CN114431482B - 一种纳米凝胶、制备方法及其强化的饮料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品纳米凝胶技术领域，具体是一种纳米凝胶、制备方法及其强化的橙汁饮料。本发明通过大豆分离蛋白与葡聚糖反应得到大豆分离蛋白‑葡聚糖轭合物，通过直接包埋法或并组装包埋法制备得到一种负载姜黄素的大豆分离蛋白‑葡聚糖轭合物纳米凝胶，具有提高姜黄素抗氧化性、稳定性和生物利用度的效果。通过将其用于橙汁饮料的加工，具有不会对橙汁饮料色差产生明显影响，且随着浓度的增加，橙汁饮料的粒径、多分散指数、蛋白含量、可溶性固形物和感官评分均逐渐增加，总酸含量基本不变，抗氧化性、稳定性和生物利用度明显提高的特点。

Description

一种纳米凝胶、制备方法及其强化的饮料
技术领域
本发明涉及食品纳米凝胶技术领域，具体是一种纳米凝胶、制备方法及其强化的饮料。
背景技术
食品生物活性物质是食品发挥营养功能的重要元素之一。相对于常规营养素而言，这类微量活性成分往往具有水不溶性，以及光、热、pH和盐离子不稳定性；所以，在食品加工过程中，这些因素会使生物活性物质发生结构变化，失去原有功效。
有鉴于此，本发明通过大豆分离蛋白(soybean protein isolate,SPI)和葡聚糖反应得到大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物(soybean protein isolate-dextran conjugate,SDC)，通过直接包埋法或并组装包埋法制备得到一种负载姜黄素的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶(DCUR-SDC)，具有提高姜黄素抗氧化性、稳定性和生物利用度的效果。通过将其用于橙汁饮料的加工，具有不会对橙汁饮料色差产生明显影响，且随着浓度的增加，橙汁饮料的粒径、PDI、蛋白含量、可溶性固形物和感官评分均逐渐增加，总酸含量基本不变，抗氧化性、稳定性和生物利用度明显提高的特点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物(soybean protein isolate-dextran conjugate,SDC)纳米凝胶负载姜黄素强化的橙汁饮料。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种纳米凝胶，所述纳米凝胶由大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶负载姜黄素制成。
进一步的，所述纳米凝胶的粒径为：180-210nm，多分散指数为：0.130-0.210，ζ-电势：-0.255～-3.385mV。
本发明还提供一种上述纳米凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、使大豆分离蛋白和葡聚糖反应得到大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物；
S2、通过直接包埋法或并组装包埋法负载姜黄素制备得到所述纳米凝胶。
进一步的，所述步骤S1中，所述大豆分离蛋白和葡聚糖反应的方法为干热法。
进一步的，所述步骤S1中，所述干热法为：用磷酸缓冲盐溶液将所述大豆分离蛋白溶解，充分水合，加入所述葡聚糖，再次充分水合后，将溶液冷冻干燥，置于57-63℃℃、相对湿度76-82％的培养箱中反应一定时间。
所述干热法具体为：用10mM PBS(pH7.2)将SPI溶解成50mg/mL，室温磁力搅拌2h，静置过夜使其充分水合，然后加入一定比例的葡聚糖，室温磁力搅拌2h，置于4C冰箱水合过夜。将溶液冷冻干燥，研碎后平铺在培养皿中，置于60℃、相对湿度79％的培养箱中反应一定时间，立即冷却以停止反应，再将糖基化产物冷冻干燥，-20C保存备用。
进一步的，所述步骤S1中，所述干热法中葡聚糖分子量为20-70kDa，SPI/葡聚糖质量比例为1:1-3，反应时间为2-4d。
进一步的，所述步骤S2中，所述直接包埋法为：将所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物通过加热凝胶法制备得到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶，再将姜黄素乙醇溶液添加到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶溶液中，并将混合液进行均值处理，得到所述纳米凝胶。
