CN114651989A - 一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种阿胶肽‑铁螯合物微胶囊及其制备方法，涉及微胶囊技术领域。本发明所述微胶囊的制备方法包括以下步骤：向阿胶肽‑铁螯合物中加入植物油、蛋白质溶液进行均质，再加入植物胶溶液，800‑1000r/min的转速包埋10‑50min，后进行预冷、冷冻干燥，得到所述阿胶肽‑铁螯合物微胶囊；所述微胶囊的壁芯比为0.3‑3：1；所述蛋白质和植物胶的质量比为3‑7：5。本发明所述的微胶囊不仅改善了阿胶肽‑铁螯合物原有铁剂的铁锈味，提高了稳定性，而且因微胶囊化过程中阿胶肽‑铁螯合物微观结构由芯材的片状疏松多孔结构变为了微胶囊的球形致密结构，微胶囊产品的缓释效果更明显，生物可及性更强且具有明显的补血功效，获得显著的技术效果。

Description

一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及微胶囊技术领域，尤其涉及一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法。
背景技术
阿胶(Colla CoriiAsini，Ejiao)，通过煎煮加工浓缩马科动物驴(Equus asinusL.)的皮制成的固体胶，因其具有对血液的滋补与调节机体滋阴润燥的功能，是一种传统的滋养补血的药材、药食同源的滋补食材。现代药理学研究表明阿胶产品在改善缺铁性贫血有明显功效，是具有巨大开发利用潜力和研究价值的食品原料。
目前补铁剂种类主要有：无机亚铁盐类(如硫酸亚铁)、有机酸盐类(如乳酸亚铁)、新型补铁剂大分子螯合铁(如多糖-铁复合物)；此外，还有安全性存在争议的静脉用铁剂。相比而言，口服补铁剂在临床治疗的应用更加广泛。比起第一代补铁剂游离铁毒性强、感官差，第二代补铁剂成本高、治疗周期长，新型补铁剂在生物利用率以及营养因子的补充方面都表现得更加优秀，肽-铁螯合物就是其中一种。肽-铁螯合物属于一种金属螯合肽，金属螯合肽是一种生物活性肽，可以与Ca、Fe、Zn、Cu等金属离子进行螯合，在机体中可以作为金属离子的载体，对金属离子的转运吸收起到了推进作用，对缓解由微量元素缺乏导致的缺乏症，如骨质疏松症(Ca缺乏)，缺铁性贫血(Fe缺乏)，儿童发育迟缓(Zn缺乏)等具有重要意义。
虽然铁在机体中起着不可或缺的作用，但将铁引入食物中往往会表现出不良风味。例如，硫酸亚铁在添加到婴儿谷类食品和玉米饼中时会引起不可接受的颜色变化，在水果饮料中会产生金属味，而且还会在鱼露和茶汤中形成沉淀物。因此，酶解肽-铁螯合物具有稳定性不高、易在胃酸环境下被消化、有不良风味如铁锈味等特点，因此进行微胶囊化，选用相应壁材将其进行包埋以改善以上不足。
微胶囊(microencapsule)是一种微型“容器”，其外层是高分子材料聚合物，包裹着内层的物质，可能是固、液、气态物质，在微胶囊化的过程中形成了有壁壳的微型胶囊，从而达到保护、控释等效果；其中，被包覆的物质为芯材，包覆芯材的物质叫做壁材，也叫包材。
在食品行业的实际应用中，微胶囊有延缓芯材氧化、遮蔽不良风味、减少芯材挥发、抵御不良环境、增强芯材缓释作用等用途。微囊化过程中使用的壁材应对活性组分不起作用，水溶性高，内部材料稳定，易于供应，价格低廉。
根据相关研究，食品微胶囊的制备方法有喷雾干燥法、喷雾冻凝法、凝聚法、界面聚合法、锐孔法、复相乳液法、分子包埋法等。喷雾干燥法一般用于处理亲油性液体材料微胶囊，疏水性强的芯材更为适用。热敏性的物质可以采用冷冻干燥法，能够在低温条件下干燥产品，使其维持相应的功能成分。其他的方法如挤压法更适用于香精香料的包埋。
由于近年来，随着金属螯合物的不断发展，其微胶囊制品因更好的稳定性、缓释性也逐渐得到了更多关注。靳秋用锐孔-凝固浴法制备林蛙胶原蛋白多肽亚铁螯合物，选用海藻酸钠作为壁材，采取真空冷冻干燥得到微胶囊产品，有利于产品的保藏和不良风味的掩盖；邵士凤等用冷冻干燥法对三种多糖作为壁材包埋硫酸亚铁的效果进行优化，得到最佳工艺参数；胡晓波等人制备了苏氨酸铁纳米脂质体，探讨了其稳定性与对牛奶品质的影响；李颖杰等人用双层包埋法制备了鱼糜酶解蛋白亚铁螯合肽微胶囊，有效地保护了螯合肽在空气中的氧化稳定性。可见，目前对肽-铁螯合物的微胶囊化也处于探索与发展阶段。
