样品500mg,用蒸馏水配制成50mg/mL的粗多糖溶液后,上柱;用蒸馏水和0.2mol/L~1.0mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为2mL/min,10mL/管收集洗脱液,每管取100μL洗脱液,测定吸光度值,以管数作为横坐标,相应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱曲线;根据洗脱曲线收集不同吸收峰段的多糖组分,将多糖组分洗脱液减压浓缩至原体积的1/4,再3000Da下透析48h,真空冷冻干燥得蛹虫草多糖;
4)称取Sephadex G-100葡聚糖凝胶10g于烧杯中,加入蒸馏水过夜使其充分溶胀后,倾去上层悬浮颗粒,蒸馏水保存备用;
5)将层析柱垂直固定在铁架台上,柱内加入1/3柱高的蒸馏水,将已活化的填料经脱气处理后缓慢加入柱中并进行搅拌,柱面平整,无气泡后,用洗脱缓冲液平衡过夜;
6)取30mg得到的蛹虫草多糖,溶解于2mL蒸馏水中,5000r/min离心后上样,分别用蒸馏水和0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为0.5m L/min,10mL/管收集洗脱液,合并主要洗脱峰的洗脱液,浓缩,透析,真空冷冻干燥后得纯蛹虫草多糖。
步骤S102中,本发明实施例提供的将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片包括:
将蛹虫草多糖粉碎后过100目筛,按比例称取乳糖、柠檬酸、碳酸氢钠、甜菊糖苷,与蛹虫草多糖粉末混合均匀,用无水乙醇溶液制粒,于50℃干燥,整粒,然后加入润滑剂PEG6000,压制成规格为1.0g/片的片剂即可。
本发明实施例提供的蛹虫草多糖泡腾片按照质量分数由20%的蛹虫草多糖、50%的柠檬酸与碳酸氢钠、2%的润滑剂PEG6000、3%的甜菊糖苷以及乳糖组成;所述柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1.4:1。
本发明实施例提供的泡腾剂总量为50%。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1:
1蛹虫草中虫草多糖的提取纯化研究
目前,虫草多糖的提取方法主要有热水浸提、回流提取法、超声提取法和微波提取法等。近年来虽也出现了超声强化亚临界水、超声辅助复合酶、微波-纤维素酶及高压脉冲电场等辅助提取技术,能获得较高的多糖提取率,但操作过程复杂,成本高,不适用于大规模生产。故本实验热水浸提法、水热回流提取法、超声波水提取三种常用多糖提取方法进行比较,并对选出的方法进行工艺优化,再采用柱层析法对提取得到的粗多糖进行分离纯化以获得蛹虫草多糖纯品。
1.1试验材料与仪器
1.1.1材料与试剂
1.1.1.1材料
蛹虫草,南江宏信生物科技有限公司
1.1.1.2试剂
试剂如表1所示。
表1试验所用试剂
1.1.2仪器与设备
表2试验仪器与设备
1.2试验方法
1.2.1多糖的含量测定
采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中粗多糖含量。
1.2.1.1葡萄糖标准储备液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50.0mg于50mL容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容至50mL,配制成质量浓度为1.0mg/mL的葡萄糖标准储备液,密封,于4℃冰箱中保存,备用。
1.2.1.2标准曲线的制备
分别精密移取2、4、6、8、10、12mL葡萄糖标准储备液于100mL容量瓶中定容摇匀,配置成质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取2mL标准溶液于10mL具塞试管中,迅速加入5%苯酚溶液1.0mL,摇匀,再小心加入浓硫酸5.0mL,摇匀。室温下静置5min,再水浴加热15min,水浴温度为90℃。取出冷却至室温,用酶标仪在490nm波长处测定吸光度,测量时以蒸馏水为参比。以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
1.2.2虫草多糖提取工艺研究
1.2.2.1蛹虫草样品的预处理
将蛹虫草在60℃真空干燥箱中放置24h,然后取出,将样品粉碎、过80目筛。过筛后的蛹虫草粉末按照1:4(g/mL,w/V)的比例加入80%乙醇,80℃回流处理4h以进行脱脂,去除部分色素、疏水性物质及单糖、寡糖等杂质,然后5000r/min离心15min,收集沉淀。将沉淀在50℃干燥至恒重后置于干燥容器中保存,以便用于后续实验研究。
1.2.2.2蛹虫草多糖提取方法的选择
比较热水浸提法、水热回流法、超声波提取法这3种使用较为广泛的多糖提取方法对蛹虫草多糖提取的影响。以蛹虫草多糖提取率为考察指标,选择较优提取方法以进行后续优化实验。
蛹虫草多糖提取率计算公式如下:
其中Y为蛹虫草多糖提取率,%;c为样品测定液中葡萄糖的质量浓度,mg/mL;V为定容体积,mL;f为稀释倍数;m为试验所取的蛹虫草粉末质量,g;0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
热水浸提法:准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1∶20(g/mL,w/V)的比例加入蒸馏水,于80℃水浴锅中浸提1.5h后,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次。上清液浓缩后加入无水乙醇至醇浓度为80%(v/v),4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到粗多糖。苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算蛹虫草多糖提取率,实验重复3次。
水热回流提取法:准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1∶20(g/mL)的比例加入蒸馏水,100℃热回流提取1.5h,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次,其余操作同上。苯酚-硫酸法测定多糖含量并计算蛹虫草多糖提取率,实验重复3次。