所述直接包埋法具体为：将SDC(1mg/mL)溶液用0.1M HC1将pH调节到3.8，在10000r/min下离心10min，收集上清液，然后在90℃加热40min以产生SDC-纳米凝胶。将姜黄素乙醇溶液(5.0mg/mL)以1：25的体积比添加到SDC-纳米凝胶溶液中，将混合液进行均质处理，均质条件为12000r/min和2.5min，以产生负载姜黄素的SDC-纳米凝胶(DCUR-SDC)。均质后在5000r/min离心10min去除游离的姜黄素，得到的上清液即为所述纳米凝胶。
进一步的，所述步骤S3中，所述并组装包埋法为：将姜黄素乙醇溶液添加到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物溶液中，再通过加热凝胶法制备得到所述纳米凝胶。
所述并组装包埋法具体为：将SDC溶液(1mg/mL)用0.1M HCl和NaOH将pH调节到3.8，在10000r/min下离心10min，收集上清液，将姜黄素乙醇溶液(5.0mg/mL)以1：25的体积比添加到SDC溶液中，然后在90℃加热40min以产生负载姜黄素的SDC-纳米凝胶(SCUR-SDC)。通过5000r/min离心10min除去样品中的不溶性游离姜黄素，得到的上清即为所述纳米凝胶。
进一步的，所述加热凝胶法为：将浓度为0.7-1.3mg/mL的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物分散于水中，调节pH至3.5-4.1以下，在87-93℃下加热37-43min后得到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物制备的纳米凝胶。
本发明还提供上述的纳米凝胶或上述的制备方法在制备酸性果汁饮料中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过限定葡聚糖的分子量、SPI/葡聚糖的比例和培养时间，获得了一种具有更松散的空间结构和更高的分子柔性的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物，为后续实验提供了必要的先决条件。
2、本发明借助加热凝胶法，并限定具体的浓度、pH值、加热温度和时间，制备出的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶具有明显的核壳结构，其外壳由亲水性葡聚糖组成，内核由凝胶化的SPI组成。且稳定性分析表明，纳米凝胶具有高度的温度、耐盐及储藏稳定性。
3、本发明使用直接包埋法或并组装包埋法制备得到一种负载姜黄素的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶(DCUR-SDC)，具有提高姜黄素抗氧化性、稳定性和生物利用度的效果。
4、本发明通过负载姜黄素的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶其用于橙汁饮料的加工，具有不会对橙汁饮料色差产生明显影响，且随着浓度的增加，橙汁饮料的粒径、PDI、蛋白含量、可溶性固形物和感官评分均逐渐增加，总酸含量基本不变，抗氧化性、稳定性和生物利用度明显提高的特点。
附图说明
图1为葡聚糖分子量对SDC接枝度和褐变程度的影响(本发明中，不同字母之间表示显著差异，p<0.05)；
图2为SPI/葡聚糖比例对SDC接枝度和褐变程度的影响；
图3为反应时间对SDC接枝度和褐变程度的影响；
图4为SDC浓度(A)、pH(B)、加热温度(C)和加热时间(D)对加热凝胶法制备的SDC-纳米凝胶的平均粒径和PDI的影响；
图5为SPI、HD、SDM和SDC-纳米凝胶溶液的外观(A)和透射率(B)，以及具有不同尺度的SDC-纳米凝胶的TEM图像(C，1um；D，500nm)；
图6为SDC-纳米凝胶在不同pH条件下的电位变化；
图7为姜黄素标准曲线；
图8为负载姜黄素的SDC-纳米凝胶和姜黄素水溶液的照片；
图9为(A)SCUR-SDC和(B)DCUR-SDC的TEM图像；
图10为不同体系中的DPPH自由基清除能力；
图11为不同体系中的铁还原能力；
图12为姜黄素和DCUR-SDC的羟基自由基清除能力；
