CN107412730A

CN107412730A - 一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法

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Publication number: CN107412730A
Application number: CN201710287433.3A
Authority: CN
Inventors: 丁伟; 柯李晶; 周建武; 饶平凡
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN107412730B

Abstract

本发明公开了一种地黄蛋白及其纳米颗粒的制备方法，颗粒由两个蛋白组成，两个地黄蛋白的N‑端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R‑E‑K‑D‑I‑A‑G‑A‑V‑Q‑T‑V和SEQ ID NO:2：R‑E‑K‑D‑I‑V‑X。本发明涉及的地黄蛋白提取分离于鲜地黄、生地黄或熟地黄中，在这些传统使用的地黄原料中稳定存在；其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用地黄为原料加以传统热加工工艺制作的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的地黄蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望与其它原料配伍，高效协同发挥作用。

Description

一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

近几十年来，纳米颗粒研究广泛，经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质（光学、电学、表面活性等）均会呈现与原始材料截然不同的性质，有靶向性和穿透性等优点的同时，也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。目前应用于纳米药物载体研究的生物大分子（如血清白蛋白、丝蛋白等）皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。

地黄是一种我国人民长期使用的食品原料和中药药材，地黄在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。地黄来源于玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosaLibosch）的块根，具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保护胃粘膜、抗衰老等药理作用，临床上用于止血，并用于治疗糖尿病、心脑血管疾病及高血压等。鲜地黄中梓醇含量较高，约为5.33%，相当于生地黄的10倍，熟地黄的35倍，鲜地黄和生地黄性寒，味甘苦，清热生津，凉血止血，养阴生津；熟地黄糖基化蛋白含量高，性微温，味甘，滋阴补血，益精填髓。由于地黄药理作用的多样性及临床应用的广泛性，值得进一步深入研究和开发。但是到目前为止，有关地黄蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的地黄蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒存在于各种传统加工汤剂中被广泛服用。本发明得到的地黄蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了极低毒性，强抗氧化活性，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种地黄蛋白纳米颗粒，由两个地黄蛋白组成，由13个地黄蛋白DHP1单体和11个地黄蛋白DHP2单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒；所述的地黄蛋白DHP1和DHP2的N-端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X。

2、根据权利要求1所述的一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒其平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV。

所述的地黄蛋白分子量分别为26.2 kDa（DHP1）和18.1KDa（DHP2）；等电点分别为8.0（DHP1）和5.2（DHP2）。

两个地黄蛋白的提取方法，经过磷酸盐缓冲液水相抽提后，DHP1经过弱阳离子交换色谱CM-Sephadex C-50和高效液相色谱Souce-15Q分离；DHP2经过两步POROS 20 MicronHP2疏水色谱分离，从地黄中得到两个电泳纯的地黄蛋白。其具体包括以下步骤：

1）地黄蛋白粗提液的制备：鲜地黄经榨汁机、生地或熟地黄原料经高速粉碎机将其磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液混合均匀，置于4 ℃，搅拌浸提24 h；用8层纱布过滤得到的地黄浸提液，弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经15000rpm离心20 min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向地黄蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%,待完全溶解后，4℃下静置4 h，以12000 rpm离心20 min，收集上清液;继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为80% ，待固体全溶解后，4 ℃下放置4h，15000 rpm离心20 min，收集沉淀。沉淀用0. 2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0磷酸缓冲液透析12h，将透析液在15000 rpm，4℃条件下，离心20 min，收集上清液，得到的溶液即为地黄蛋白粗提液。

）地黄蛋白DHP1的离子交换色谱分离：将100mL地黄蛋白初提液流加至以0.02mol/L，pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液平衡的CM-Sephadex C-50弱阳离子常压色谱柱，以同样浓度醋酸-三水合醋酸钠缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液线性梯度洗脱300 mL，最后用1 mol/LNaCl 的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液洗脱1个柱体积，流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。

将经CM-Sephadex C-50分离且透析过的P0蛋白组分进一步用Source-15Q高效液相色谱柱进行分离，5ml加至以0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液平衡的Source-15Q色谱柱，以同样浓度的磷酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液线性梯度洗脱20 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。

）地黄蛋白DHP2的二步疏水色谱分离：将地黄蛋白粗提液进一步用疏水色谱POROS20 Micron HP2进行纯化，疏水色谱柱以含有2 mol/L （NH4）2SO4的0.02 mol/L,pH7磷酸缓冲液平衡，以2～0 mol/L（NH4）2SO4的0.02 mol/L，pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行线性梯度洗脱。流速2.0 mL/min，上样量：5 mL，紫外检测波长280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；将第一次疏水色谱分离得到的蛋白组分按上述相同条件进行第二次疏水色谱分离，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

4）地黄蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的地黄蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该地黄蛋白的等电点，以Edman degradation测定该地黄蛋白的N-端一级结构序列。

所述的地黄蛋白纳米颗粒的制备方法包括：将该地黄蛋白配制为1 mg/mL的pH6.5盐溶液，经过70℃加热1小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的地黄蛋白，即获得地黄蛋白纳米颗粒。并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对地黄蛋白纳米颗粒进行性质研究，本发明制备得到的地黄蛋白纳米颗粒平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV。