阿胶肽-铁螯合物是用阿胶酶解液与Fe2+溶液螯合制备而成，阿胶作为药食同源的传统滋补食材，因其对改善贫血症状、提高免疫系统能力、延缓皮肤老化等较为明显的作用，向来受女性喜爱。但是阿胶肽-铁螯合物在消化过程中易解离，降低了它的生物可及性和生物利用度；此外，阿胶肽-铁螯合物与其他补铁剂类似，具有铁锈味，影响服用者感官体验。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中阿胶肽-铁螯合物生物可及性和生物利用度低及风味(铁锈味)不佳的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法。制备的微胶囊产品的缓释效果更明显，生物可及性更强，且具有明显的补血功效，获得显著的技术效果。
本发明的第一个目的是提供一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，包括以下步骤：向阿胶肽-铁螯合物中加入植物油、蛋白质溶液进行均质，再加入植物胶溶液，800-1000r/min的转速包埋10-50min，后进行预冷、冷冻干燥，得到所述阿胶肽-铁螯合物微胶囊；所述微胶囊的壁芯比为0.3-3：1；所述蛋白质和植物胶的质量比为3-7：5。
在本发明的一个实施例中，所述植物油为大豆油、花生油和菜籽油中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述蛋白质为大豆分离蛋白、花生蛋白和豌豆蛋白中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述植物胶为果胶、卡拉胶和魔芋胶中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述阿胶肽-铁螯合物和大豆油的质量比为1：2-5。
在本发明的一个实施例中，所述蛋白质溶液的质量浓度为10％-25％，pH为6.0-10.0。
在本发明的一个实施例中，所述植物胶溶液的质量浓度为10％-25％。
在本发明的一个实施例中，所述预冷的温度为-25℃至-15℃，预冷的时间为8-14h。
在本发明的一个实施例中，所述冷冻干燥的温度为-60℃至-40℃，冷冻干燥的时间为30-42h。因为阿胶肽-铁螯合物的结构稳定性可能会受温度及外力作用的影响，并且拟采用的壁材与相关材料也对热较为敏感，所以不采用喷雾干燥法；因为要保持阿胶肽-铁螯合物功能活性的考虑，所以不采用相关的化学包埋方法；因为温和的包埋与干燥条件要求，最终选择高速乳化法对阿胶肽-铁螯合物进行包埋、选择冷冻干燥法得到阿胶肽-铁螯合物微胶囊粉末。
本发明的第二个目的是提供一种所述的方法制备的阿胶肽-铁螯合物微胶囊。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法中微胶囊是帮助阿胶肽-铁螯合物提升消化过程中稳定性的有效途径，通过利用更稳定的物质进行包埋、保护，从而达到减缓产品在胃环境中解离、提升生物可及性的目的。选用蛋白质与植物胶作为复合壁材对阿胶肽-铁螯合物进行包埋。利用蛋白质的风味遮掩铁锈味，获得相对均匀的微胶囊；利用植物胶优良的胶凝性可得到稳定的产品，提高产品的生物可及性。
(2)本发明所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊以蛋白质与植物胶作为复合壁材，采用高速乳化法对阿胶肽-铁螯合物进行包埋，采用冷冻干燥法得到阿胶肽-铁螯合物微胶囊。制备的阿胶肽-铁螯合物微胶囊不仅改善了阿胶肽-铁螯合物原有铁剂的铁锈味，提高了其在不同溶液环境中的稳定性，而且因微胶囊化过程中阿胶肽-铁螯合物微观结构由芯材的片状疏松多孔结构变为了微胶囊的球形致密结构，微胶囊产品的缓释效果更明显，生物可及性更强且具有明显的补血功效，获得显著的技术效果。
(3)本发明所述的阿胶肽-铁螯合物微胶在通过分析比较确定选用壁材与包埋方法后，以包埋率为指标，进行单因素和正交试验设计，优化相应工艺参数，便于标准化生产工艺、扩大生产、提高产量、减少阿胶肽-铁螯合物在生产过程中的损失。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明测试例1中壁芯比(w：w)对包埋率的影响图。