超声波水提取法:准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1∶20(g/mL)的比例加入蒸馏水,55℃超声提取30min,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次,其余操作同上。苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量并计算蛹虫草多糖提取率,实验重复3次。
1.2.2.3热水浸提单因素试验
准确称取蛹虫草粉末2g,选取不同浸提温度(60、70、80、90、100℃),浸提时间(1、1.5、2、2.5、3h),料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL)进行单因素实验,分别考察不同条件对蛹虫草多糖提取率的影响。初始的单因素条件分别为浸提温度80℃,浸提时间1.5h,料也比1:20(g/mL),提取3次。
1.2.2.4正交试验设计
在前期单因素试验的基础上,以多糖提取率为考察指标设计L9(34)正交试验,对蛹虫草多糖提取工艺条件进行进一步的优化分析,从而确定出最佳提取工艺。试验因素水平见表2.3。
表3正交试验因素与水平
1.2.3蛹虫草粗多糖的纯化
1.2.3.1蛹虫草粗多糖的DEAE-52柱层析分离纯化
(1)DEAE-52填料预处理
称取100g的DEAE-52离子交换剂填料于烧杯中,加入大量蒸馏水洗涤以除去表面杂质。将其浸泡在0.5mol/L的HCl溶液中2h,然后用去离子水洗至中性,抽干,再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h,同法洗涤,抽干,真空干燥即获得处理好的DEAE-52。最后,将填料真空干燥并再次置于蒸馏水中使用。
(2)样品预处理
首先在蛹虫草粗多糖中加入多糖体积1/4的Sevage试剂(氯仿:正丁醇体积比4:1),离心,并重复操作多次以除去蛋白质。再用1.5%(w/V)的活性炭对粗多糖进行脱色,然后加入4倍体积的无水乙醇,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到除去蛋白质和色素的蛹虫草粗多糖。
(3)样品纯化分离
采用湿法上样(2.6cm×60cm),打开柱出液口,先加入1/3柱高的蒸馏水,再加入DEAE-52填料,为了防止产生气泡和分层现象,填料加入时应搅拌。装料完成后将柱出液口关闭,为了让柱填料均匀分布,应预先将柱用蒸馏水进行过夜平衡。取预处理过的蛹虫草粗多糖样品500mg,用蒸馏水配制成50mg/mL的粗多糖溶液后,上柱。用蒸馏水和0.2mol/L~1.0mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为2mL/min,10mL/管收集洗脱液,每管取100μL洗脱液,按照2.2.1项下所述方法测定吸光度值,以管数作为横坐标,相应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集不同吸收峰段的多糖组分,然后将多糖组分洗脱液减压浓缩至原体积的1/4,再进行透析(3000Da)48h,真空冷冻干燥得蛹虫草多糖。
2.2.3.1 Sephadex G-100柱层析纯化
(1)Sephadex G-100预处理
称取Sephadex G-100葡聚糖凝胶10g于烧杯中,加入蒸馏水过夜使其充分溶胀后,倾去上层悬浮颗粒,蒸馏水暂时保存备用。
(2)装柱与平衡
将层析柱(1.6×60cm)垂直固定在铁架台上,柱内加入1/3柱高的蒸馏水,将已活化的填料经脱气处理后缓慢加入柱中,填料加入时应搅拌以确保柱体均匀,柱面平整,无气泡后,用洗脱缓冲液平衡过夜。
(3)上样、洗脱与收集
取30mg经DEAE-52柱层析分离得到的蛹虫草多糖,溶解于2mL蒸馏水中,5000r/min离心后上样,分别用蒸馏水和0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为0.5m L/min,10mL/管收集洗脱液,合并主要洗脱峰的洗脱液,浓缩,透析,真空冷冻干燥后得纯蛹虫草多糖。
1.3.4数据处理
每组单因素试验平行进行3次,取平均值,数据利用Origin 8.0进行绘图;使用SPSS24.0数据分析软件对正交试验结果进行分析处理。
1.3结果与分析
1.3.1标准曲线及线性关系
以葡萄糖浓度为横坐标,相应的吸光度值为纵坐标进行线性回归,得到回归方程为y=10.889x+0.0441,R2=0.9964。实验结果表明,葡萄糖浓度在0.02-0.12mg/mL之间与吸光度值呈现良好的线性关系。
1.3.2蛹虫草多糖提取方法的确定
比较热水浸提法、水热回流法和超声波提取法对蛹虫草粗多糖提取率的影响,结果见表4。由试验结果可知,热水浸提法提取率最高,故选择热水浸提法进行后续单因素及正交优化试验。
表4提取方法对蛹虫草粗多糖提取率的影响(n=3)
1.3.3单因素试验结果
1.3.3.1浸提温度对多糖提取率的影响
图3显示了浸提温度对多糖提取率的影响趋势。由图可知,随着浸提温度的升高,虫草多糖提取率明显增加,在浸提温度为90℃时达到最大值,此时得率为8.91%。在一定温度范围内,多糖溶质分子溶出速度随着温度升高而加快,提取率上升。浸提温度超过90℃,虫草多糖提取率不再增加反而略有降低,可能是温度过高导致部分多糖发生降解。因此,选择浸提温度80、90、100℃进行进一步考察。
1.3.3.2浸提时间对多糖提取率的影响
考察不同浸提时间对虫草多糖提取率的影响,试验结果见图4。结果表明,浸提时间在0.5~1.5h之内,随着浸提时间的延长,虫草多糖提取率明显增加,在1.5~2h时,增加幅度已经很小,2h时达到最大值,此时得率为7.73%;浸提时间超过2h之后,多糖提取率有所下降。这可能是因为,多糖溶解需要一定的时间才能达到平衡,在达到平衡前,随着时间的增加,多糖溶解更多,提取率也随之增大;但在达到平衡后,多糖的溶出量基本稳定,提取率增加幅度变小,浸提时间再延长甚至可能导致多糖不稳定而发生降解,进而导致提取率下降。所以,选择浸提时间1、1.5、2h进行后续正交试验。
1.3.3.3料液比对多糖提取率的影响
