CN106858587A - 大豆分离蛋白‑姜黄素纳米颗粒结合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆分离蛋白‑姜黄素纳米颗粒结合物及其制备方法。该制备方法步骤为：以大豆分离蛋白为原料，经谷氨酰胺酶改性得到大豆分离蛋白纳米颗粒，并进一步结合姜黄素，形成大豆分离蛋白‑姜黄素纳米颗粒结合物，并对其功能进行进一步研究。本发明所制得的大豆分离蛋白‑姜黄素纳米颗粒结合物，可以在食品工业中增加姜黄素的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及功能性纳米生物制品，具体涉及利用谷氨酰胺酶制备大豆分离蛋白‐姜黄素纳米颗粒结合物的方法。
背景技术
近年来，国内对于利用蛋白质包埋一些疏水性生物活性成分的研究越来越多。2015年陈硕等采用pH3.0和pH7.0时的大豆分离蛋白和豌豆分离蛋白为原料，在蛋白浓度为0.5mg/mL时，向其中添加不同姜黄素浓度(0～60μM)乙醇溶液，迅速涡旋振荡20s形成蛋白质‐姜黄素复合物，经测定复合物在pH3.0和pH7.0的粒径分别为96.2nm和60.3nm，装载量分别为6.238±0.107和8.582±0.595。(陈硕,陈飞平,唐传核.植物球蛋白/姜黄素纳米复合物的制备及其对O/W型Pickering乳液氧化稳定性影响[J].现代食品科技,2015(12):197‐204.)2016年华南理工大学公开了一种可溶性大豆多糖‐大豆蛋白‐姜黄素复合物及制备与应用(专利申请号201510598337.1)。主要步骤：将大豆蛋白和大豆多糖分别分散溶解于去离子水中；将姜黄素分散于无水乙醇中充分溶解；然后将姜黄素乙醇溶液加入到大豆蛋白分散液中,得到大豆蛋白‐姜黄素混合液；再将大豆多糖分散液加入到大豆蛋白‐姜黄素混合液中,调节pH至7.0或4.0,冷冻干燥,得到可溶性大豆多糖‐大豆蛋白‐姜黄素复合物。发明人声称将大豆多糖和大豆蛋白与姜黄素进行连续复合,显著提高姜黄素在水溶液中的稳定性和缓释效果,在功能性食品及药品的开发中具有良好的应用前景。2014年华南理工大学公开了一种超声辅助制备大豆蛋白‐姜黄素复合物的方法(专利申请号201410521682.)。主要步骤：:将大豆蛋白加入水中,常温搅拌分散,水化得到大豆蛋白分散液；将所得大豆蛋白分散液进行超声处理,然后冷却至常温；将姜黄素预分散于无水乙醇中,于常温在搅拌条件下,将含有姜黄素的无水乙醇溶液添加至大豆蛋白分散液中,搅拌混合,室温静置,离心,取离心上清液干燥，得到大豆蛋白‐姜黄素复合物。发明人声称利用超声波处理展开大豆蛋白的空间立体结构,提高其与姜黄素的结合效率,大大提高了姜黄素在水中的溶解性和生物稳定性；且生产工艺简单，所需有机溶剂的量极小,绿色环保安全。2013年苏州雷纳药物研发有限公司公开了一种高包封率姜黄素白蛋白纳米药物组合物(专利申请号201210484495)。主要步骤：取处方量人血清白蛋白溶于水相,置于30℃恒温水浴,在持续搅拌(480rpm)的同时,向水相中滴加姜黄素无水乙醇溶液至处方量,加入2％戊二醛水溶液,继续搅拌固化24小时,于35℃旋转蒸发去除有机溶剂,残留水相过0.22pm微孔滤膜,冻干,即得固体粉末。发明人声称其制备的纳米药物组合物可以达到55％的包封率，同时该药物组合物可以用于临床上抗肿瘤的应用。
上述论文和专利中，未见公开利用谷氨酰胺酶改性之后制备蛋白质‐姜黄素纳米颗粒结合物的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供大豆分离蛋白‐姜黄素纳米颗粒结合物及其制备方法，具体技术方案如下。
本发明的大豆分离蛋白‐姜黄素纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)以市售豆粕为原料，通过碱溶酸沉的方法得到自制的大豆分离蛋白；
(2)将大豆分离蛋白加入水中，充分溶解，加入谷氨酰胺酶进行酶改性，得到酶改性大豆分离蛋白；