图2为本发明测试例1中大豆分离蛋白：果胶(w：w)对包埋率的影响图。
图3为本发明测试例1中包埋时间对包埋率的影响图。
图4为本发明测试例2中样品的感官状态图；其中，a为阿胶肽-铁螯合物，b为阿胶肽-铁螯合物微胶囊。
图5为本发明测试例2中样品的粒径分布图；其中，a为阿胶肽-铁螯合物，b为阿胶肽-铁螯合物微胶囊。
图6为本发明测试例3中样品的电镜对比图；其中，a为阿胶肽-铁螯合物1000x，b为阿胶肽-铁螯合物微胶囊1000x，c为阿胶肽-铁螯合物5000x，d为阿胶肽-铁螯合物微胶囊5000x。
图7为本发明测试例4中模拟胃肠道消化过程中铁释放量曲线图；其中，a为模拟胃消化过程中铁释放量曲线，b为模拟肠消化过程中铁释放量曲线。
图8为本发明测试例4中温度对阿胶肽铁螯合物及其微胶囊稳定性的影响图。
图9本发明测试例4中灌胃前后小鼠粪便铁排出量；其中，a为灌胃前小鼠粪便铁排出量，b为灌胃后小鼠粪便铁排出量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
(1)主要材料与试剂
材料：东阿阿胶粉，购自东阿阿胶股份有限公司；果胶(型号102)、大豆分离蛋白(型号D-150)，均购自苏州赛迈尔生物科技有限公司。
试剂：乙醇(无水乙醇)、七水合硫酸亚铁(硫酸亚铁)、氢氧化钠、浓盐酸、无水碳酸钠、五水合硫酸铜(Ⅱ)、四水合酒石酸钾钠、抗坏血酸、1，10-邻菲啰啉、一水合乙酸钠、三水合乙酸钠、冰醋酸、一水合柠檬酸、磷酸二氢钾等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。碱性蛋白酶(≥200U/mg)，购自北京索莱宝科技有限公司。木瓜蛋白酶(BR，800U/mg)、胃蛋白酶(猪胃黏膜，USP级，1：30000)、胰蛋白酶(猪胰，BR，1：250)，均购自上海源叶生物科技有限公司。
(2)仪器设备
Centrifuge 5804R台式冷冻离心机、Centrifuge 5430R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；HH-3A恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；SCIENTZ-10N冷冻干燥机(宁波新芝生物股份有限公司)；ST3100 pH计(常州奥豪斯仪器有限公司)；Epoch酶标仪(美国Biotek公司)；纳米粒度及Zeta电位仪(英国马尔文公司)；冷场发射扫描电子显微镜(日本株式会社日立高新技术公司)；AR224CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；THZ-C-L台式冷冻恒温振荡器(金坛荣华公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；XH-C旋涡混合器(无锡沃信仪器制造有限公司)；AMM系列多点磁力搅拌器9T(加热)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；XH-800B智能温压双控微波消解仪(北京祥鹄科技发展有限公司产品)。
实施例1
一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法，具体包括以下步骤：
1、阿胶肽-铁螯合物(EPI)的制备
(1)阿胶烊化
称量5.00g阿胶粉，取10.00mL去离子水溶解于50.00mL离心管中，用旋涡混合器将溶液混匀后，通过恒温水浴锅进行保温，50℃恒温水浴10min，烊化至阿胶粉完全溶解、呈均一体系。
(2)阿胶酶解
根据课题组前期实验研究确定阿胶复合酶解法所选用酶的参数。选用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶进行酶解，相关酶的理化指标见表1。
表1水解酶的理化指标
Figure BDA0003543037460000071
取上述阿胶烊化液，用2.00mol/L的盐酸溶液和0.50mol/L的氢氧化钠溶液调节烊化液pH＝7.0，加入75.0mg木瓜蛋白酶，用旋涡混合器混匀后置于台式冷冻恒温振荡器，50℃振荡酶解4h。4h后取出，调节pH＝9.0，加入250.0mg碱性蛋白酶，混匀后45℃振荡酶解3h。3h后酶解结束，取出酶解液。利用100℃恒温水浴锅对酶解液进行时长为10min的灭酶，冷却至室温后进行离心(4℃，6500r/min，20min)，收集上清液。
