CN112516218B - 一种熟地黄中类黑精及其应用 - Google Patents

一种熟地黄中类黑精及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及熟地黄类黑精的制备方法及其应用，该方法以熟地黄为原料，纯水回流提取，经80%乙醇沉淀，去上清液，将沉淀溶解，60℃下D202树脂吸附6 h，采用稀盐酸洗脱，透析得到熟地黄类黑精。本发明通过药效学实验发现，熟地黄类黑精具有促进骨髓造血功能恢复功能，可用于与造血功能缺失的相关疾病的治疗用途，包括慢性再生障碍性贫血，失血性贫血，化疗后骨髓抑制等。

Description

一种熟地黄中类黑精及其应用
技术领域
本发明属于化学医药领域，涉及熟地黄类黑精的制备和医药用途。
背景技术
熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的根茎经蒸制加工炮制而成，炮制过后的熟地黄药性由清转补，由寒转温，起到了滋阴补血，填精益髓的功效。现代临床研究同样证实熟地黄及其制剂具有改善慢性再生障碍性贫血等造血功能障碍相关疾病。熟地黄中含有单糖，寡糖，多糖，苯乙醇苷，呋喃醛衍生物等多种化学成分，其中粗多糖组分被认为是熟地黄补血功效的主要物质基础。由于粗多糖组分分离方法和效率的局限，多糖组分中可能混杂大量非多糖类物质，因此，熟地黄补血功效的物质基础仍不确切。
类黑精是糖类等羰基化合物与氨基酸或蛋白质等氨基化合物之间通过美拉德反应而生成的一类聚合度不等的高分子混合物，且具备明显的褐变特征。类黑精广泛存在于食品与药材的储藏与热处理过程中，具有抗氧化，抗菌，抗肿瘤等多种药理活性。地黄在经清蒸或酒蒸为熟地黄后，外观颜色由棕黄色转变为黑色，并生成大量的5-羟甲基糠醛等美拉德反应中间产物，提示蒸制过程中可能产生大量的类黑精物质。然而，由于类黑精物质极性与分子量较大，在地黄的水提醇沉过程中易与多糖等物质共沉淀，因此，粗多糖组分中可能混杂大量类黑精物质，其是否为熟地黄补血的功效物质基础有待考究。本发明建立分离制备熟地黄类黑精方法，通过组分“敲出-敲入”策略，首次考察并发现了类黑精为熟地黄补血的主要物质基础。
发明内容
本发明的目的为提供熟地黄类黑精的用途，及操作简便，成本低的熟地黄类黑精的提取分离方法。
一种熟地黄类黑精，其特征在于按如下方法制备获得，具体步骤如下
A、取熟地黄饮片加水煎煮，提取液回收溶剂至每1mL浓缩液有1g生药材，加入无水乙醇调节乙醇浓度为80％，搅拌，静置，沉淀，弃去上清，沉淀加水溶解；
B、经离子交换树脂处理，获得稀酸洗脱液，调节pH至中性，浓缩，透析，冷冻干燥获得熟地黄类黑精。
所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于，步骤A中所述的煎煮提取方法为：以药材8-12倍量水，煎煮提取40-60min，过滤，加入6-8倍量水，煎煮提取30-60 min。
所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于，步骤B中加入D202强碱型阴离子交换树脂，恒温吸附条件为摇床速率60-120r/min，温度40-60℃，吸附时间为 2-6h而后将树脂与溶液装柱，纯水洗脱，浓缩，采用稀酸溶液洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，加入碱液，调节pH为中性，浓缩，置于500Da透析袋中，流水透析3d，浓缩，制备得到熟地黄类黑精，-20℃保存备用；其中所述的稀酸为盐酸溶液，所述碱液为NaOH溶液。
所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于，步骤B中所述的树脂用量与熟地黄生药量比为2:1-10:1。
所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于，稀酸浓度为0.5-0.1mol/L。
所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于，透析袋分子量为500Da。
所述的熟地黄为玄参科植物Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜块根，经晒至八成干后得生地黄，后采用绍兴黄酒“九蒸九晒”制得熟地黄，即生地黄加入 30％黄酒拌匀，置于蒸锅隔水蒸制6h，取出晒至外皮粘液晒干，后反复蒸制9 次获得熟地黄。
