CN109744493A - 一种食源功能性纳米颗粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食源功能性纳米颗粒及其应用。本发明的食源功能性纳米颗粒的平均粒径为40‑110nm，通过河蚬热加工、物理分离和冷冻干燥制备而得。本发明的食源纳米颗粒能够应用在调节胞内自由基水平或者降血脂以及护肝的药品或食品中。本发明具有原料安全、绿色，制备方法操作简单、分离效果好，应用领域广泛等优点。
Description
技术领域
本发明属于食品与纳米材料技术领域，特别是涉及一种食源功能性纳米颗粒及其应用。
背景技术
河蚬(Corbicula fluminea)是双壳类软体动物，外壳或呈黄绿色、棕黄色，或呈黑褐色，隶属于瓣鳃纲(Lamellibranchia)中真瓣鳃目(Eulamellibranchia)的异齿亚目(Heterodontta)的蚬科(Corbiculidae)中的蚬属(Corbicula)，又称黄蚬、金蚶、扁螺等。河蚬是我国重要经济贝类之一，广泛分布在温暖湿润的淡水或微咸水河湖环境之中，例如东南部的浙江、福建、江苏等省份。河蚬软体部分(蚬肉) 不仅味道鲜美，而且具有相当显著的保健价值。河蚬汤被我国民间视为保肝良品。在日本及韩国，河蚬汤受到人们的特别喜爱，每年韩国日本从我国进口万吨新鲜河蚬作解酒护肝药膳之用。李时珍也在《本草纲目》中特别指出，河蚬为治疗肝病妙药。河蚬汤的保肝功效不仅为民间所推崇。来自中国、日本等地的学者所开展的严格动物实验也证实河蚬汤可以显著抑制急性或慢性化学肝损伤，酒精肝及脂肪肝等。通过动态光散射技术以及透射电镜，研究者已经发现河蚬汤中存在大量自组装纳米颗粒，暗含巨大的市场开发价值。
越来越多证据显示食品中的自组装纳米颗粒具备一定功能性。例如，绿茶中的有机纳米颗粒提取物被认为是化疗药物的优良纳米载体以抗肿瘤治疗；装载有叶酸和ω-3多不饱和脂肪酸的牛奶蛋白纳米颗粒可有效提高其口服效率。此外，自组装甘草蛋白的纳米颗粒包封乌头碱后有效降低了其毒性，但复杂的食品基质环境限制了对这些纳米颗粒的分离制备及后续分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食源功能性纳米颗粒及其应用。为了达到上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种食源功能性纳米颗粒，所述食源功能性纳米颗粒的平均粒径为 40-110nm，通过河蚬热加工、物理分离和冷冻干燥制备而得。
进一步地，所述热加工的具体步骤为：将河蚬用蒸馏水洗净并静养5h以上，称取活的新鲜个体，按照料液比1:1-3kg/L加入蒸馏水并煮沸0.5–2h，冷却后经过滤，离心分离，取上清液冷冻备用。
进一步地，所述物理分离为透析分离、超滤分离、离子交换色谱分离或尺寸排阻色谱分离。
进一步地，所述超滤分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻，然后于100kDa超滤管中10,000g超滤20min，超滤膜所截留部分即为河蚬中纳米颗粒。
进一步地，所述离子交换色谱分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻；经离子交换柱，使功能性纳米颗粒充分结合在离子交换柱上；最后用缓冲液线性洗脱，同时以280nm紫外波段联合十八角度激光光散射检测器检测解冻后液体中纳米颗粒的出峰，收集紫外吸收与光散射出现共同叠加峰的洗脱液，即为河蚬中纳米颗粒。
进一步地，所述尺寸排阻色谱分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻；经尺寸排阻柱，使功能性纳米颗粒充分结合在尺寸排阻柱上；最后用缓冲液洗脱，同时以紫外波段214nm联合十八角度激光光散射检测器检测解冻后液体中纳米颗粒的出峰，收集紫外吸收与光散射出现共同叠加峰的洗脱液，即为河蚬中纳米颗粒。
进一步地，所述冷冻干燥条件为：将物理分离处理后的河蚬中纳米颗粒于 -80℃预先冷冻后，转移至真空冷冻干燥机中进行冻干，所得冻干粉即为食源性功能性纳米颗粒。
本发明进一步提供上述食源功能性纳米颗粒在调节细胞内自由基水平的药品或食品中的应用。
本发明进一步提供上述食源功能性纳米颗粒在降血脂或护肝的药品或者食品中的应用。
本发明的优点在于：
(1)本发明涉及的功能性纳米颗粒来源于食品原料，安全性高，无需化学交联与构造，制备简单。
(2)本发明的分离技术绿色无风险，成本较低，设备使用简单，分离效果好，可从复杂的食品基质中得到功能性纳米颗粒，将其与游离成分有效分离。其中超滤分离速度快，操作简单；尺寸排阻色谱分离效果温和；离子交换色谱能根据带电性质精确分离河蚬汤中带电性质不同的纳米颗粒亚群。此外，本发明利用HPLC-MALLS，根据光散射大小可在线检测分离组分是否为纳米颗粒，灵敏度高。