地黄蛋白纳米颗粒在体外显示了极低的细胞毒性，明显抗氧化活性。

所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。

本发明的优点在于：该地黄蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。本发明涉及的地黄蛋白提取分离于鲜地黄、生地黄或熟地黄中，在这些传统使用的地黄原料中稳定存在；其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用地黄为原料加以传统热加工工艺制作的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的地黄蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望与其它原料配伍，高效协同发挥作用。

附图说明

图1地黄蛋白粗提液离子交换色谱CM-Sephadex C-50色谱图。

图2地黄蛋白粗提液离子交换色谱CM-Sephadex C-50各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。

图3地黄蛋白高效液相色谱Source-15Q色谱图。

图4地黄蛋白高效液相色谱Source-15Q各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。

图5地黄蛋白粗提液一步疏水色谱POROS 20 Micron HP2色谱图。

图6地黄蛋白一步疏水色谱POROS 20 Micron HP2各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。

图7地黄蛋白二步疏水色谱POROS 20 Micron HP2色谱图。

图8地黄蛋白二步疏水色谱POROS 20 Micron HP2各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。

图9地黄蛋白纳米颗粒的电镜观察图。

图10地黄蛋白纳米颗粒粒径分布图。

图11地黄蛋白纳米颗粒细胞毒性，MDCK为狗肾上皮细胞。

图12地黄蛋白纳米颗粒DPPH抗氧化活性测定。

具体实施方式

实施例1 ：地黄蛋白DHP1的提取

鲜地黄经榨汁机磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提24 h；用8层纱布过滤得到的地黄浸提液，弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经15000rpm离心20 min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向地黄蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置4 h，以12000 rpm离心20min，收集上清液;继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为80% ，待固体全溶解后，4℃下放置4h，15000 rpm离心20 min，收集沉淀。沉淀用0. 2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0磷酸缓冲液透析12h，将透析液在15000 rpm，4℃条件下，离心20min，收集上清液，得到的溶液即为地黄蛋白粗提液。

将100mL地黄蛋白初提液流加至以0.02 mol/L，pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液平衡的CM-Sephadex C-50弱阳离子常压色谱柱，以同样浓度醋酸-三水合醋酸钠缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液线性梯度洗脱300 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液洗脱1个柱体积，流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定见附图1和2。

将经CM-Sephadex C-50分离且透析过的P0蛋白组分进一步用Source-15Q高效液相色谱柱进行分离，5ml加至以0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液平衡的Source-15Q色谱柱，以同样浓度的磷酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液线性梯度洗脱20 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定见附图3和4。地黄蛋白DHP1基本生化性质，其特征为分子量26.2kDa、等电点为8.0，N-端一级结构序列为R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V。

实施例2 ：地黄蛋白DHP2的提取

熟地黄经高速粉碎机磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液混合均匀，置于4 ℃，搅拌浸提24 h；用8层纱布过滤得到的地黄浸提液，弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经15000rpm离心20 min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向地黄蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%,待完全溶解后，4℃下静置4 h，以12000 rpm离心20min，收集上清液;继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为80% ，待固体全溶解后，4℃下放置4h，15000 rpm离心20 min，收集沉淀。沉淀用0.2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0磷酸缓冲液透析12h，将透析液在15000 rpm，4℃条件下，离心20min，收集上清液，得到的溶液即为地黄蛋白粗提液。

将地黄蛋白粗提液进一步用疏水色谱POROS 20 Micron HP2进行纯化，疏水色谱柱以含有2 mol/L （NH4）2SO4的0.02 mol/L,pH7磷酸缓冲液平衡，以2～0 mol/L（NH4）2SO4的0.02 mol/L，pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行线性梯度洗脱。流速2.0 mL/min，上样量：5 mL，紫外检测波长280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定见附图5和6；

将第一次疏水色谱分离得到的P0蛋白组分按上述相同条件进行第二次疏水色谱分离，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定见附图7和8；地黄蛋白DHP2基本生化性质，其特征为分子量18.1kDa、等电点为5.2，N-端一级结构序列为R-E-K-D-I-V-X。

实施例3 ：地黄蛋白纳米颗粒的制备

将该地黄蛋白配制为1 mg/mL的pH6.5盐溶液，经过70℃加热1小时，应用TSK gelG6000PW凝胶色谱去除未反应的地黄蛋白，即获得地黄蛋白纳米颗粒。并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对地黄蛋白纳米颗粒进行性质研究。地黄蛋白纳米颗粒电镜观察图见附图9。

用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV，地黄蛋白纳米颗粒粒度分布图见附图10。

实施例4 ：地黄蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性测定

采用了狗肾上皮细胞（MDCK）测定地黄蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性。细胞使用含20%小牛血清RPMI1640培养液，于37℃，5% CO2培养环境中培养。测定时，细胞按4×10⁴个/mL接于96孔板，200 µL /孔，每组设6个平行孔。培养24小时，弃去培养基，将已倍比稀释后的样品以每孔100 μL量加入。同时加不含血清的培养基100 µL，用做空白对照。继续培养24 h后以MTT法测定细胞增殖率，计算公式如下：