考察不同料液比对虫草多糖提取率的影响,试验结果见图3。由图可知,随着料液比的不断增大,虫草多糖提取率也逐渐增大,在料液比为1:20(g/mL)时达到最大值,此时得率为7.67%,在料液比为1:20(g/mL)之后,虫草多糖提取率开始下降。原因是活性成分的提取过程实际上是固-液萃取过程,浓度差是萃取的驱动力,随着溶剂量的增加,浓度差增大,因此成分提取率亦随之升高。溶剂添加到一定量之后,成分浸出速率达到最大,有效成分的提取量由浸出速率决定而不是浓度差,此时再增加溶剂反而会应溶剂增多稀释了萃取体系导致提取率降低。因此,选择料液比1:15、1:20、1:25(g/mL)这三个条件进行后续试验。
1.3.4正交试验结果与分析
正交优化试验结果如表5所示。由结果可知,所考查的3个因素中各因素对多糖提取率的影响顺序是A>B>C,即浸提温度>浸提时间>料液比,其水平优劣次序分别为A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1。对正交试验结果进行方差分析,其结果见表6。从方差分析结果可以看出,A因素即浸提温度对多糖提取率具有极显著影响(p<0.01),B因素即浸提时间对多糖提取率具有显著影响(p<0.05),因素C料液比对多糖提取率影响不显著。因此直观分析结合方差分析结果确定蛹虫草多糖最佳浸提工艺条件为A2B2C2,即浸提温度90℃,浸提时间1.5h,料液比1:20(g/mL)。
表5正交试验结果
表6方差分析结果
1.3.5 DEAE-52分离纯化蛹虫草多糖
利用DEAE-52的吸附效应,对热水浸提出的蛹虫草多糖进行初步分离纯化,洗脱曲线如图6。从图中本发明可以看出,依次用蒸馏水和0.2mol/L~1.0mol/L的NaCl溶液洗脱得到两个峰,其中第一个峰主要为不带电荷的中性多糖,第二个峰主要为带负电荷的酸性多糖,本发明收集第一个中性多糖峰,并将洗脱液进行浓缩、透析、冷冻干燥,得到白色的中性多糖,其得率为25.74%,多糖含量为85.78%。
1.3.6 Sephadex G-100分离纯化蛹虫草多糖
将经过DEAE-52柱层析分离纯化得到的中性多糖再经过Sephadex G-100柱层析进一步纯化,以获得更高纯度的蛹虫草多糖。Sephadex G-100分离纯化蛹虫草多糖洗脱曲线见图7。从图中可以看出,中性糖经蒸馏水洗脱后得到一个单一的对称主峰,在46管附近还出现了一个比较小的峰,分析可能是存在的一些小分子寡肽,能够通过透析除去。将主峰部分浓缩、冷冻干燥,得到白色可溶性纯多糖组分,命名为CMPn,得率为70.54%,多糖含量为90.83%。
本发明采用热水浸提法对蛹虫草粗多糖进行提取,以蛹虫草粗多糖提取率为考察指标,在前期单因素试验基础上采用正交试验优化粗多糖提取工艺,得到蛹虫草粗多糖最佳提取工艺条件。蛹虫草粗多糖依次经DEAE-52柱层析和Sephadex G-100柱层析分离纯化,得到纯化组分CMPn,其多糖质量分数为90.83%。
DEAE-52柱层析能够对多糖进行分离纯化的原理主要其可以吸附蛋白质、多糖等离子性物质。通常,水、不同浓度的碱性溶液和盐溶液被用于洗脱和分离目标组分,多糖分子从色谱柱中流出的先后顺序通常是水溶性的中性糖首先流出,而酸性糖后流出,以实现分离的目的,这与分级沉淀法正好相反。在试验中本发明只收集了先流出的中性糖组分,以进行后续口服吸收利用度研究。
2.1试验材料与仪器
1.1.1材料与试剂
1.1.1.1材料
蛹虫草多糖(CMPn),实验室自制。
2.1.1.2试剂
试剂如表7所示。
表7试验所用试剂
1.1.2仪器与设备
表8试验仪器与设备
2.1.3实验动物
20只健康♂SD大鼠,体重190~210g,购于成都达硕实验动物有限公司,动物生产许可证编号:SCXK(川)2019-030,使用许可证编号:SYXK(川)2019-189。
2.2试验方法
2.2.1 FITC标记蛹虫草多糖的反应
FITC标记反应参照Beldel的方法。精密称取1.0g蛹虫草多糖(CMPn),将其溶解于10mL二甲基亚砜(DMSO)中,加入5滴吡啶,然后将样品超声30min混匀。其次,将100mg异硫氰酸荧光素(FITC)和20mg二月桂酸二丁基锡(DBTLD)添加到该混合溶液中,将其在95℃下剧烈振摇2h,冷却至室温后,在不断搅拌下向混合物中缓慢加入95%(v/v)乙醇,直到混合物的乙醇含量为85%(v/v),混合物离心,收集沉淀,并用95%(v/v)乙醇反复洗涤沉淀物,真空干燥箱干燥,得CMPn与FITC形成的复合物(CMPn-F)。
2.2.2碘取代反应
碘取代反应是根据Keck的方法进行,并稍作修改。精密称取1.0g上述FITC标记的蛹虫草多糖CMPn-F,通过超声混合将其溶解于5mL超纯水中,超声助溶时间为20min。将2mL0.5mol/L碘化钠(NaI)以及5mL 0.1g/mL氯胺T溶液添加到混合液中以开始反应,然后在涡轮混合器上混合1min,再将5mL 0.1g/mL偏重亚硫酸钠缓冲溶液以及5mL 0.1g/mL碘化钾(KI)加入混合溶液中以终止反应,将反应混合物5000/min离心5min,收集上清液得到碘取代的蛹虫草多糖CMPn-I。
2.2.3凝胶色谱法纯化碘代蛹虫草多糖
称取500g Sephadex G-100,然后将其浸入超纯水中12小时,使其完全溶胀。慢慢倒入直径为5cm,长度为50cm的分离柱中。填充后,连接至中压制备液相色谱。将流速设置为1.0mL/min,并用超纯水洗脱48小时,最后使用Sephadex G-100补足分离柱。
分别精密称量蓝色葡聚糖和葡萄糖对照品各20mg,加入10mL超纯水溶解,涡轮混匀,加到Sephadex G-100凝胶色谱柱上,将流速设置为1.0mL/min,将流动相设置为超纯水,20mL/管收集洗脱液,每管取100μL洗脱液,按照2.2.1项下所述方法测定吸光度值,以收集的洗脱液的管数作为横坐标,相应的吸光度值作为纵坐标绘制内外水体积图。
通过中压制备液相色谱分离纯化碘代蛹虫草多糖。将碘代蛹虫草多糖通0.45μm微孔膜进行过滤,取10mL滤液通过凝胶色谱柱,将流动相设置为超纯水,流速设置为1.0mL/min,每管收集20mL洗脱液,每管取100μL洗脱液,利用苯酚-硫酸法测定490nm下的吸光度值,并绘制洗脱图。根据洗脱图合并洗脱液,以获得纯化碘代虫草多糖,将合并的洗脱液进行浓缩,冷冻干燥后备用。
2.2.4碘代蛹虫草多糖的稳定性研究