所述熟地黄类黑精在制备治疗或预防造血功能障碍药物中的应用。
具体来说
所述的熟地黄类黑精由如下方法制备获得，其具体步骤如下：
(1)取熟地黄药材，剪碎，加入10倍量纯水浸泡1h，而后煎煮40min，过滤并收集提取液，再次加入8倍量纯水煎煮30min，合并两次滤液，旋转蒸发浓缩，相当于每1mL浓缩液中有1g生药材。
(2)取上述提取物置于烧杯中，加入无水乙醇，调整乙醇浓度为80％，置于4℃冰箱中静置24h，反复2次，沉淀用80％乙醇洗涤后，冷冻干燥，得到熟地黄大分子部位，备用。
(3)取熟地黄大分子部位冻干粉，加水溶解，加入D202大孔树脂，于摇床中动态吸附6h，将树脂与溶液装柱，纯水洗脱4个柱体积，后采用HCl溶液洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，加入NaOH溶液，调节pH为中性，旋转蒸发浓缩，置于500Da透析袋中，流水透析3d，浓缩，制备得到熟地黄类黑精组分。
优选地，步骤(2)乙醇浓度为80％。
优选地，步骤(3)D202强碱阴离子交换树脂吸附。
优选地，步骤(3)摇床转速120r/min。
优选地，步骤(3)摇床温度为60℃。
优选地，步骤(3)HCl溶液洗脱。
优选地，步骤(3)透析袋规格500Da。
所述熟地黄类黑精为片剂，胶囊剂，丸剂，水剂或颗粒剂等口服制剂。
有益效果
本发明首次发现熟地黄类黑精在用于制备治疗或预防造血功能障碍药物中的用途。药理实验结果表明，熟地黄类黑精组分能显著提高骨髓抑制小鼠外周血中白细胞计数，红细胞计数及血红蛋白含量，同时显著改善骨髓有核细胞数，表明熟地黄类黑精促进造血功能强。
附图说明
图1为熟地黄大分子部位不同组分的HPGPC-ELSD-DAD图谱(A： HPLC-ELSD检测；B：HPLC-DAD检测，波长为420nm；HMW：大分子部位组，F1：F1组分，F2：类黑精组分)。
图2为熟地黄提取物中F2组分(类黑精)的元素分析。
图3为熟地黄提取物中F2组分(类黑精)的紫外-可见光分析图谱。
图4为熟地黄提取物中F2组分(类黑精)的傅里叶红外变换光谱分析。
图5为熟地黄提取物不同化学组分对环磷酰胺诱导的血虚小鼠外周血象的影响(A：外周白细胞计数；B：外周红细胞计数；C：血红蛋白含量；D：外周血小板计数；E：红细胞压积；Control:空白组，Model：模型组，PRR：熟地黄提取物组，HMW：大分子部位组，F1：F1组分，F2：类黑精组，F1+F2：F1组分与类黑精联用组，rhG-CSF：重组人粒细胞刺激因子注射液组；n＝8-10；#p<0.05， ##p<0.01，###p<0.001，与空白组比较；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与模型组比较)。
图6为熟地黄提取物不同化学组分对环磷酰胺诱导的血虚小鼠有核细胞数的影响(Control:空白组，Model：模型组，PRR：熟地黄提取物组，HMW：大分子部位组，F1：F1组分，F2：类黑精组分，F1+F2：F1组分与类黑精联用组， rhG-CSF：重组人粒细胞刺激因子注射液组；n＝8；###p<0.001，与空白组比较； *p<0.05，与模型组比较)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
熟地黄类黑精的提取分离及化学表征
一、实验仪器与试剂
1260infitiny高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Alltech 3300ELSD 检测器(美国Grace公司)；DAD检测器(安捷伦科技有限公司)；元素分析仪 (德国elementar公司)；Tensor 27傅里叶红外光谱仪(德国Bruker公司)；超纯水处理系统(美国Millipore公司)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(巩义市英峪高科仪器厂)。