(3)阿胶肽-铁螯合物制备
向上清液中加入10.00mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.20mol/L)，调节溶液pH＝5.0，加入22.62mL硫酸亚铁溶液(0.20g/mL)，混匀后30℃振荡螯合40min。40min后结束螯合，得到螯合液。
以螯合液：无水乙醇(v：v)＝1：9的比例向螯合液中加入无水乙醇，慢加快搅，静置24h后倒去上清液，得到阿胶肽-铁螯合物沉淀。将得到的沉淀置于45℃恒温水浴锅中静置24h，得到干燥阿胶肽-铁螯合物样品，用研钵将样品研磨至粉末状，收集后置于干燥器中备用。
2、阿胶肽-铁螯合物微胶囊制备
选择制备好的阿胶肽-铁螯合物加入3倍质量的大豆油制成乳化2min，加入6倍10％的大豆分离蛋白溶液(pH＝8.0)的大豆分离蛋白进行均质2min，以上两步均在均质器中(2000r/min)中进行，随后融入4倍10％果胶溶液，在电磁搅拌器下以900r/min的转速包埋30min，将处理好的溶液冷却-20℃保存过夜后，冷冻干燥(-50℃，36h)制成粉末，得到阿胶肽-铁螯合物微胶囊，壁芯比(w：w)为3：1。
实施例2
一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法，具体包括以下步骤：
选择实施例1制备好的阿胶肽-铁螯合物加入3倍质量的花生油制成乳化2min，加入6倍10％的大豆分离蛋白溶液(pH＝8.0)的花生蛋白进行均质2min，以上两步均在均质器中(2000r/min)中进行，随后融入4倍10％卡拉胶溶液，在电磁搅拌器下以900r/min的转速包埋30min，将处理好的溶液冷却-20℃保存过夜后，冷冻干燥(-50℃，36h)制成粉末，得到阿胶肽-铁螯合物微胶囊，壁芯比(w：w)为3：1。
实施例3
一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊及其制备方法，具体包括以下步骤：
选择实施例1制备好的阿胶肽-铁螯合物加入3倍质量的菜籽油制成乳化2min，加入6倍10％的大豆分离蛋白溶液(pH＝8.0)的豌豆蛋白进行均质2min，以上两步均在均质器中(2000r/min)中进行，随后融入4倍10％魔芋胶溶液，在电磁搅拌器下以900r/min的转速包埋30min，将处理好的溶液冷却-20℃保存过夜后，冷冻干燥(-50℃，36h)制成粉末，得到阿胶肽-铁螯合物微胶囊，壁芯比(w：w)为3：1。
测试例1
基于实施例1分析影响微胶囊包埋率的主要因素有壁芯比(w：w)、大豆分离蛋白(SPI)：果胶(w：w)、包埋时间等。本实验通过单因素实验考察，以包埋率为指标，确定最佳的微胶囊工艺参数。
其中，包埋率的测定与计算以Fe2+的含量为指标，由式1计算包埋率。
Figure BDA0003543037460000081
其中，X为包埋率；
x1为200.0mg肽-铁螯合物总铁含量(μg)；
x2为200.0mg制备的微胶囊中铁含量(μg)。
1、壁芯比(w：w)对微胶囊工艺的影响实验
取0.200g阿胶肽-铁螯合物粉末，加入0.600g大豆油，用D-160小型均质器进行均质，采用2档均质5min，可得到均一棕褐色油状体系，即大豆油-螯合物乳液。设计壁芯比(w：w)为3：1、2：1、1：1、1：2、1：3，保持壁材中大豆分离蛋白：果胶(w：w)为5：5。先向大豆油-螯合物乳液体系中分别加入质量分数为10％的SPI溶液12.000g、8.000g、4.000g、2.000g、1.333g，采用2档均质10min后得到O/W乳液，再将其转移至磁力搅拌器，分别加入质量分数为10％的果胶溶液12.000g、8.000g、4.000g、2.000g、1.333g，以900r/min的转速包埋20min。所得产物进行后续冷冻干燥，进行包埋率的测定。
结果如图1所示，随着壁芯比(w：w)逐渐增加，微胶囊的包埋率呈先升高后降低的趋势，并在壁芯比(w：w)为2：1时达到顶峰，包埋率达74.30％；此外，当壁芯比(w：w)为1：3与1：2时，包埋率相差不大，都比较低，只有56.00％左右。