精密称取20mg碘代蛹虫草多糖,溶解于50mL细胞培养物(RPM1640)中,制备3份,置于37℃恒温摇床中摇匀,分别于时间点第1、2、3h吸取10mL,通过0.45μm微孔滤膜过滤,连接Sephadex G-100中压制备色谱柱,以超纯水为流动相,流速设置为1.0mL/min,10mL/管收集洗脱液,分别收集内外水附近洗脱液,合并、稀释,通过0.45μm微孔滤膜过滤,进行ICP-MS测定。
2.2.5样品消化
准确称取50mg碘代蛹虫草多糖样品,置于顶空进样瓶(10mL)中,依次加入4ml超纯水,3ml的25%四甲基氢氧化铵水溶液(TMAH)和0.1ml过氧化氢(H2O2),摇匀,使用封盖装置将瓶密封,将样品在80℃下超声处理30min以消化样品,然后在室温下放置30分钟,使其恢复到室温,将反应液转移到25ml容量瓶中,用1%TMAH溶液定容至25ml,充分震荡混匀。消化后,将样品稀释一定的倍数并用0.45μm微孔滤膜过滤以进行ICP-MS测定。
2.2.6碘取代率的测定及方法验证
采用NexION 350X电感耦合等离子体-质谱仪(ICP-MS)对样品进行分析。调谐液中含有7Li,59Co,89Y,140Ce,205Ti;内标为1mg/mL铟溶液。检测条件见表9所示。在两次进样之间清洗ICP-MS系统90s,以减少记忆效应。
表9 ICP-MS仪器工作条件
2.2.6.1标准曲线的制备
精密称取10mg干燥至恒重的NaI于10mL容量瓶中,用1%TMAH溶液定容,涡轮混匀,配制成质量浓度为1mg/mL的NaI标准储备液,再用1%TMAH依次稀释成质量浓度分别为1、5、10、50、100、300ng/mL碘系列标准工作溶液。按上述色谱条件进样,将数值记录下来,以碘含量为横坐标,测定数值为纵坐标,绘制标准曲线。
2.2.6.2精密度的测定
精密称取50mg碘代蛹虫草多糖,按照2.2.5中消化方法处理后稀释500倍,进行ICP-MS测定,重复进样测定6次,并分别记录数值,计算相对标准偏差。
2.2.6.3重复性的考察
分别精密称取同一批次碘代蛹虫草多糖50mg,共6份,按照2.2.5中消化方法处理后稀释500倍,进行ICP-MS测定,记录数值,并计算相对标准偏差。
2.2.6.4方法稳定性的测定
取50mg碘代蛹虫草多糖,按照2.2.5中样品消化方法处理后稀释500倍,并于时间点0、2、4、6、8、10h进行ICP-MS检测,记录数值,并计算相对标准偏差,以考察方法稳定性。
2.2.6.5加标回收率的测定
取与2.2.6.2中使用的同一批碘代蛹虫草多糖进行回收率测定,分别精密称取25mg,共6份,再加入不同浓度的标准品,按照2.2.5中方法将样品消化处理后稀释500倍,进行ICP-MS测定,记录数值并计算回收率。
2.2.6.6三次碘代蛹虫草多糖样品的测定
同法制备3批碘代蛹虫草多糖,按照2.2.5中方法进行处理,进行ICP-MS检测,计算碘代率。多糖的碘代率计算公式如下:
其中,RI:碘取代率;M:通过ICP-MS测量的样品中碘浓度,ng/mL;V:样品定容的体积,mL;D:稀释倍数;G:碘代蛹虫草多糖CMPn-I的重量,mg。
2.2.7大鼠分组给药及生物样本中多糖含量测定
实验前,所有SD大鼠均适应性饲喂3天,禁食12h,自由饮水。将20只大鼠随机分为空白对照组和给药组。给药组灌胃给予碘代蛹虫草多糖,灌胃剂量为100mg/100g,对照组给予等量生理盐水。分别于给药后第0.5、1、2、3h从大鼠眼静脉采血约1mL。在给药后3h,将大鼠按照0.3mL/100g用10%水合氯醛麻醉,然后处死。解剖后取心、肝、脾、肺、肾等组织。用已预冷的生理盐水反复漂洗器官至无血色,用滤纸吸干脏器上残余水分。新鲜脏器称重后将其冷冻干燥并磨成粉末,并将血液样品于-20℃下储存备用。
分别取各时间点血液样品1mL以及各组织样品100mg于顶空进样瓶中,按照2.2.5中方法进行消化处理,稀释至合适倍数,使其分别在线性范围内。最后,用ICP-MS对样品进行分析。
血液和器官中蛹虫草多糖含量测定公式如下
其中,Cb:大鼠血液中蛹虫草多糖含量,mg;Co:脏器中蛹虫草多糖含量,mg;R:蛹虫草多糖在血液或脏器中的吸收率,%;L:大鼠血容量,mL,一般来说,大鼠血容量是其体重的7.4%;Wo:大鼠脏器重量,mg;Y:大鼠口服给药剂量。
2.3结果与分析
2.3.1 Sephadex G-100凝胶柱层析纯化结果
凝胶柱内水外水体积图及碘代蛹虫草多糖洗脱图见图8及图9。根据洗脱结果可以看出,图中外水体积处有一个峰,为分子量较大的物质,即碘代多糖,内水体积处为小分子物质,与大分子物质有较好分离。因此将第16~45管洗脱液收集并合并起来,浓缩、冷冻干燥,得到纯化碘代蛹虫草多糖。经过凝胶柱洗脱的碘代多糖去除了小分子物质以及没有碘代上的游离碘,排除了其对后续ICP-MS测定结果的干扰。
2.3.2碘代多糖的稳定性
当检测生物样品中的碘代多糖复合物时,碘标记物的稳定性对于获得准确结果非常重要。在细胞培养物中测试了标记物的稳定性。使用Sephadex G-100色谱柱从细胞培养物中分离并收集小分子物质,使用ICP-MS在收集的馏分中均未检测到游离碘,然后,将从灌胃给药碘代蛹虫草多糖大鼠收集的血液样品溶解在纯水中,并加到Sephadex G-100色谱柱上以收集小分子组分,使用ICP-MS在收集的馏分中亦未检测到游离碘。这些结果表明,碘标记的蛹虫草多糖在生物样品中是稳定的。
2.3.3碘代蛹虫草多糖碘代率的测定及方法验证
2.3.3.1标准曲线的测定
以碘含量为横坐标,ICP-MS测定数值为纵坐标进行线性回归,得到回归方程为y=1.0027x+2.6438,R2=0.9999,标准曲线如图10所示。实验结果表明,NaI浓度在0-300ng/mL之间线性关系良好。
2.3.3.2精密度的测定
精密度测定结果如表10所示,由结果可知,ICP-MS仪器精密度测试结果的RSD为1.38%,表明仪器的精密度良好。
表10精密度测定结果
2.3.3.3重复性的考察
重复性测定结果如表11所示,从检测结果计算得出的RSD显示该方法具有良好得重复性。
表11重复性测定结果
2.3.3.4方法稳定性的测定
方法稳定性试验结果见表12,由结果可知,方法稳定性测试的RSD为1.63%,表明该方法在10h内是稳定的。
表12方法稳定性测定结果
2.3.3.5加标回收率的测定
加标回收率测定结果如表13所示,加标回收率均在95%~105%以内,RSD为2.11%。
表13加标回收率测定结果
2.3.3.6三次碘代蛹虫草多糖样品的测定