图13为贮藏期间光照对姜黄素保留率的影响；
图14为贮藏期间温度对姜黄素保留率的影响；
图15为不同的模拟消化阶段(SGF和SIF)游离姜黄素和DCUR-SDC的生物利用度；
图16为不同姜黄素浓度的DCUR-SDC的橙汁饮料图片；
图17为不同姜黄素浓度的DCUR-SDC对橙汁饮料的DPPH自由基清除能力；
图18为不同姜黄素浓度的DCUR-SDC对橙汁饮料的铁还原能力；
图19为不同姜黄素浓度的DCUR-SDC对橙汁饮料的羟基自由基清除能力；
图20为贮藏期间姜黄素浓度对保留率的影响；
图21为贮藏期间姜黄素浓度对离心沉淀率的影响；
图22为贮藏期间姜黄素浓度对(A)平均粒径和(B)PDI的影响。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实验材料与试剂
实验材料：SPI(蛋白质≥85％，水分≥7％，灰分≤15％，pH6.5～7.5)，BR，购自北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖(分子量10、20、40、70和100kDa)，BR，购自上海源叶生物科技有限公司：姜黄素，BR，购自莱宝科技有限公司；柳橙，购自仓坪路农贸市场。
试剂：考马斯亮蓝R-250、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)
探针，均购自北京索莱宝科技有限公司；标准蛋白质预染Marker，购自天根生化科技(北京)有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶及分离胶制备试剂盒，购于博士德生物技术(武汉)有限公司；DPPH(≥97％)，BR，购自于南京都莱生物技术有限公司；胰蛋白酶(猪胰)、胃蛋白酶(猪胃粘膜)，BR，均购自上海源叶生物科技有限公司；乙醇、β-流基乙醇、溴化钾、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化钠、等，均购于成都市科隆化学品有限公司。
实施例1SPI糖基化产物的制备
实验方法：
SPI糖基化产物的制备为干热法，用10mM PBS(pH7.2)将SPI溶解成50mg/mL，室温磁力搅拌2h，静置过夜使其充分水合，然后加入一定比例的葡聚糖，室温磁力搅拌2h，置于4℃冰箱水合过夜。将溶液冷冻干燥，研碎后平铺在培养皿中，置于60℃、相对湿度79％的培养箱中反应一定时间，立即冷却以停止反应，再将糖基化产物冷冻干燥，-20℃保存备用。同时以未处理的SPI、相同条件下加热的SPI(HS)和SPI与葡聚糖的混合物(SDM)为对照。
SPI糖基化产物制备的单因素试验设计
SPI与不同分子量的葡聚糖反应制备轭合物：将SPI与分子量为10、20、40、70和100kDa的葡聚糖按照1：1的比例混合，反应3d。
SPI与葡聚糖不同比例制备轭合物：将SPI与分子量为40kDa的葡聚糖按照3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的比例混合，反应3d。
SPI与葡聚糖反应不同时间比例制备轭合物：将SPI与分子量为40kDa的葡聚糖按照1:1的比例混合，反应1、2、3、4和5d。单因素反应中，以DG和BI为评价指标。
实验结果：
(1)葡聚糖分子量对SDC接枝度和褐变程度的影响
葡聚糖的分子量对糖基化程度的影响如图1所示。当在SPI/葡聚糖比例为1：1、60℃和相对湿度为79％的条件下进行糖基化3d时，随着葡聚糖分子量从10kDa增加到100kDa，接枝度和褐变指数都呈现出不断降低的趋势。这可能与相对较小的尺寸和较高的反应性或低分子量的葡聚糖的低空间位阻有关，这也意味着由于空间位阻效应，具有高分子量的多糖可能限制这些生物聚合物之间的结合。因此，在选定的条件下，SPI与低分子葡聚糖的糖基化反应显示出相对理想的反应程度。但是，当葡聚糖分子量小于40kDa时，SDC的褐变程度均大于0.3，褐变度过高会对产品的感官色泽产生不利的影响，因此，综合接枝度和褐变两个因素，本实验制备SDC工艺参数葡聚糖分子量选择20kDa、40kDa、70kDa。
(2)SPI/葡聚糖比例对SDC接枝度和褐变程度的影响