鲜地黄采自河南省焦作市武陟县，经中国药科大学余伯阳教授鉴定为玄参科植物Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜块根，经晒至八成干后得生地黄，后采用绍兴黄酒“九蒸九晒”制得熟地黄，即生地黄加入30％黄酒拌匀，置于蒸锅隔水蒸制6h，取出晒至外皮粘液晒干，后反复蒸制9次。D202型大孔强碱II型阴离子交换树脂(郑州和成新材料有限公司)；透析袋500Da(美国Union Carbide 公司)；无水乙醇，盐酸和氢氧化钠(南京化学试剂厂)。
二、实验方法
1、熟地黄水提物的制备：取熟地黄250g，10倍量纯水浸泡60min，而后煎煮40min，过滤并收集提取液，再次加入8倍量纯水煎煮30min，合并两次提取液，50℃旋转蒸发至250mL，相当于每1mL浓缩液有1g生药材。
2、熟地黄提取物大分子部位的制备：取步骤1中浓缩液150mL于烧杯中，沿杯壁缓慢加入无水乙醇，调整乙醇浓度为80％，同时使用磁力搅拌器不断搅拌，置于4℃冰箱中静置24h，将上清液倒出，80％乙醇溶液洗涤沉淀2次，反复2 次，将沉淀加入纯水溶解并定容至150mL，得到熟地黄提取物大分子部位。
3、熟地黄类黑精的分离制备：取步骤2中熟地黄提取物大分子部位100mL，加入500g D202强碱型阴离子交换树脂，于60℃摇床中120r/min动态吸附6h，而后将树脂与溶液装柱，纯水洗脱4个柱体积，浓缩至100mL，记为组分F1，采用HCl溶液洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，加入NaOH溶液，调节pH为中性，浓缩至100mL，置于500Da透析袋中，流水透析3d，浓缩，制备得到F2 组分为熟地黄类黑精，-20℃保存备用。
4、HPGPC-ELSD-DAD检测熟地黄中类黑精组分：
(1)供试品溶液的制备
取上述熟地大分子部位，及其组分F1和组分F2各50μL，加入950μL纯水，过0.45μm滤膜，制备得到不同组分分析样品。
(2)色谱条件
通过系统适应性考察，优化色谱条件为：色谱柱为TSK gel G4000PWXL(7.8 mm×300mm I.D.，10μm)，以纯水为流动相等度洗脱，流速：0.5mL/min，分析时间30min，柱温30℃，进样量：5μL，ELSD条件参数设置为：漂移管温度100℃，载气流速：2.3L/min，DAD检测波长为420nm。
5、C，H，N，O元素测定：精密称取F2组分冻干粉适量，采用元素分析仪测定其中C，H，N，O含量。
6、紫外-可见光光谱分析：取F2组分溶液50μL，加入纯水定容至10mL，制备待测样品。使用纯水调零，光径1cm，采用紫外-可见光分光光度计，选取波段为200-800nm进行扫描。
7、傅里叶红外变换光谱(FT-IR)分析：F2组分的红外光谱分析采用KBr 压片法，称取100mg KBr粉末，研磨均匀，干燥箱中干燥后使用压片机压成薄片。称取1mg F2组分冻干粉末，与已干燥的KBr粉末共同研磨均匀，使用压片机压制成薄片。使用制备得到的KBr薄片为空白进行基线调整，再采用含有F2 组分的KBr薄片进行光谱测定，以4000-400cm-1作为扫描范围。
三、实验结果
1、熟地黄大分子部位中不同组分的HPGPC-ELSD-DAD分析
对熟地黄提取物大分子部位进行分离，通过HPGPC-ELSD-DAD检测分析，图谱如图1所示。ELSD检测结果表明熟地黄大分子部位中主要存在F1和F2两个组分，经阴离子交换树脂吸附洗脱后，F1组分和F2组分达到良好分离，且 F2组分分子量较F1组分大。DAD检测结果表明熟地黄大分子部位中仅F2组分在420nm处有吸收，表明F2组分为熟地黄大分子部位中的褐变组分。
2、熟地黄提取物中F2组分所含C，H，N，O的含量如图2所示。结果表明，本研究所制备的F2组分中C的含量为45.92％，O的含量为41.99％，H的含量为5.64％，该组分中含有N元素，表明F2组分可能为非多糖的褐变物质。
3、熟地黄F2组分的紫外-可见光吸收光谱如图3所示。该组分在紫外区有强吸收，且随波长的增加吸光度逐渐减小，无明显的吸收峰，呈现典型的“尾巴模式”，与Hofmann[1]对不同来源的类黑精紫外-可见光分析结果基本一致，表明 F2组分可能为地黄炮制过程中美拉德反应而产生的类黑精成分。