(3)将酶改性得到的大豆分离蛋白与姜黄素乙醇溶液混合，室温搅拌充分混合，将混合液离心除去沉淀，得到的上清液进行冷冻干燥，得到的粉末即为大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物。
进一步地，所述碱溶酸沉的具体过程为：将豆粕以1：10-20的质量比例加入蒸馏水，用2M的氢氧化钠调节pH为7.0-9.0，之后离心取上清液，再用2M的盐酸调节pH为4-5，静置20-60min，离心得到沉淀，之后再将沉淀复溶，透析冻干，即可得到自制大豆分离蛋白。
进一步地，所述大豆分离蛋白与水的质量比为1：10-100。
进一步地，所述酶改性条件为pH为7.0-9.0，温度为30℃-60℃，保温时间为0.5-6h，反应结束之后于80-90℃水浴锅中保温10-30min，离心得到上清液，即为酶改性大豆分离蛋白。
进一步地，所述谷氨酰胺酶的添加量为大豆蛋白重量的0.01-0.4％。
进一步地，所述谷氨酰胺酶来源于解淀粉芽孢杆菌或日本田野公司。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC8425。
进一步地，所述姜黄素乙醇溶液浓度为0.5-5mg/mL。
进一步地，所述姜黄素乙醇溶液与大豆分离蛋白溶液的体积比为1:1-100。
进一步地，所述离心条件为8000g-1000g离心15min。
本发明还提供了由上述任一项所述制得大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物。本发明所制得的大豆分离蛋白‐姜黄素纳米颗粒结合物，可以在食品工业中增加姜黄素的利用率。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
(1)本发明首次公开利用谷氨酰胺酶改性得到的大豆分离蛋白包埋姜黄素，得到一种纳米颗粒结合物，其粒径约为300nm以下。
(2)本发明所得产品装载量可以达到10‐70mg/g，具有较好的包埋效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
包封率＝(1‐游离姜黄素含量/总的姜黄素含量)*100％
装载量(mg/g)＝结合的姜黄素含量/蛋白含量
蛋白利用率＝(上清液的蛋白质含量/总的蛋白质含量)*100％
PDI＝数均粒径/重均粒径，由粒度分布仪直接测定。
实施例1
大豆分离蛋白的制备：称取200g豆粕打粉，溶于10倍质量的去离子水，用2.0M的NaOH调节pH至8.0，搅拌2h后4℃离心(8000g，20min)，取上清再用2.0M的HCl调节pH为4.5,于4℃冰箱静置30min，之后再离心，倒掉上清液，清洗沉淀3次之后掏出称重，将沉淀溶于5倍去离子水，复溶之后于4℃透析48h，冻干即可得到大豆分离蛋白。
取出已在申请人其他专利申请中保藏的解淀粉芽孢杆菌SWJS22(Bacillusamyloliquefaciens SWJS22，CGMCC No.8425)试管斜面，在无菌操作台中，刮取少许菌落，在中性酪蛋白平板上划线，于37℃恒温培养箱中培养24h，再挑取单菌落转接到另一平板进行培养，如此重复3次，使菌株完全复壮。挑取一环已经在中性酪蛋白平板上活化三代的SWJS22菌株接入装液量为10％的LB培养基(LB培养基由胰蛋白胨10％，酵母抽提物0.2％，氯化钠10％，水78％组成)里面，在150rpm，37℃下培养12h，得种子液。
在麸皮：水＝5:3(w/w)，蔗糖酯SE‐1170的添加量0.5％(w/w)，解淀粉芽孢杆菌SWJS22种子液的接种量2.0％(v/w)，37℃的条件下，固体发酵48h，得谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶的酶活力为2.72GTU/g。
分别配制1％，2％，4％，8％质量百分比浓度的大豆分离蛋白溶液，添加大豆分离蛋白重量0.4％的谷氨酰胺酶，调节pH至8.5，在60℃保温0.5h后，85℃保温20min灭酶，得到酶改性之后的大豆分离蛋白，与姜黄素混合搅拌，之后测定平均粒径、PDI、Zeta电位、包封率和装载量，结果见表1。