SPI/葡聚糖比例对糖基化程度的影响如图2所示。SPI与40kDa葡聚糖在60℃和相对湿度为79％的条件下进行糖基化3d时，当SPI/葡聚糖比例从3：1变为1：3时，DG和褐变指数值先升高后降低，并且在SPI/葡聚糖比例为1：2时观察到最高接枝度值(26.07％)。随着糖浓度的增加，更多的还原端羧基可能与游离氨基酸基团相互作用，导致接枝度和褐变指数值增加。然而，在葡聚糖过量的情况下，糖基化反应受分子大小的影响，这也意味着空间位阻效应降低了反应程度。此外，过量的多糖可能导致高粘性环境，从而抑制与有效糖链共轭的蛋白质分子，导致接枝度和褐变指数降低。本试验中，在五个SPI/葡聚糖比例下的SDC褐变程度均小于0.2，褐变程度较低，而在SPI/葡聚糖比例为1：2时SDC的接枝度最高，因此，综合接枝度和褐变两个因素，本实验制备SDC工艺参数SPI/葡聚糖比例选择1:1、1:2和1:3。
(3)反应时间对SDC接枝度和褐变程度的影响
反应时间对糖基化程度的影响如图3所示。当SPI/葡聚糖比例为1:1、葡聚糖分子量为40kDa、60℃和相对湿度为79％时，随着培养时间的增加，接枝度首先增加，然后缓慢减少。当培养时间达到3天时，最大接枝度为25.61％，褐变指数也有类似趋势。随着糖基化反应的进行，反应时间越长，可用羧基和游离氨基越少，这可能是造成这种现象的主要原因。此外，过热会导致蛋白质变性聚集，导致游离氨基酸含量降低，可能破坏氨基酸，最终导致接枝度降低。本试验中，在不同的反应时间下的SDC褐变程度均小于0.22，褐变程度较低，而在反应时间为3d时SDC的接枝度最高，因此，综合接枝度和褐变两个因素，本实验制备SDC工艺参数反应时间选择2d、3d、4d。
用Design-Expert8.0软件对回归方程模型进行优化，得到SDC最佳制备工艺条件为：葡聚糖的分子量为40kDa，SPI/葡聚糖的比例为1:1.75，培养时间为3.3d，此条件下SDC的接枝度为27.15％。
实施例2SDC-纳米凝胶和负载姜黄素的纳米凝胶的制备
实验方法：
将SDC冻干后的样品以0.5、1、1.5和2mg/mL分散在超纯水中，并搅拌2h以确保完全水合。用0.1M HCl将pH调节至3.4、3.8、4.2和4.6，然后在10000r/min下离心10min，收集上清液，分别在80、85、90和95℃加热20、30、40和50min。将得到的SDC-纳米凝胶保存在4℃下备测。根据平均粒径和PDI数据，选择较优制备纳米凝胶的参数。
负载姜黄素的纳米凝胶的制备参见上文直接包埋法和共组装包埋法。
实验结果：
(1)制备参数对SDC-纳米凝胶粒径分布的影响
图4A显示了不同浓度下的SDC-纳米凝胶在pH为3.8的水浴(85℃)中加热30min的平均粒径和PDI。随着SDC浓度的增加，纳米凝胶的平均粒径从74.48nm增加到173.70nm。当浓度较低时，纳米凝胶溶液的粒径分布较为均匀。当浓度大于1mg/mL时，纳米凝胶溶液的PDI值大于0.5，表明纳米凝胶的粒径分布相对不均匀。图5B显示了1mg/mL的浓度的SDC在不同pH值下加热(85℃)30min而获得的平均粒径和PDI结果。由图可知，当pH向pl移动时，平均粒径增加，而PDI减少，表明纳米凝胶在SPI的pl附近相对均匀。图4C和4D显示了通过在不同时间和温度下分别在pH值为3.8的热浴中加热1mg/mL的SDC获得的纳米凝胶的平均粒径和PDI。如图4C所示，随着加热时间的增加，SPl-葡聚糖纳米凝胶的平均粒径和PDI都呈现出降低的趋势。如图4D所示，当温度从80℃升高到95℃时，纳米凝胶的平均粒径基本保持在100nm左右，表明温度对平均粒径影响不大。然而，在90℃下观察到纳米凝胶的最小PDI。
根据上述结果，选择1mg/mL的SDC在pH3.8的溶液中以90℃加热40min来制备用于进行形态和稳定性分析的纳米凝胶。
(2)SDC-纳米凝胶的形貌学分析
SPI、HS、SDM和SDC在pl处加热形成的纳米凝胶的外观和浊度如图5A和5B所示。加热后，在SPI、HS和SDM溶液中观察到不同程度的沉淀。沉淀的形成与加热条件下暴露于SPl分子中的疏水基团的耗尽絮凝有关，与葡聚糖的简单混合并未改变这一现象。然而，SDC-纳米凝胶溶液呈现出透明状态，并且与其他样品显著不同。此外，SDC-纳米凝胶溶液的透射率为88.92％，显著高于对照组。造成这种现象的原因是，接枝的多糖链不仅可以抑制蛋白质凝固，还可以增加蛋白质的溶解性。SDC-纳米凝胶具有半透明的外观，在食品、医药等领域有着广泛的应用。