同法制备3批碘代蛹虫草多糖,其ICP-MS检测与碘代率计算结果见表14,由结果可知,3批碘代蛹虫草多糖的碘代率基本保持一致,表明此测定方法具有可行性,可以进行后续实验。
表14 3批样品碘代率测定结果
2.3.4生物样本中碘代蛹虫草多糖的测定
2.3.4.1大鼠血液中碘代蛹虫草多糖含量
将1mL血液样品消化后稀释200倍,取1mL稀释液进行ICP-MS检测,测定及吸收率计算结果如表15所示。结果表明,给药1h后,血液中蛹虫草多糖的吸收率最高,达到5.71%,随后开始下降。
表15不同时间大鼠血液中碘和蛹虫草多糖CMPn-I的含量
3.1试验材料与仪器
3.1.1材料与试剂
3.1.1.1材料
蛹虫草多糖,实验室自制。
3.1.1.2试剂
试剂如表17所示。
表17试验所用试剂
3.1.2仪器与设备
表18试验仪器与设备
3.2试验方法
3.2.1蛹虫草多糖泡腾片制粒方式的选择
泡腾片在生产上制备方法主要有酸碱混合非水制粒、酸碱分别湿法制粒、干法制粒、直接压片和聚乙二醇包裹法等。经预实验发现,湿法制粒操作繁琐且压片效果不理想,容易造成片剂颜色不均等问题;干法制粒和直接压片制得的泡腾片容易裂片,且极易粘冲;聚乙二醇包裹法工艺制备耗费时间太长且工艺复杂;而酸碱混合非水制粒工艺简单,且压片效果最好,片剂整洁美观,颗粒流动性好,崩解完全,粘冲现象少。因此本发明选择酸碱混合非水制粒法进行蛹虫草多糖泡腾片的制备。
3.2.2蛹虫草多糖泡腾片配方筛选
3.2.2.1填充剂种类的确定
填充剂能增加泡腾片的体积和质量,兼具片剂成型作用。泡腾片的吸湿性是影响泡腾片质量和贮存时间的重要因素。如果选择了错误的填充剂,则会在制成颗粒后,表面发生发泡、软化、结块等现象。泡腾片常用的填充剂有乳糖、甘露醇、蔗糖、糊精、可溶性淀粉等,故选择这5种填充剂作为考察对象,将其分别与蛹虫草多糖混匀后制粒,考察制成颗粒的吸湿性、休止角以及颗粒成型性,筛选出合适的填充剂。
3.2.2.2泡腾剂的总量及其酸碱质量比的确定
泡腾剂由酸源和碱源组成。常用的酸源有柠檬酸和酒石酸,考虑到泡腾片的口感及制备成本,通过预实验对比发现柠檬酸的口感更好,而酒石酸价格较高并且溶于水易产生浑浊,所以柠檬酸是作为酸源的首要选择。常用的碱源有碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢钾,其中碳酸氢钾价格昂贵,而碳酸钠的味道较差,故选择碳酸氢钠作为碱源。
泡腾剂总量会影响泡腾片的外观及崩解时间,以泡腾片的外观、崩解时限、pH为评价指标,固定泡腾剂酸碱比例为1.2:1(g/g),以乳糖为填充剂制备泡腾片,考察泡腾剂总质量分数为30%、40%、50%时对泡腾片质量的影响。在筛选出泡腾剂总量后,固定蛹虫草多糖质量分数20%,润滑剂质量分数2%,考察柠檬酸与碳酸氢钠质量比为0.6:1、0.8:1、1.0:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1(g/g)时,对蛹虫草多糖泡腾片的吸湿率、崩解时限以及口感的影响,以筛选出适宜的泡腾剂酸碱比例。
3.2.2.3黏合剂的选择
本发明采用酸碱混合非水制粒法制备泡腾片,常用的非水黏合剂主要有乙醇、PEG6000乙醇溶液、PVPK30乙醇溶液。固定蛹虫草多糖添加量20%,润滑剂质量分数2%,柠檬酸与碳酸氢钠质量分数总量50%,酸碱质量比为1.2:1(g/g),分别以无水乙醇、PEG6000乙醇溶液、PVPK30乙醇溶液作为黏合剂,制粒压片,考察其软材及过筛情况、颗粒成型性、片剂的外观性状,筛选合适的粘合剂。
3.2.2.4润滑剂的种类及其用量的选择
常用的润滑剂有硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶,PEG 6000。口服泡腾片需要考虑片剂在水中溶解完全,而且溶液不浑浊,所以一般选择水溶性润滑剂。PEG 6000为水溶性润滑剂,具有优异的润滑性和抗黏性,且在水中溶解后不影响溶液的澄清度,故选用PEG 6000作为润滑剂,压片前与颗粒混合均匀。
固定蛹虫草多糖添加量为20%,柠檬酸与碳酸氢钠质量分数总量50%,酸碱质量比为1.2:1(g/g),乳糖作为填充剂,考察润滑剂PEG 6000用量0.5%、1%、2%、3%、4%对颗粒流动性、黏冲情况以及泡腾片外观的影响,筛选出合适的润滑剂用量。
3.2.2.5甜味剂的选择
口感是泡腾片的重要指标之一,尤其是中药制剂通常口感较差,矫味剂可以改善口味并增加患者的适应性。本发明泡腾片中含有的柠檬酸会使产品味道偏酸,故选择甜味剂进行矫味。为了获得较好的口感,通常选择不超过5%的天然甜味剂或不超过1%的人工甜味剂。天然甜味剂包括甜菊糖苷、蔗糖、甘露醇、山梨醇、单糖浆、蜂蜜等,人工甜味剂包括糖精钠、阿斯巴甜和甜蜜素等。甜菊糖苷是一种新型的低热值天然甜味剂,广泛应用于食品、饮料、日化、医药等行业,其甜度是蔗糖的250~300倍,甜度高、热量低、纯天然,安全性高,可以预防糖尿病、高血压等,是理想的甜味剂,故可选用甜菊糖苷作为甜味剂。以矫味效果为指标,对甜菊糖苷的用量进行考察,确定甜味剂用量。
3.2.2.6蛹虫草多糖添加量的确定
蛹虫草多糖是泡腾片的主要原料成分,它的添加量对蛹虫草多糖泡腾片的溶解效果、口感与香气有明显的影响。分别按照蛹虫草多糖添加量为10%、15%、20%、25%、30%制备蛹虫草多糖泡腾片,以泡腾片的溶解效果、口感与香气为考察指标,确定适宜的蛹虫草多糖添加量。
3.2.3正交试验优化蛹虫草多糖泡腾片配方
为了对蛹虫草多糖泡腾片配方进行优化,综合比较单因素实验的结果,选择影响最大的三个因素,即泡腾剂酸碱质量比(A)、润滑剂添加量(B)以及甜味剂添加量(C),设计如表19所示L9(34)正交试验表。以感官评价、48h时的吸湿性以及崩解时限按照0.3:0.3:0.4的权重进行综合评分,以泡腾片综合评分作为正交试验的评价指标,确定出蛹虫草多糖泡腾片的最优配方。综合评分各指标权重分配见表20。
表19正交试验因素与水平
表20加权评分表
注:Y为加权评分,Yi为所测得的数据,Ymax为所测数据的最大值,Ymin为所测数据的最小值
将不同配方的蛹虫草多糖泡腾片溶于水后,10位接受过感官实验训练的感官评审员对泡腾片进行感官评价,以色泽、组织状态、风味、口感为评价指标,对泡腾片进行评分,10人评分结果取算数平均值,作为每项处理的得分。蛹虫草多糖泡腾片的感官评价标准见表21。
表21蛹虫草多糖泡腾片感官评价标准