(3)本发明涉及的功能性纳米颗粒为天然产物提取产业提供新视角，能够从纳米科技角度增加海洋水产资源的附加价值。
附图说明
图1功能性纳米颗粒的离子交换色谱图。
图2功能性纳米颗粒的尺寸排阻交换色谱图。
图3未分离处理的河蚬热加工产物及经分离得到的功能性纳米颗粒的粒径分布图(a.河蚬热加工产物；b.超滤分离；c.尺寸排阻交换色谱；d.离子交换色谱IEC-P1；e.离子交换色谱IEC-P2)。
图4功能性纳米颗粒的电镜照片。
图5功能性纳米颗粒对肝细胞的体外甘油三酯摄取的抑制情况；
图6功能性纳米颗粒作用下，高脂饲料喂养的罗非鱼血浆观察。
图7功能性纳米颗粒对高脂饲料喂养罗非鱼肝脏和肝脏切片组织化学染色 (其中HFD为喂养高脂饲料组；FCRE为河蚬肉乙醇抽提物；FCWN为经超滤截留得到的河蚬汤中纳米颗粒)。
图8经尼罗红染色的功能性纳米颗粒图及其与巨噬细胞的相互作用。
图9功能性纳米颗粒分别在正常情况与自由基攻击情况下对巨噬细胞胞内自由基含量的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1：河蚬热加工
将河蚬用蒸馏水洗净并静养5h，称取活的新鲜个体，按照料液比1kg：1L 加入含蒸馏水的不锈钢锅中，并置于电磁炉上煮沸1h，其中不添加食盐，冷却后纱布过滤，取粗滤液于离心机中，离心速度为15000r·min-1，在4℃下离心 15min，随后于-20℃冷冻备用。
实施例2：功能性纳米颗粒的原位测定
取1mL实施例1所述解冻后的河蚬热加工产物，利用马尔文激光粒度仪测定其粒径及表面电位，测得粒径为69.2±0.55nm，表面电荷范围在-4.9±0.86，其粒径分布见图3，胶体性质见表1。
实施例3：功能性纳米颗粒的超滤分离
取1mL实施例1所述解冻后的河蚬热加工产物于100kDa超滤管中，10000 g超滤20min，超滤膜所截留部分即为功能性纳米颗粒，其平均粒径与表面电荷分别为76±0.5nm，-11.2±0.40mV，其粒径分布见图3，透射电镜图像见图 4，胶体性质见表1。
实施例4：基于离子交换色谱对功能性纳米颗粒的分离
利用离子交换色谱对功能性纳米颗粒进行分离，其中离子交换柱(10mm ×150mm)中柱填料为Uno-Q，利用0.02M，pH为8.5的Tris-HCl缓冲液充填柱子并用以平衡，流速为1.0mL/min。上样量为1mL实施例1所述解冻后的河蚬热加工产物，经20min平衡，河蚬热加工产物中功能性纳米颗粒较为充分结合在离子交换柱中后，利用含0-1.0M NaCl的Tris-HCl缓冲液线性洗脱。同时以280nm紫外波段联合十八角度激光光散射检测器(IEC-MALLS)检测河蚬汤中纳米颗粒的出峰(图谱见图1)，在保留时间为53.6min与67.6min时分别出现紫外吸收与光散射共同叠加峰，称之为IEC-P1与IEC-P2，其平均粒径与表面电荷分别为50±0.2nm，-28.0±3.26mV；67±0.4nm，-9.96±3.56 mV。其粒径分布见图3，胶体性质见表1。离子交换色谱中纳米颗粒峰后的其他峰并未有明显光散射，可认为利用IEC-MALLS将河蚬热加工产物中的纳米颗粒与游离成分高效分离，同时根据带电性质，将功能性纳米颗粒进一步进行亚群分类。
实施例5：基于尺寸排阻柱色谱对功能性纳米颗粒的分离
利用尺寸排阻柱色谱对功能性纳米颗粒的分离，其中尺寸排阻柱(1.2× 100cm)中柱填料为Sephacryl S-1000，利用0.05M硼酸-硼砂缓冲液(pH8.5) 缓冲液充填柱子并用以平衡，流速为：0.33mL/min。上样量为1mL实施例1所述解冻后的河蚬汤，以紫外波段214nm联合十八角度激光光散射检测器 (SEC-MALLS)检测功能性纳米颗粒的出峰(图谱见图2)，区别于游离蛋白成分。分管收集，每管为2mL,在42-68管出现紫外吸收与光散射共同叠加峰，为功能性纳米颗粒，其平均粒径与表面电荷分别为73.6±0.86nm，-11.5± 0.80mV，其粒径分布见图3，胶体性质见表1。尺寸排阻色谱中纳米颗粒峰后的其他峰并未有明显光散射，可认为利用SEC-MALLS将功能性纳米颗粒与游离成分高效分离。
实施例6：功能性纳米颗粒对肝细胞体外甘油三酯摄取的抑制作用
通过油酸诱导构造L-02肝细胞脂肪变性模型，探究不同浓度的功能性纳米颗粒对L-02肝细胞受到油酸刺激的影响，生化分析结果见附图5。
结果显示，一定浓度范围，功能性纳米颗粒对肝细胞体外甘油三酯摄取起到抑制作用，其中IEC-P1和IEC-P2分别抑制L-02肝细胞体外甘油三酯摄取约 40％和60％。