使用TEM研究了SDC-纳米凝胶的微观形貌，获得的二维图像如图5C和5D所示。如图所示，SDC-纳米凝胶呈球形，具有核-壳结构，平均直径为100-200nm，其中核部分和壳部分分别为深色和浅色。使用马尔文粒度仪测量的SDC-纳米凝胶的平均粒径的值约为104.4nm，PDI为0.287。通过DLS测量和TEM获得的平均粒径差异与TEM观察样品制备过程中干燥操作引起的可能聚集有关。通过β-聚甘氨酸-葡聚糖偶联物和卵清蛋白-葡聚糖偶联物制备的纳米凝胶也观察到类似的核壳结构。如前所述，天然蛋白质的加热诱导蛋白质分子的去折叠以促进微观聚集并形成宏观凝胶；然而，由于多糖的空间位阻作用，多糖链接枝蛋白质的加热阻止了蛋白质分子的聚集。蛋白质分子通过疏水相互作用和二硫键交联在一起形成内部部分，亲水性和柔性多糖链通过氢键构成黑暗的外部部分。这些相互作用得益于松散的三级构象、降低的表面疏水性、增强的乳化性能和降低的ζ-电位。此外，内部和外部区域分别显示出致密和疏松的结构，TEM图像中显示的纳米凝胶的散射边缘也证实了这一点。这种独特的结构也使得基于SDC的纳米凝胶为包裹亲脂性生物活性化合物提供了完美的载体。
(3)SDC-纳米凝胶的电位分析
SDC-纳米凝胶在pH 3-9的条件下的电位如图6所示，由图可知SDC-纳米凝胶的等电点(pI)为3.39，相较文献中报道的SPI的pI＝4.6有所降低，这是由于SDC-纳米凝胶接枝了葡聚糖，甘氨酸分子和接枝的葡聚糖的亲水链在电场作用下热诱导聚集，从而减少分子在电场作用下的运动，或通过赖氨酸残基的阻断作用导致轻微的碱度损失。而纳米凝胶在不同pH条件下电位绝对值均小于7，相较文献中报道的SPI的电位降低较多，原因可能是SDC-纳米凝胶具有核壳结构，不带电的葡聚糖链段屏蔽了带有一定电荷的SPI，因此在pH3-9范围内纳米凝胶ζ-电位绝对值小于SPI。
(3)SDC-纳米凝胶的稳定性分析
表1显示了SDC-纳米凝胶的平均粒径和PDI随加热温度、NaCl浓度和储存时间的变化。如表1所示，与未加热的纳米凝胶相比，在50-90℃下加热30min的纳米凝胶的平均粒径和PDI仅略有增加，表明纳米凝胶内的交联结构非常稳定。对于作为NaCl浓度变化的稳定性，SDC-纳米凝胶的平均粒径在离子强度从0增加到200mM的范围内先显著降低，然后增加。然而，增加的幅度仍然很小。此外，PDI的增加也不显著。对于储藏稳定性，当SDC-纳米凝胶在4℃下储存0-25d时，其粒径分布也基本保持不变。
表1 SDC-纳米凝胶在不同加热温度、NaCl浓度和储存时间下的粒径和PDI
(4)制备过程对负载姜黄素的SDC-纳米凝胶的影响
如图7所示，姜黄素标准曲线为y＝0.09119x+0.03927，且R2＝0.99704，说明姜黄素浓度与吸光度呈现良好的线性关系。
姜黄素是姜黄根茎中的天然多酚抗氧化剂，具有抗炎，抗衰老、抗氧化和其他药理活性。由于姜黄素在水中的溶解性差，化学稳定性和生物利用度低，使得其应用受到了限制，因此需要利用纳米递送系统载荷姜黄素以提高其性能，而把营养因子包埋到载体的方法大致分为两类：一类是载体构建的同时包埋营养因子，另一类是载体构建完成后通过特定的相互作用荷载营养因子，本研究的共组装包埋法为第一类包埋方法，直接包埋法为第二种包埋方法。
如图8所示，为通过共组装包埋法和直接包埋法载荷姜黄素的溶液，DCUR-SDC相较于SCUR-SDC颜色更深，与将姜黄素直接溶于水中相比，包埋后的姜黄素在水中的溶解度有显著提高，游离姜黄素溶解度仅为11ng/mL，经过包封后SCUR-SDC中姜黄素的溶解度为12.07ug/mL，而DCUR-SDC中姜黄素的溶解度为16.15ug/mL，并具有良好的分散体系，使得姜黄素包封在纳米凝胶后几乎没有沉淀。因此，通过加热凝胶法包埋姜黄素可以显著改善姜黄素的水分散性，这对于姜黄素的工业化应用具有较大意义。
所形成的载荷姜黄素的纳米凝胶的具体相关指标如图9和表2所示，图9中显示了SCUR-SDC和BDCUR-SDC的TEM图像，由TEM可知，两种纳米凝胶均显示出具有光滑边界和小于100nm粒径的球形，二者在形貌上无显著差异。由表2中的DLS数据可知，SCUR-SDC的粒径为201.7nm，大于DCUR-SDC的181.3nm，二者的PDI均小于0.21，表明载荷了姜黄素后的纳米凝胶形成了良好的分散体系。而TEM和DLS获得的尺寸值之间的差异可能与用于制备TEM可视化样品的纳米水凝胶的干燥过程有关。SCUR-SDC载荷量为12.69％，低于DCUR-SDC的17.11％的载荷量，且DCUR-SDC的包封率为89.10％，显著高于SCUR-SDC的66.10％的包封率，表明通过直接包埋法包封的姜黄素包埋率和载量更高，这可能是因为自组装包埋法过程中姜黄素在SDC自组装过程中受热部分分解，导致总含量下降，包埋率和载荷量降低。因此，本发明选择直接包埋法对姜黄素进行包埋。