3.2.4蛹虫草多糖泡腾片的制备工艺流程
将蛹虫草多糖及各种辅料粉碎后过100目筛,按照优化配方量称取乳糖、柠檬酸、碳酸氢钠、甜菊糖苷,与蛹虫草多糖粉末混合均匀,用无水乙醇溶液制粒,50℃干燥,整粒,然后加入润滑剂PEG 6000,压制成规格为1.0g/片的片剂。
3.2.5蛹虫草多糖泡腾片干颗粒的测定方法
3.2.5.1休止角
休止角(θ)是评价粉末颗粒流动性的重要指标之一。休止角越小,颗粒流动性越好,越能满足生产需要。休止角测量采用经典的固定漏斗法:将漏斗固定于水平放置的绘图纸上方适宜的高度,漏斗下口距绘图纸的高度为H,小心地把粉粒倒入漏斗中,直到漏斗下形成的圆锥体的尖端接触漏斗出口为止,所形成的圆锥体与水平面间的夹角为θ,即休止角。由绘图纸上测出圆锥体底面半径R,则由tanθ=H/R可求得休止角。重复测量3次,取平均值。一般认为当粉粒的休止角θ≤30°时,其流动性良好,当θ≤40°时,可满足生产过程中的流动性需求。
3.2.5.3成型率测定
对颗粒剂粒度要求为不能通过1号筛(10目)与能过5号筛(80目)的总和,不超过15%。选用内控指标为能通过1号筛与不能通过5号筛的颗粒为合格颗粒,合格颗粒量与总颗粒量的比值即为成型率。
3.2.6蛹虫草多糖泡腾片的质量分析
3.2.6.1外观检查
随机取20片所制备的蛹虫草多糖泡腾片,将其平铺于白色瓷板上,置于白炽灯下,在距离片剂中心位置30cm处,用肉眼观察,片剂表面应光滑完整,其大小和色泽均匀。
3.2.6.2重量差异检查
参照2015版《中国药典》。
3.2.6.3崩解时限
参照2015版《中国药典》。
3.2.6.4 pH值
随机取蛹虫草多糖泡腾片10片,分别放进烧杯中,加入100mL常温蒸馏水,等待泡腾片完全溶解后搅拌均匀,然后测量各烧杯中溶液pH值。
3.2.6.5硬度考察
取样品片剂10片,用片剂硬度测定器检测泡腾片硬度。一般的片剂要求在50N以上就能合格。
3.2.6.6脆碎度考察
参照2015版《中国药典》。
3.2.6.7其他常规检查
参照2015版《中国药典》对蛹虫草多糖泡腾片进行水分、灰分、砷、铅、汞以及微生物学检查。
3.2.7蛹虫草多糖泡腾片多糖含量测定
按照3.2.3项下所得最佳配方工艺制备3批蛹虫草多糖泡腾片,采用1.2.1项下苯酚-硫酸法测定3个批次泡腾片中多糖含量。
3.2.8蛹虫草多糖泡腾片的初步稳定性研究
根据《中国药典》的规定,中药制剂应进行稳定性试验。稳定性试验的考察项目因剂型不同而不同。按照3.2.3项下所得最佳配方制备3批蛹虫草多糖泡腾片,将这三批蛹虫草多糖泡腾片密封包装(按市售包装)后,在温度为(25±2)℃、相对湿度为60%±10%的条件下放置12个月,分别于第0、3、6、9、12个月取样,按稳定性考察项目性状、含量、崩解时限、pH、微生物限度进行检测。将结果与0月药品比较以确定药品的有效期。
3.3结果与分析
3.3.1蛹虫草多糖泡腾片的配方筛选
3.3.1.1填充剂的确定
以吸湿率、休止角以及颗粒成型性为考察指标,对5种泡腾片常用填充剂进行考察,实验结果见表22。蔗糖和糊精为填充剂制成的颗粒吸湿性强,可溶性淀粉虽然吸湿率低,颗粒流动性较好,但是颗粒成型性最差,乳糖作为填充剂时,吸湿率较低,颗粒成型性好且流动性也较好,综合考虑,确定乳糖作为填充剂。
表22填充剂种类的筛选
3.3.1.2泡腾剂总量的确定
泡腾崩解剂总量质量分数对蛹虫草多糖泡腾片的外观、崩解时限以及pH的影响如表23所示。结果显示,当泡腾剂总量为50%时,蛹虫草多糖泡腾片崩解时限最短,且符合药典标准要求,溶液pH变化不大,故选择泡腾剂总量质量分数为50%。
表23泡腾剂总量对蛹虫草多糖泡腾片的外观、崩解时限以及pH的影响
3.3.1.3泡腾崩解剂酸碱质量比的确定
泡腾崩解剂柠檬酸与碳酸氢钠质量比对蛹虫草多糖泡腾片的吸湿率、崩解时限以及口感的影响如表24所示。由结果可知,当柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1.2:1时,蛹虫草多糖泡腾片吸湿率较小,崩解时限较短,口感最好,随着柠檬酸比例继续增大,虽然崩解时限缩短,但吸湿率也随之增大,口感酸涩变差,综合考虑各方面因素,选择柠檬酸与碳酸氢钠质量比1.0:1~1.4:1(g/g)进行进一步考察。
表24柠檬酸与碳酸氢钠质量比对蛹虫草多糖泡腾片的吸湿率、崩解时限以及口感的影响
3.3.1.4黏合剂的确定
以软材及过筛情况、颗粒成型性、片剂的外观性状为指标,对无水乙醇、PEG 6000乙醇溶液以及PVP K30乙醇溶液这三种常用非水黏合剂进行考察,筛选结果见表25。由结果可知,PVP K30乙醇溶液作为黏合剂时,因其粘性过大,导致颗粒结块不易过筛,同时压片时粘冲,制备出的泡腾片表面粗糙。PEG 6000乙醇溶液作为黏合剂时虽然颗粒较松散易过筛,但颗粒成型性较差,片剂表面不太光滑。无水乙醇作为黏合剂时,颗粒成型性好,易干燥而不黏结,泡腾片剂形态完整,表面光滑。因此本试验采用无水乙醇作为黏合剂。
表25粘合剂的筛选
3.3.1.5润滑剂的选择
润滑剂用量对颗粒流动性、黏冲情况以及泡腾片外观的影响结果见表26。由结果可知,当PEG6000用量为0.5%时,黏冲情况明显不能顺利出片;当润滑剂PEG6000用量增大到1%时,未出现黏冲现象,泡腾片形态完整,表面光滑,颗粒流动性也随着PEG 6000用量的增大而增大,但是当润滑剂用量增大到3%时,再继续添加润滑剂,休止角变化不大,且润滑剂加入过多时,泡腾片崩解迟缓,这可能是因为过多的润滑剂会阻碍水分进入片剂中心造成崩解时间延长。综合考虑,选择润滑剂PEG6000的添加范围为1%~3%进行后续优化实验。
表26不同PEG6000添加量对颗粒流动性、黏冲情况以及泡腾片外观的影响
3.3.1.6甜味剂的选择
甜味剂添加量对蛹虫草多糖泡腾片口感影响如表27所示。泡腾片的口感通常会受到甜味剂添加量的影响,因为甜味过浓或过淡都会使品尝者感到不舒服,因此本发明中添加的甜菊糖苷设定为1%~3%,即选取添加量为1%、2%、3%这3个水平进行后续的正交优化试验。
表27甜菊糖苷添加量对泡腾片口感的影响
3.3.1.7蛹虫草多糖添加量的确定
不同质量分数的蛹虫草多糖泡腾片分别溶解于250mL温水中,其结果见表28。结果表明,蛹虫草多糖添加量越大,溶解越缓慢困难,并且由于蛹虫草本身含有鱼腥味和涩味,当蛹虫草多糖添加过多时会导致口感不好,而添加量过少时没有蛹虫草特征味道。综合考虑,确定蛹虫草多糖添加量为20%。