4、红外光谱可以表征化合物结构中的主要官能团信息。本实验所检测的F2 组分可能是一类分子量较大的复合物，因此其吸收峰都是由多种官能团振动形成的。红外光谱中4000-1300cm-1频率范围为官能团区，吸收峰较强，且较稀疏易于辨认，常用于官能团的鉴别。F2组分的红外光谱信息如图4所示，3400cm-1左右出现峰形较宽的强吸收峰，为酰胺基N-H、醇羟基分子间氢键O-H的伸缩振动产生；在2930cm-1附近出现中等强度吸收峰为烷烃基C-H伸缩振动信号； 1620cm-1左右出现吸收峰，峰形较宽，为胺基变形振动，酰胺基C＝O、烯烃基 C＝C的伸缩振动所产生；在1150cm-1和1080cm-1附近有吸收峰，分别为醇羟基 C-O和C-N伸缩振动产生；1100-1000cm-1处吸收峰部分由C-CH3的弯曲和骨架振动参与形成。综上所述，F2组分中可能含有烷基，醇羟基，酰胺基，烯烃，胺类等官能团，与已报道的多种类黑精结构研究结果基本一致[2,3]，表明F2组分为熟地黄类黑精。
实施例2：
熟地黄类黑精组分的补血作用研究
一、实验目的
观察熟地黄类黑精是否具有促进骨髓造血功能的作用。
二、实验动物
清洁级雄性ICR小鼠，体重为18-22g，购于扬州大学医学比较中心，许可证号：SCXK(苏)2017-0007。动物置于温度为24±1℃，65％湿度环境中饲养，昼夜交替的独立环境中，通风良好，给予自由饮食饮水。实验开始前适应实验环境，排除环境因素对实验的干扰，对实验动物所有的操作与处理均符合中国药科大学动物伦理委员会要求。
三、实验药物
“九蒸九晒”熟地黄(自制)。rhG-CSF(重组人粒细胞刺激因子注射液)(齐鲁制药有限公司)；生理盐水(华润双鹤药业股份有限公司)；氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾(西陇化工股份有限公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；EDTA-2Na(南京生兴生物技术有限公司)；注射用环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司)；
四、实验方法
1、动物分组：ICR小鼠，按照体重随机分为8组，分别为：空白组，模型组，熟地黄提取物(PRR)，大分子部位组(HMW)，组分F1(F1)，类黑精组分(F2)，组分1+类黑精组分(F1+F2)，阳性药组(rhG-CSF)。
药物剂量：熟地黄提取物剂量，受试药物剂量均按其在熟地黄中的含量进行折算，相当于生药量9g/kg。阳性药物采用rhG-CSF，给药剂量为10μg/kg。
2、模型建立及给药：小鼠连续腹腔注射给予40mg/kg环磷酰胺5d建立骨髓抑制血虚小鼠模型，造模同时给予受试药物干预，熟地黄提取物及各药物给药途径均为灌胃，阳性药物给药途径为皮下注射，空白组与模型组给予等量生理盐水，0.1mL/10g/d，给药共8d。
3、外周血象检测：于第9d，使用眼科镊摘取小鼠眼球，取小鼠外周全血，滴入预先加入EDTA-2Na抗凝剂的1.5mL EP管中，使其与抗凝剂充分混匀，用Sysmex XN100型全自动血细胞分析仪进行外周血象分析。
4、骨髓有核细胞计数：给药周期结束后次日，脱颈椎处死小鼠，用75％酒精浸泡5min，将其置于超净工作台中，取出右侧股骨，剔除周围组织及肌肉，剪开股骨两端，使骨髓腔暴露。取7号针头，使用2mL PBS将骨髓腔中的骨髓细胞冲出，用细胞筛过滤多余杂质，1500rpm离心5min，弃上清，再次加入1 mL PBS溶液，过4号针头，制备骨髓单细胞悬液。将制备的骨髓单细胞悬液转移至2mL EP管中，2000rpm离心5min，弃上清，加入红细胞裂解液，2000rpm 离心5min，弃上清，加入1mL PBS，稀释100倍后吸取10μL已稀释的细胞悬液冲入细胞计数板，静置1min待细胞沉降后，置于倒置显微镜下，按细胞计数法计数骨髓有核细胞数。
5、统计与分析：数据以Graphpad Prism 7软件进行统计分析，结果以mean ±SEM表示，采用方差分析对各组数据进行比较，对于两组间的数据比较采用 Student’s检验，三组以及三组以上的数据比较分析采用Dunnett’s检验，p<0.05 表示具有统计学差异。
五、实验结果