表2负载姜黄素的SDC-纳米凝胶基本指标
(5)DCUR-SDC的抗氧化性分析
DPPH是一种含有色原自由基的化合物，可以直接与抗氧化剂反应。当抗氧化剂通过供氢清除DPPH自由基，形成稳定的DPPH分子时，颜色由紫色变为黄色。姜黄素具有较强的清除DPPH自由基能力，但其在水中极低的溶解度，将姜黄素溶解在乙醇溶液中溶解度较高，能发挥其清除自由基能力。因此，我们比较了姜黄素水溶液、姜黄素乙醇溶液和空载的纳米凝胶溶液以及DCUR-SDC对DPPH自由基清除的能力，并且以Ve作为阳性对照。由图10可知，在姜黄素浓度相同的情况下，对照组Vc的DPPH自由基清除能力为77.89％，DCUR-SDC为79.64％，远远大于水中游离的姜黄素的6.94％，甚至略高于溶解在乙醇中的姜黄素的DPPH自由基清除能力，这意味着纳米凝胶的包埋技术显著提高了姜黄素在水溶液中的DPPH自由基清除能力。还测量了空载的纳米凝胶的DPPH自由基清除能力，但是发现它清除能力较低，显著低于姜黄素乙醇溶液和DCUR-SDC，因此，负载DCUR-SDC的抗氧化活性主要是由于姜黄素而不是纳米凝胶。
铁还原能力分析是描述化合物抗氧化活性的另一种方法，它是利用抗氧化物质作为电子供应体，与铁氰化钾作用而形成亚铁氰化钾，进一步和氯化铁中的Fe3+形成普鲁士蓝，其在700nm处较强的吸收。图11为姜黄素水溶液、姜黄素乙醇溶液和空载的纳米凝胶溶液以及DCUR-SDC的铁还原能力，并且以Vc作为阳性对照。由图11可知，在姜黄素浓度相同的情况下，对照组Ve的铁还原力为0.32，DCUR-SDC为0.30，略低于溶解在乙醇中的姜黄素的铁还原力的0.31，远远大于水中游离的姜黄素的0.035，表明DCUR-SDC的铁还原能力远远强于未包埋的姜黄素水溶液，这意味着纳米凝胶的包埋技术显著提高了姜黄素在水溶液中的铁还原力，这也与上面测得的DPPH自由基清除能力相吻合。
羟基自由基是氧自由基中活性最强的一种自由基，能够很容易地氧化各种生物大分子，所以，清除羟基自由基对防止食品腐败和各种疾病的发生具有重要意义。因此，用羟基自由基清除能力评价抗氧化剂对过氧化氢等自由基的清除活性。图12为姜黄素水溶液、姜黄素乙醇溶液和空载的纳米凝胶溶液以及DCUR-SDC的羟基自由基清除能力，并且以Vc作为阳性对照。由图12可知，在姜黄素浓度相同的情况下，对照组Vc的羟基自由基清除能力为62.49％，游离在水溶液中的姜黄素的羟基自由基清除能力极低，约为6.40％，而DCUR-SDC的羟基自由基清除能力为62.31％，这表明着纳米凝胶的包埋技术显著提高了姜黄素在水溶液中的羟基自由基清除能力，这也与上述DPPH自由基清除能力和铁还原能力的结果相吻合。
(6)DCUR-SDC的稳定性分析
不同光照下游离姜黄素和DCUR-SDC的贮藏稳定性的比较如图13所示，由图可知，随着贮藏时间的增加，所有样品的姜黄素的保留率均逐渐降低。自然光下，贮藏25天后游离姜黄素的保留率仅为13.99％，避光贮藏能够有效的延长游离姜黄素的贮藏期，但25天后保留率为22.05％，仍然较差。经过SDC包埋的姜黄素的光稳定性有了明显的提高，避光贮藏25天后，DCUR-SDC的保留率为72.31％，即使在自然光条件下，25天后DCUR-SDC的保留率仍能达到65.60％。可以得出结论，DCUR-SDC体系对有利姜黄素具有光保护作用，可以显著提高姜黄素的光稳定性。
不同温度下游离姜黄素和DCUR-SDC的贮藏稳定性的比较如图14所示，由图可知，随着贮藏时间的增加，所有样品的姜黄素的保留率均逐渐降低，在50℃的条件下贮藏25天后，游离姜黄素的保留率仅为9.90％，DCUR-SDC的保留率为43.31％，经过SDC的包埋处理使得姜黄素具有一定耐热性，但仍不太适于较高温度贮藏。低温更有利于姜黄素的保存，在25℃下贮藏25天后DCUR-SDC的保留率为45.11％，高于游离姜黄素的保留率17.35％，在4℃下贮藏25天后DCUR-SDC的保留率为72.18％，高于游离姜黄素的保留率17.83％，说明SDC包封能够有效的提高姜黄素的温度稳定性。
(7)DCUR-SDC的体内外生物利用度分析