表1
由表1可以看出，随着大豆分离蛋白溶液浓度的增加，大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的粒径呈现增长的趋势，但是可以发现当大豆分离蛋白的浓度为4％时得到的纳米颗粒结合物的PDI最小，表明该体系最稳定；另外随着浓度的增加，姜黄素的包封率呈现增长的趋势，且都表现出较高的包封率。
对比实施例1
分别配制1％，2％，4％，8％(wt％)浓度的大豆分离蛋白水溶液，调节pH至8.5，在60℃保温0.5h后，85℃保温20min热处理，得大豆分离蛋白蛋白，与姜黄素混合搅拌，之后测定平均粒径、PDI、Zeta电位和包封率，结果见表2。
表2
相比较于酶改性之后制备的纳米颗粒结合物而言，未经过酶改性的大豆分离蛋白-姜黄素的纳米颗粒结合物的颗粒较大，装载量小，且PDI值高，Zeta电位偏低，表明整个体系相对来说比较不稳定。
实施例2
配制1wt％浓度的大豆分离蛋白水溶液，添加蛋白质重量0.04％的日本天野公司谷氨酰胺酶，调节pH至9.0，在30℃保温6h后，80℃保温10min灭酶，得到酶改性大豆分离蛋白，分别加入不同比例的姜黄素，姜黄素：大豆分离蛋白的体积比分别为1:1，1:5；1:10；1:50制备纳米颗粒结合物，测定平均粒径、PDI、Zeta电位以及包封率，见表3。
表3
由表3可以看出，随着姜黄素浓度的降低，蛋白质-姜黄素结合物的粒径呈现降低的趋势，而PDI都在基本在0.5以下，体系呈现较好的稳定性。而随着姜黄素浓度的降低，包封率却呈现增加的趋势，有可能是因为高浓度的姜黄素会自身发生聚集，而导致蛋白质无法完全包埋姜黄素。
对比实施例2
配制1wt％浓度的大豆分离蛋白，调节pH至9.0，在30℃保温6h后，80℃保温10min，得到大豆分离蛋白，分别加入不同比例的姜黄素，姜黄素：大豆分离蛋白的体积比分别为1:1，1:5；1:10；1:50制备纳米颗粒结合物，测定平均粒径、PDI、Zeta电位，见表4。
表4
由表4可以看出，随着姜黄素浓度的降低，蛋白质-姜黄素结合物的粒径呈现减少的趋势，而PDI都在基本在0.59以上，体系呈现较差的稳定性，说明包埋的效果不太好。而随着姜黄素浓度的降低，包封率却呈现增加的趋势，却均低于酶改性之后的大豆分离蛋白。说明酶改性对于大豆分离蛋白包埋疏水性生物活性成分有较好的效果。
实施例3
分别配制1％，2％，4％，8％浓度的大豆分离蛋白溶液，添加蛋白质重量0.04％的谷氨酰胺酶(来源于解淀粉芽孢杆菌，谷氨酰胺酶的制备方法同实施例1)，调节pH至7.1，在55℃保温2h后，85℃保温25min灭酶，得到酶改性之后的蛋白质，与姜黄素混合搅拌，之后测定平均粒径、PDI、Zeta电位和蛋白质利用率，结果见表5。
表5
由表5可以看出，大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的整体粒径较小，说明酶改性之后的大豆分离蛋白呈现较好的效果。另外，蛋白质利用率较高，说明大部分的蛋白质都用于包埋姜黄素。
对比实施例3
分别配制1％，2％，4％，8％浓度的大豆蛋白溶液，调节pH至7.1，在55℃保温2h后，85℃保温25min，得到大豆分离蛋白，与姜黄素混合搅拌，之后测定平均粒径、PDI、Zeta电位和蛋白质利用率，结果见表6。
表6
由表6可以看出，与改性蛋白质相比，未改性的蛋白质-姜黄素结合物的整体粒径较大，并且蛋白质利用率也呈现较低的结果。
实施例4
配制1wt％浓度的大豆分离蛋白水溶液两份，均调节pH为8.0，其中一份加入大豆分离蛋白重量的0.03％的日本田野的谷氨酰胺酶，均置于45℃的水浴锅中保温1h，之后置于80℃中保温20min灭酶，分别得到酶改性大豆分离蛋白和大豆分离蛋白，分别加入与大豆分离蛋白体积比为1:50的姜黄素乙醇溶液(5mg/mL)，在室温下混合搅拌，得到大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物，将这些样品离心(9000g，5min)得到上清液，进行贮藏稳定性的测定。