实施例7：将实施例4-6分离的功能性纳米颗粒进一步进行冷冻干燥处理，获得最终冻干粉状的食源性功能性纳米颗粒。冷冻干燥的条件为：样品于-80℃预先冷冻后0.5-3h，转移至真空冷冻干燥机中2-3d，真空冷冻干燥机内置条件为-55--60℃，0.5-0.6mbar。所得冻干粉即为河蚬中纳米颗粒冻干样品。
实施例8：功能性纳米颗粒对高脂饲料喂养的罗非鱼肝脏及血液的保护作用
通过喂养高脂饲料，建立处于高脂环境的罗非鱼模型，探究河蚬肉热水抽提物以及功能性纳米颗粒对处于高脂环境罗非鱼的影响，不同条件下罗非鱼血浆观察见图6，不同条件下罗非鱼的染色肝脏组织切片见图7，不同条件下罗非鱼肝体指数、甘油三酯含量以及总胆固醇含量见表2，罗非鱼血浆中甘油三酯含量、总胆固醇含量、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白含量见表3。
结果显示，功能性纳米颗粒显著降低了高脂饲料喂养罗非鱼血浆和肝脏中的甘油三脂和总胆固醇含量以及血浆中的高度脂蛋白及低密度脂蛋白含量。高脂饲料中添加功能性纳米颗粒的罗非鱼肝体指数与正常饮食的罗非鱼的肝体指数相同。可以得出结论，食用高脂肪食物的鱼类，同时食用功能性纳米颗粒，可以保护肝脏及血液以保持健康。
实施例9：功能性纳米颗粒调节巨噬细胞胞内自由基
以巨噬细胞为模型，通过AAPH刺激和功能性纳米颗粒的作用，测定胞内线粒体自由基含量，探究不同浓度的功能性纳米颗粒对正常巨噬细胞与氧化应激状态下巨噬细胞的影响，经尼罗红染色的纳米颗粒与细胞图像见图8，胞内自由基含量结果见图9。
结果显示在一定浓度范围内功能性纳米颗粒能有效调节胞内自由基含量，解除氧化应激状态达100％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
表1河蚬热加工产物及经超滤分离、离子交换色谱、尺寸排阻交换色谱各自得到功能性纳米颗粒的胶体性质
表2功能性纳米颗粒对高脂喂养罗非鱼血浆中的甘油三酯和总胆固醇、低密度蛋白与高密度蛋白含量的影响
表3功能性纳米颗粒对高脂喂养罗非鱼肝脏的肝体指数、三酰基甘油以及总胆固醇含量的影响
Claims (9)
1.一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述食源功能性纳米颗粒的平均粒径为40-110nm，通过河蚬热加工、物理分离和冷冻干燥制备而得。
2.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述热加工的具体步骤为：将河蚬用蒸馏水洗净并静养5h以上，称取活的新鲜个体，按照料液比1:1-3kg/L加入蒸馏水并煮沸0.5–2h，冷却后经过滤，离心分离，取上清液冷冻备用。
3.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述物理分离为透析分离、超滤分离、离子交换色谱分离或尺寸排阻色谱分离中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述超滤分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻，然后于100kDa超滤管中10,000g超滤20min，超滤膜所截留部分，即为河蚬中纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述离子交换色谱分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻；经离子交换柱，使功能性纳米颗粒充分结合在离子交换柱上；最后用缓冲液洗脱，同时以280nm紫外波段联合激光光散射检测器检测解冻后液体中纳米颗粒的出峰，收集紫外吸收与光散射共同叠加峰的洗脱液，即为河蚬中纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述尺寸排阻色谱分离步骤为：将冷冻备用的河蚬热加工产物解冻；经尺寸排阻柱，使功能性纳米颗粒充分结合在尺寸排阻柱上；最后用缓冲液洗脱，同时以紫外波段214nm联合激光光散射检测器检测解冻后液体中纳米颗粒的出峰，收集紫外吸收与光散射共同叠加峰的洗脱液，即为河蚬中纳米颗粒。
7.根据权利要求1所述的一种食源功能性纳米颗粒，其特征在于，所述冷冻干燥条件为：将物理分离处理后的河蚬中纳米颗粒于-80℃预先冷冻后，转移至真空冷冻干燥机中进行冻干，所得冻干粉即为食源性功能性纳米颗粒。
8.权利要求1-7中任一项所述的食源功能性纳米颗粒在调节细胞内自由基水平的药品或食品中的应用。
9.权利要求1-7中任一项所述的食源功能性纳米颗粒在降血脂或护肝的药品或者食品中的应用。
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