生物利用度可定义为化合物“在胃肠道环境中可溶解且可吸收”或“胃肠道基质释放的外部剂量分数”。特别是亲脂性成分的生物利用度与这些化合物在小肠消化过程中形成的混合胶束相的比例有关。因此，在本实验中，生物利用度被计算为在体外消化后从胶束相中回收的原始姜黄素含量的分数，如图15显示了游离姜黄素和DCUR-SDC模拟胃肠消化后的生物利用度，对于游离姜黄素，其在模拟胃消化后的生物利用度为13.68％，低于DCUR-SDC在模拟胃消化后的24.02％。而模拟肠道消化后，姜黄素的生物利用度为17.41％，显著低于DCUR-SDC在肠道中的55.41％。说明SDC-纳米凝胶的包封能够有效的提高姜黄素肠道中的生物利用度。
实施例3负载姜黄素的纳米凝胶对橙汁品质的影响
实验方法：
市售新鲜橙子洗净去皮后，加入榨汁机中榨汁，加水配置成果汁含量为30％的橙汁，用200目滤布过滤，再加入5％的白砂糖与0.05％的柠檬酸。然后向调配好的橙汁中加入DCUR-SDC，使得姜黄素的浓度分别为0、5、10、20、30和40mg/100mL，然后进行均质处理，均质压力为40MPa，循环两次。在90C加热1min灭菌，调配好后立即进行指标测定。
实验结果：
(1)负载DCUR-SDC的橙汁饮料理化指标测定
负载DCUR-SDC的橙汁饮料理化指标测定色泽是评价橙汁饮料感官品质的重要指标之一，良好的橙汁饮料色泽有助于激发消费者的购买欲。而对于功能性食品不能改变食品原有色泽要求，本研究对五种姜黄素浓度下的橙汁饮料的色泽进行了测定。图16为姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料，可以看出，随着姜黄素浓度的增加橙汁饮料颜色基本不变。运用色差仪测量得到的L*、a*、b*值中，L*为明度指数，L*值越小越暗，L*值越大越亮；a*值表示呈色物质的红绿偏向，a*为正值表示偏向红色，相反a*为负值表示偏向绿色；b*值表示呈色物质的黄蓝偏向，b*为正值则偏向黄色，b*为负值则偏向蓝色。结合由表3可知，在6种不同姜黄素浓度条件下，亮度L*随姜黄素浓度的升高而升高，即橙汁饮料的亮度逐渐升高，但除40mg/l00mL姜黄素浓度外均不显著。表中a*值随样品中姜黄素浓度的变化均为正值，说明橙汁饮料样品都偏红色，随着姜黄素增加，a*均显著增加，表明姜黄素的添加对橙汁饮料颜色的红绿偏向有显著影响。表中b*值随样品中姜黄素浓度的变化均为正值，说明橙汁饮料样品都偏黄色，随着姜黄素增加，b*均显著增加，表明姜黄素的添加对橙汁饮料颜色的黄蓝偏向有显著影响。总色差(ΔE值)是评估橙汁饮料总体颜色变化的参数，用于两个样品的对照分析，ΔE的值越大，则样品之间色泽差异越显著，当ΔE值大于3.0时，消费者可以观察到显著的颜色差异。当姜黄素浓度小于40mg/100mL时，添加了DCUR-SDC的橙汁饮料的ΔE值均小于3.0，当姜黄素浓度为40mg/100mL时，添加了DCUR-SDC的橙汁饮料的ΔE值均大于3.0，因此，本研究所选定的姜黄素浓度制备的功能性饮料基本符合要求。
表3不同姜黄素浓度的DCUR-SDC对橙汁饮料色泽的影响
由表4可知，随着姜黄素浓度的增加，DCUR-SDC橙汁饮料的粒径和PDI均增加，总酸含量无显著差异，蛋白含量逐渐增加，可溶性固形物含量逐渐增加，添加了姜黄素的DCUR-SDC橙汁饮料的感官评分均显著高于未添加姜黄素的DCUR-SDC橙汁饮料，其色泽均匀、香味适宜，有明显的橙色和橙子味，溶液均匀、流动性好，不分层，无可见外来杂质。
表4不同姜黄素浓度的DCUR-SDC对橙汁饮料其他理化性质的影响
(2)负载DCUR-SDC的橙汁饮料抗氧化性能测定
由图17可知，姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/l00mL的DCUR-SDC橙汁饮料比未加姜黄素的橙汁饮料的DPPH自由基清除率有一定提高，且随着姜黄素浓度的增加，DPPH自由基清除率也随之增加，当姜黄素浓度为40mg/l00mL时的橙汁饮料的清除率最高，为97.44％，说明包埋后的姜黄素本身营养活性成分对DPPH自由基的清除有显著作用。
由图18可知，姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料比未加姜黄素的橙汁饮料的铁还原能力有一定提高，且随着姜黄素浓度的增加，铁还原能力也随之增加，当姜黄素浓度为40mg/100mL时的橙汁饮料的铁还原能力最高，为0.707，说明包埋后的姜黄素本身营养活性成分对铁还原能力有显著作用。