表28蛹虫草多糖添加量对泡腾片的溶解效果、口感与香气的影响
3.3.2蛹虫草多糖泡腾片配方优化正交试验
泡腾片正交优化试验结果如表29所示。由结果可知,所考查的3个因素中各因素对综合评分的影响顺序是A>B>C,即泡腾剂酸碱质量比>润滑剂PEG 6000添加量>甜味剂甜菊糖苷添加量,其水平优劣次序分别为A3>A2>A1,B2>B1>B3,C3>C2>C1。对泡腾片配方优化正交试验综合评分结果进行方差分析,其结果见表30。从方差分析结果可以看出,A因素即泡腾剂酸碱质量比对综合评分具有显著影响(p<0.05),因素B(润滑剂PEG 6000添加量)与因素C(甜味剂甜菊糖苷添加量)对综合评分影响不显著。因此直观分析结合方差分析结果确定泡腾片最佳配方为A3B2C3,即泡腾剂酸碱质量比为1.4:1,润滑剂PEG 6000添加量2%,甜味剂甜菊糖苷添加量3%。
表29泡腾片配方优化正交试验结果
表20综合评分方差分析结果
3.3.3蛹虫草多糖泡腾片的质量分析
3.3.3.1外观性状
通过肉眼观察法,本品外观性状特征见表31。
表31外观性状
3.3.3.2重量差异检查
重量差异检查结果见表32。结果表明,该泡腾片的重量差异限度均在±5%以内,符合2015版《中国药典》规定。
表32重量差异检查
3.3.3.3崩解时限测定
结果如表33所示,6次测定之间的崩解时限差距不大,均在5min内崩解完全,片剂溶解在水中,无聚集的颗粒剩留。
表33崩解时限测定
3.3.3.4pH值的测定
测定结果见表34,结果表明,pH值均在4.6到4.8范围内变化。
表34蛹虫草多糖泡腾片的pH值
3.3.3.5硬度测定
硬度测定结果见表35。蛹虫草多糖泡腾片硬度适宜。
表35硬度测定
3.3.3.6脆碎度的测定
实验结果见表36。从结果可以看出,本品脆碎度检测后损失的重量均未超过1%,且均为检出断裂、龟裂及粉碎等情况,符合药典规定。
表36脆碎度测定
3.3.3.7其他常规检查
按照国家标准规定对蛹虫草多糖泡腾片进行水分、灰分、砷、铅、汞以及微生物学检查,结果见表37。
表37其他常规检查结果
3.3.4蛹虫草多糖泡腾片多糖含量测定
蛹虫草多糖泡腾片多糖含量测定结果如表38所示
表38泡腾片中多糖含量测定
3.3.5蛹虫草多糖泡腾片的稳定性试验
稳定性考察结果如表39所示。由结果可知,3个批次样品在温度为(25±2)℃、相对湿度为60%±10%的条件下外观无明显变化,崩解时限、pH值有较小波动,微生物限度均符合标准,其它考察指标未见明显变化,说明蛹虫草多糖泡腾片性质稳定。
表39稳定性考察结果
本发明对蛹虫草多糖泡腾片制备处方进行筛选并优化,分别以不同的指标作为考察对象,对填充剂、泡腾剂、黏合剂、润滑剂、甜味剂进行单因素考察。采用正交试验研究探讨了泡腾崩解剂酸碱质量比、PEG 6000添加量、甜菊糖苷添加量3个主要因素对蛹虫草多糖泡腾片制备工艺的影响,以感官评分、吸湿率、崩解时限为评价指标进行综合评分,确定最佳制备处方工艺。结果表明,泡腾剂酸碱质量比为1.4:1,润滑剂PEG 6000添加量2%,甜味剂甜菊糖苷添加量3%。
按照最佳配方制备的蛹虫草多糖泡腾片表面光滑完整,其大小和色泽均匀,味道酸甜可口,并伴有蛹虫草多糖特有香味。样品平均片重(0.997±0.015)g(RSD=1.52%),重量差异限度均在5%以内;崩解效果较好,均在5min内崩解,所得溶液平均pH值为(4.71±0.05)(RSD=1.04%);样品脆碎度小于1%,硬度均在50N以上,无断裂、龟裂、粉碎的片,各指标均符合2015年版中国药典的规定。蛹虫草多糖泡腾片中多糖的含量为(15.45±0.17)%(RSD=1.10%)。稳定性试验结果表明,3、6、9、12个月后,蛹虫草多糖泡腾片外观性状、崩解时限、pH、含量均无明显变化,稳定性较好。
本试验将蛹虫草多糖制成适合的剂型,能在一定程度上提高多糖资源利用率,为开发多糖新剂型奠定基础,同时可为食用菌制剂提供前沿的参考思路,具有较好的市场发展前景。本发明确定的泡腾片制备工艺操作方便、简单,黏冲少,出片顺利。
Claims (9)
1.一种蛹虫草多糖泡腾片制备方法,其特征在于,所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法包括:
采用热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取,并对提取的蛹虫草粗多糖进行分离纯化;
将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片。
2.如权利要求1所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法,其特征在于,所述热水浸提法进行蛹虫草粗多糖的提取包括:
(1)将蛹虫草在60℃真空干燥箱中放置24h,取出后粉碎、过80目筛;
(2)准确称取蛹虫草粉末2g,按照料液比1:20的比例加入蒸馏水,于90℃水浴锅中浸提1.5h后,3000r/min离心10分钟,收集上清液,固体沉淀重复提取3次;
(3)上清液浓缩后加入无水乙醇至醇浓度为80%,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到粗多糖。
3.如权利要求1所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法,其特征在于,所述蛹虫草粗多糖分离纯化方法包括:
1)DEAE-52填料预处理:称取100g的DEAE-52离子交换剂填料于烧杯中,加入大量蒸馏水洗涤除去表面杂质;将洗涤后的离子交换剂浸泡在0.5mol/L的HCl溶液中2h,用去离子水洗至中性,抽干,再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h,洗涤,抽干,真空干燥即获得处理好的DEAE-52;将填料真空干燥并再次置于蒸馏水中使用;
2)样品预处理:在蛹虫草粗多糖中加入多糖体积1/4的Sevage试剂,离心,并重复操作多次;用1.5%的活性炭对粗多糖进行脱色,加入4倍体积的无水乙醇,4℃下放置过夜,分别用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,沉淀物真空冷冻干燥得到除去蛋白质和色素的蛹虫草粗多糖;