地黄蛋白纳米颗粒细胞毒性试验表明，纳米颗粒在中低浓度并不会抑制细胞的增值，对狗肾上皮细胞（MDCK）有明显促增值作用，鲜地黄、生地黄和所分离的两种地黄蛋白均无明显细胞增殖作用，反而还有些抑制作用。地黄蛋白形成纳米颗粒后细胞增殖作用显著提高见附图11。

实施例5 ：地黄蛋白纳米颗粒的抗氧化活性测定

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力大小表示。准确称取20 mg DPPH用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到浓度为2×10^-4mol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液的特征紫红色基团517 nm的吸收峰，测定加入样品后A517 吸收的下降表示其对有机自由基的清除能力。取2mL不同浓度的样品液，加入2mL 2×10^-4 mol/L的 DPPH 溶液，混匀，反应30 min后测定517nm 处的吸光值Ai，同时测定 2 mL DPPH + 2 mL乙醇的吸光值 A0 和2 mL 样品液 + 2 mL乙醇混合后的吸光值Aj。以溶剂无水乙醇调零。

计算自由基的清除率：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

结果显示：地黄蛋白颗粒的抗氧活性最强，清除DPPH自由基率可高达66%，鲜地次之，可达25%，生地最弱，自由基清除率仅达12%。所分离的两种蛋白质均无显著的抗氧化活性，而地黄蛋白形成纳米颗粒后抗氧化活性显著提高见附图12。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工商大学

<120> 一种地黄蛋白纳米颗粒及其制备方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Glu Lys Asp Ile Ala Gly Ala Val Gln Thr Val

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 2

Arg Glu Lys Asp Ile Val Xaa

1 5

Claims

1.一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：由两个地黄蛋白组成，由13个地黄蛋白DHP1单体和11个地黄蛋白DHP2单体形成一个球状的蛋白纳米颗粒；所述的地黄蛋白DHP1和DHP2的N-端一级结构序列分别为SEQ ID NO:1：R-E-K-D-I-A-G-A-V-Q-T-V和SEQ ID NO:2：R-E-K-D-I-V-X。

2.根据权利要求1所述的一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：该纳米颗粒其平均粒径为120.61±0.46 nm，表面电荷呈负性，范围在-18±5mV。

3.根据权利要求1所述的一种地黄蛋白纳米颗粒，其特征在于：所述的地黄蛋白提取方法，具体包括以下步骤：

1）地黄蛋白粗提液的制备：鲜地黄经榨汁机、生地或熟地黄原料经高速粉碎机将其磨碎，料液比1:3加入0.2 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提24 h；用8层纱布过滤得到的地黄浸提液，弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经15000rpm离心20 min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向地黄蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置4 h，以12000 rpm离心20 min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为80% ，待固体全溶解后，4 ℃下放置4h，15000 rpm离心20 min，收集沉淀；沉淀用0.2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0磷酸缓冲液透析12h，将透析液在15000 rpm，4℃条件下，离心20 min，收集上清液，得到的溶液即为地黄蛋白粗提液；

2）地黄蛋白DHP1的离子交换色谱分离：将100mL地黄蛋白初提液流加至以0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液平衡的CM-Sephadex C-50弱阳离子常压色谱柱，以同样浓度醋酸-三水合醋酸钠缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液线性梯度洗脱300 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH4.6的醋酸-三水合醋酸钠缓冲液洗脱1个柱体积，流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定，获得P0蛋白组分；将经CM-Sephadex C-50分离且透析过的P0蛋白组分进一步用Source-15Q高效液相色谱柱进行分离，5ml加至以0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液平衡的Source-15Q色谱柱，以同样浓度的磷酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～01mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液线性梯度洗脱20 mL，最后用含1 mol/LNaCl 的0.02 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

3）地黄蛋白DHP2的二步疏水色谱分离：将地黄蛋白粗提液进一步用疏水色谱POROS 20Micron HP2进行纯化，疏水色谱柱以含有2 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7磷酸缓冲液平衡，以2～0 mol/L（NH₄）₂SO₄的0.02 mol/L、pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行线性梯度洗脱；流速2.0 mL/min，上样量：5 mL，紫外检测波长280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；将第一次疏水色谱分离得到的蛋白组分按上述相同条件进行第二次疏水色谱分离，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；

4）地黄蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的地黄蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该地黄蛋白的等电点，以Edman degradation测定地黄蛋白的N-端一级结构序列。

4.一种如权利要求1所述的地黄蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的地黄蛋白纳米颗粒的制备方法包括：将两种地黄蛋白配制为1 mg/mL的pH6.5盐溶液，经过70℃加热1小时，应用TSK gel G6000PW凝胶色谱去除未反应的地黄蛋白，即获得地黄蛋白纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的一种地黄蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。