由图19可知，姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料比未加姜黄素的橙汁饮料的羟基自由基清除能力有一定提高，且随着姜黄素浓度的增加，铁还原能力也随之增加，当姜黄素浓度为40mg/100mL时的橙汁饮料的的清除率最高，为98.47％，说明包埋后的姜黄素本身营养活性成分对羟基自由基的清除有显著作用。
(3)负载DCUR-SDC的橙汁饮料稳定性分析
DCUR-SDC储存稳定性评估可以预测其在功能性食品中的保存期限。测定姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料在21天内的保留率，以研究其储存稳定性。如图20所示，在储存期间，所有浓度下的姜黄素含量均呈下降趋势，可以看到姜黄素浓度越大，下降趋势越明显，当姜黄素浓度为40mg/100mL时，姜黄素在第21天的保留率仅为66.63％。
离心沉淀率是衡量果汁稳定性好坏的重要因素，悬浮沉淀物越多，即沉淀率越高，果汁越不稳定。因此，测定了姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料在21天内的离心沉淀率，以研究其储存稳定性。由图21可以得出，随着贮藏时间的增加，添加了负载DCUR-SDC的橙汁饮料的离心沉淀率均增加，且姜黄素浓度越高的DCUR-SDC橙汁饮料的离心沉淀率越高。未添加DCUR-SDC的橙汁饮料的离心沉淀率随着贮藏时间的增加而增加，在第12天时的离心沉淀率超过了添加了姜黄素浓度为20mg/100mL的负载DCUR-SDC的橙汁饮料的离心沉淀率。但所有浓度的橙汁饮料的离心沉淀率变化均小于1％。
平均粒径和PDI是评价分散体系稳定性的重要指标。因此，测定了姜黄素浓度为0、5、10、20、30、40mg/100mL的DCUR-SDC橙汁饮料在21天内的平均粒径和PDI，以研究其储存稳定性。由图22(A)可以得出，随着贮藏时间的增加，所有浓度下的橙汁饮料的平均粒径均增加，姜黄素浓度越高的DCUR-SDC橙汁饮料的平均粒径越高，但均小于500nm，当姜黄素浓度为40mg/100mL时，姜黄素在第21天的平均粒径也仅增加到了447nm。由图22(B)可以得出，随着贮藏时间的增加，所有浓度下的橙汁饮料的PDI呈现无规律小范围浮动，且最大PDI也小于0.3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种纳米凝胶，其特征在于，所述纳米凝胶由大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶负载姜黄素制成；
制备方法包括以下步骤：
S1、使大豆分离蛋白和葡聚糖反应得到大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物；所述大豆分离蛋白和葡聚糖反应的方法为干热法；
所述步骤S1中，所述干热法中葡聚糖分子量为20-70kDa，SPI/葡聚糖质量比例为1:1-3，反应时间为2-4d；
所述步骤S1中，所述干热法为：用磷酸缓冲盐溶液将所述大豆分离蛋白溶解，充分水合，加入所述葡聚糖，再次充分水合后，将溶液冷冻干燥，置于57-63℃、相对湿度76％-82％的培养箱中反应一定时间；
S2、通过直接包埋法负载姜黄素制备得到所述纳米凝胶；
所述直接包埋法为：将所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物通过加热凝胶法制备得到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶，再将姜黄素乙醇溶液添加到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物纳米凝胶溶液中，并将混合液进行均质处理，得到所述纳米凝胶；
所述加热凝胶法为：将浓度为0.7-1.3mg/mL的大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物分散于水中，调节pH至3.5-4.1，在87-93℃下加热37-43min后得到所述大豆分离蛋白-葡聚糖轭合物制备的纳米凝胶。
2.根据权利要求1所述的纳米凝胶，所述纳米凝胶的粒径为：180-210nm，多分散指数为：0.130-0.210，ζ-电势：-0.255～-3.385mV。
3.权利要求1-2任一项所述的纳米凝胶在制备酸性果汁饮料中的应用。
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