3)样品纯化分离:采用湿法上样,打开柱出液口,先加入1/3柱高的蒸馏水,再加入DEAE-52填料,并进行搅拌;装料完成后将柱出液口关闭,取预处理过的蛹虫草粗多糖样品500mg,用蒸馏水配制成50mg/mL的粗多糖溶液后,上柱;用蒸馏水和0.2mol/L~1.0mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为2mL/min,10mL/管收集洗脱液,每管取100μL洗脱液,测定吸光度值,以管数作为横坐标,相应的吸光度值作为纵坐标绘制洗脱曲线;根据洗脱曲线收集不同吸收峰段的多糖组分,将多糖组分洗脱液减压浓缩至原体积的1/4,再3000Da下透析48h,真空冷冻干燥得蛹虫草多糖;
4)取30mg得到的蛹虫草多糖,溶解于2mL蒸馏水中,5000r/min离心后上样,分别用蒸馏水和0.1mol/L的NaCl溶液进行洗脱,流速设置为0.5m L/min,10mL/管收集洗脱液,合并主要洗脱峰的洗脱液,浓缩,透析,真空冷冻干燥后得纯蛹虫草多糖。
4.如权利要求3所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法,其特征在于,所述步骤4)之前还需进行:
首先,称取Sephadex G-100葡聚糖凝胶10g于烧杯中,加入蒸馏水过夜使其充分溶胀后,倾去上层悬浮颗粒,蒸馏水保存备用;
其次,将层析柱垂直固定在铁架台上,柱内加入1/3柱高的蒸馏水,将已活化的填料经脱气处理后缓慢加入柱中并进行搅拌,柱面平整,无气泡后,用洗脱缓冲液平衡过夜。
5.如权利要求1所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法,其特征在于,所述将纯化后的蛹虫草多糖制备成泡腾片包括:
将蛹虫草多糖粉碎后过100目筛,按比例称取乳糖、柠檬酸、碳酸氢钠、甜菊糖苷,与蛹虫草多糖粉末混合均匀,用无水乙醇溶液制粒,于50℃干燥,整粒,然后加入润滑剂PEG6000,压制成规格为1.0g/片的片剂即可。
6.一种利用如权利要求1-5任意一项所述蛹虫草多糖泡腾片制备方法制备得到的蛹虫草多糖泡腾片,其特征在于,所述蛹虫草多糖泡腾片按照质量分数由20%的蛹虫草多糖、50%的柠檬酸与碳酸氢钠、2%的润滑剂PEG 6000、3%的甜菊糖苷以及乳糖组成。
7.如权利要求6所述的蛹虫草多糖泡腾片,其特征在于,所述柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1.4:1。
8.如权利要求6所述的蛹虫草多糖泡腾片,其特征在于,所述泡腾剂总量为50%。
9.一种如权利要求6所述蛹虫草多糖泡腾片在改善保护肝细胞损伤药物中的应用。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114015108A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-02-08 | 中国海洋大学 | 一种粗茶提取物/壳寡糖纳米粒子泡腾膏材料、制备方法及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085704A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-25 | 上海瑞丰农业科技有限公司 | 一种蛹虫草活性多糖的制备方法 |
CN109907200A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-21 | 上海市农业科学院 | 一种虫草泡腾片及其制备方法 |
CN111172216A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-19 | 华南师范大学 | 一种具有抑制巨噬细胞分泌no功能的蛹虫草多糖及其制备方法与应用 |
CN111228236A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-05 | 枣庄学院 | 一种富硒北虫草多糖泡腾片的制备方法 |
-
2020
- 2020-09-14 CN CN202010963222.9A patent/CN112076175A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085704A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-11-25 | 上海瑞丰农业科技有限公司 | 一种蛹虫草活性多糖的制备方法 |
CN109907200A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-21 | 上海市农业科学院 | 一种虫草泡腾片及其制备方法 |
CN111172216A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-19 | 华南师范大学 | 一种具有抑制巨噬细胞分泌no功能的蛹虫草多糖及其制备方法与应用 |
CN111228236A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-05 | 枣庄学院 | 一种富硒北虫草多糖泡腾片的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
樊桂灵 等: "蛹虫草提取物泡腾片的制备工艺优化及其质量分析", 《食品研究与开发》 * |
陈安徽 等: "蛹虫草多糖的提取及抗氧化活性研究", 《安徽农业科学》 * |
项玥 等: "蛹虫草菌丝体胞内多糖热水浸提工艺探究", 《食品研究与开发》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114015108A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-02-08 | 中国海洋大学 | 一种粗茶提取物/壳寡糖纳米粒子泡腾膏材料、制备方法及应用 |
CN114015108B (zh) * | 2021-12-01 | 2022-07-12 | 中国海洋大学 | 一种粗茶提取物/壳寡糖纳米粒子泡腾膏材料、制备方法及应用 |
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