1、熟地黄提取物及其不同组分对血虚小鼠外周血象的影响：如图5所示， PRR提取物及不同化学组分对血虚小鼠外周血象的影响存在差异。与模型组相比，PRR提取物可以显著改善模型小鼠外周红细胞计数，血红蛋白及红细胞压积(p<0.05)，对白细胞计数有一定的改善作用，但本实验中未见显著差异 (p>0.05)；PRR大分子部位可升高白细胞计数，红细胞计数，血红蛋白及红细胞压积(p<0.05)，其中F1组分仅对血红蛋白有改善作用(p<0.05)，类黑精组分(F2)对于血虚小鼠白细胞计数，红细胞计数，血红蛋白含量及红细胞压积均有显著改善作用(p<0.05)，且同时给予模型小鼠F1与F2干预后能升高血虚小鼠外周血中白细胞，红细胞和血红蛋白含量(p<0.05)，并升高红细胞压积 (p<0.05)。该结果表明，类黑精F2组分是PRR改善血虚小鼠外周血象的主要功效组分。
2、熟地黄提取物及其不同组分对血虚小鼠骨髓有核细胞数的影响：如图6 所示，模型组小鼠骨髓有核细胞数显著降低(p<0.001)，表明骨髓抑制血虚小鼠模型复制成功。给予PRR及其不同化学组分后，PRR和类黑精组分F2可显著升高骨髓有核细胞数(p<0.05)，F1组分无明显改善作用(p>0.05)，HMW组与F1+F2组均有一定的改善作用，但未见统计学差异(p>0.05)。该结果表明，熟地黄中类黑精F2组分是改善骨髓造血功能抑制的主要活性组分。
六、实验结论
熟地黄类黑精可促进骨髓造血功能。
参考文献：
[1]Hofmann,Thomas.Studies on the Relationship between MolecularWeight and the Color Potency of Fractions Obtained by Thermal Treatment ofGlucose/Amino Acid and Glucose/Protein Solutions by Using Ultracentrifugationand Color Dilution Techniques[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998, 46(10):3891-3895。
[2]Mohsin G F,Schmitt F J,Kanzler C,et al.Structural characterizationof melanoidin formed from D-glucose and L-alanine at different temperaturesapplying FTIR,NMR,EPR,and MALDI-ToF-MS[J].Food Chemistry,2018,245:761-767。
[3]王明慧， 糯米藕非酶褐变及其产物的分离、初步鉴定和抗氧化研究与褐变控制[D]， 江苏南京：南京农业大学,2015。

Claims (3)

1.一种熟地黄类黑精，其特征在于按如下方法制备获得，具体步骤如下
A、取熟地黄饮片加水煎煮，提取液回收溶剂至每1 mL浓缩液有1 g 生药材，加入无水乙醇调节乙醇浓度为80%，搅拌，静置，沉淀，弃去上清，沉淀加水溶解；
B、经离子交换树脂处理，获得稀酸洗脱液，调节pH至中性，浓缩，透析，冷冻干燥获得熟地黄类黑精;
步骤A中所述的煎煮提取方法为：以药材8-12倍量水，煎煮提取40-60 min，过滤，加入6-8倍量水，煎煮提取30-60 min;
步骤B中加入D202强碱型阴离子交换树脂，恒温吸附条件为摇床速率60-120 r/min，温度40-60 °C，吸附时间为2-6 h而后将树脂与溶液装柱，纯水洗脱，浓缩，采用稀酸溶液洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，加入碱液，调节pH为中性，浓缩，置于500 Da透析袋中，流水透析3d，浓缩，制备得到熟地黄类黑精，-20 °C保存备用；其中所述的稀酸为盐酸溶液，所述碱液为NaOH溶液;
步骤B中所述的树脂用量与熟地黄生药量比为2:1-10:1；
稀酸浓度为0.5-0.1 mol/L;
透析袋分子量为500 Da。
2.根据权利要求1所述的一种熟地黄类黑精，其特征在于所述的熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜块根，经晒至八成干后得生地黄，后采用绍兴黄酒“九蒸九晒”制得熟地黄，即生地黄加入30%黄酒拌匀，置于蒸锅隔水蒸制6 h，取出晒至外皮粘液晒干，后反复蒸制9次获得的熟地黄。
3.权利要求1或2所述熟地黄类黑精在制备治疗或预防造血功能障碍药物中的应用。
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