分别测定游离姜黄素(CUR)，酶改性大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物(E-SPI-CRU)以及大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物(SPI-CUR)的1％水溶液在0h，1d，2d，3d，4d在426nm处的吸光度值，所有样品的初始保留率为1。测定结果见表7。
表7
由表7可以看出，随着时间的延长，游离姜黄素的贮藏稳定性下降的很快，而与大豆分离蛋白结合之后，姜黄素的贮藏稳定性均呈现较高的水平，总体来看，酶改性之后的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的贮藏稳定性较好，有利于姜黄素的应用。
Claims (10)
1.大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
以市售豆粕为原料，通过碱溶酸沉法得到大豆分离蛋白；
将大豆分离蛋白加入水中，充分溶解，加入谷氨酰胺酶进行酶改性，得到酶改性大豆分离蛋白；
将酶改性大豆分离蛋白与姜黄素乙醇溶液混合，室温搅拌充分混合，将混合液离心除去沉淀，得到的上清液进行冷冻干燥，得到的粉末即为大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物。
2.根据权利要求1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（1）中，所述碱溶酸沉法的具体过程为：将豆粕加入10-20倍质量的蒸馏水，用2M的氢氧化钠调节pH为7.0-9.0，之后离心取上清液，再用2M的盐酸调节pH为4-5，静置20-60min，离心得到沉淀，之后再将沉淀复溶，透析冻干，即可得到自制大豆分离蛋白。
3.根据权利要求1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中，大豆分离蛋白与水的质量比为1：10-100。
4.根据权利要求1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中，所述酶改性条件为pH为7.0-9.0，温度为30℃-60℃，保温时间为0.5-6h，反应结束之后于80-90℃水浴锅中保温10-30 min，离心得到上清液，即为酶改性大豆分离蛋白。
5.根据权利要求1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中所用的谷氨酰胺酶的添加量为大豆分离蛋白重量的0.01-0.4%。
6.根据权利要求1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（2）中所用的谷氨酰胺酶来源于解淀粉芽孢杆菌或来源于日本田野公司。
7.根据权利要求6所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征是所述解淀粉芽孢杆菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC8425。
8.根据权利1所述的大豆分离蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物的制备方法，其特征在于步骤（3）中的姜黄素乙醇溶液浓度为0.5-6 mg/mL；姜黄素乙醇溶液与大豆分离蛋白溶液的体积比为1:1-100。
9.根据权利1所述的方法，其特征在于步骤（3）中的离心为8000g-10000g离心10-15min。
10.由权利要求1～9任一项所述制备方法制得大豆蛋白-姜黄素纳米颗粒结合物。
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