分析原因，是当壁芯比(w：w)过小的时候，体系中的壁材过少，不足以完全包埋芯材，包覆能力不足。此外，SPI与果胶在微胶囊化过程中，SPI因其高电荷性和亲水、疏水基团，在体系中具有强乳化性，这种性质能更好地稳定芯材，利于包埋；而果胶因其高稳定性、乳化性、胶凝性可以作为乳化稳定剂稳定水油乳浊液。由于SPI与果胶含量不足，体系中溶液乳化性不足，果胶的缺乏使体系中稳定性和胶凝性下降，无法形成均一稳定的溶液体系，不能形成凝胶网格状体系，易造成芯材外漏。而随着壁材的不断增加，体系中过多壁材造成凝集，影响均质效果，因此在壁芯比(w：w)达到3：1时，包埋率不升反降。
2、大豆分离蛋白(SPI)：果胶(w：w)对微胶囊工艺的影响实验
取0.200g阿胶肽-铁螯合物粉末，加入0.600g大豆油，用D-160小型均质器进行均质，采用2档均质5min，可得到均一棕褐色油状体系，即大豆油-螯合物乳液。设计壁材中SPI：果胶(w：w)为3：7、4：6、5：5、6：4、7：3，保持壁芯比(w：w)为2：1。先向大豆油-螯合物乳液体系中分别加入质量分数为10％的SPI溶液4.800g、6.400g、8.000g、9.600g、11.200g，采用2档均质10min后得到O/W乳液，再将其转移至磁力搅拌器，分别加入质量分数为10％的果胶溶液11.200g、9.600g、8.000g、6.400g、4.800g，以900r/min的转速包埋20min。所得产物进行后续冷冻干燥，进行包埋率的测定。
结果如图2所示，随着壁材中SPI所占比例不断增加，包埋率呈现明显的先增后降的趋势，在SPI：果胶(w：w)为3：7时包埋率最小，只有40.96％，在SPI：果胶(w：w)为5：5时包埋率最大，为73.61％。
分析原因，是果胶作为乳化稳定剂，起到稳定SPI与芯材形成的O/W溶液的作用，工艺条件温和，如果果胶含量过高，体系过于黏稠，无法使壁材与芯材充分接触，从而降低了产品的包埋率。当SPI含量大于果胶时，又会导致体系稳定性不够，无法形成足够稳定的蛋格网状结构凝胶结构，在制备过程中也能明显感受到体系不够稳定、粘稠，从而导致一部分芯材外漏，降低了包埋率。
3、包埋时间对微胶囊工艺的影响实验
取0.200g阿胶肽-铁螯合物粉末，加入0.600g大豆油，用D-160小型均质器进行均质，采用2档均质5min，可得到均一棕褐色油状体系，即大豆油-螯合物乳液。保持壁芯比(w：w)为2：1，壁材中SPI：果胶(w：w)为5：5。先向大豆油-螯合物乳液体系中分别加入8.000g质量分数为10％的SPI溶液，采用2档均质10min后得到O/W乳液，再将其转移至磁力搅拌器，分别加入8.000g质量分数为10％的果胶溶液，以900r/min的转速分别包埋10min、20min、30min、40min、50min。所得产物进行后续冷冻干燥，进行包埋率的测定。
结果如图3所示，包埋10min时包埋率最小，为68.64％；在包埋40min时的包埋率最大，达78.72％。分析原因，是包埋10min的时间过短，此时体系还不够均一稳定，造成少部分芯材外漏；20min后的包埋效果都较为理想，差异不大。
综上，可以得到单因素实验优选的微胶囊制备工艺参数。壁芯比(w：w)＝2：1，SPI：果胶(w：w)＝5：5，包埋时间为40min。
测试例2
阿胶肽-铁螯合物微胶囊制备正交试验设计
根据阿胶肽-铁螯合物微胶囊单因素实验结果，以所得微胶囊的包埋率为主要指标，考虑适应生产需求，以壁芯比(w：w)、SPI：果胶(w：w)、包埋时间为考察因素，设计三因素三水平正交试验，探究最佳微胶囊化配方。考虑交互作用，各因素水平表以及正交试验设计方案如表2所示。
表2阿胶肽-铁螯合物微胶囊的正交试验因素水平
Figure BDA0003543037460000111
根据壁芯比(w：w)、SPI与果胶的比例(w：w)以及包埋时间设计正交试验，探究三者之间的主次关系，得到最优、最完备的工艺参数组合。实验中发现各因素对包埋率的影响主次顺序为：A(壁芯比)＞B(SPI：果胶)＞C(包埋时间)，制备阿胶肽-铁螯合物微胶囊的最优参数组合为A3B2C1，即：壁芯比(w：w)为3：1、SPI：果胶(w：w)为6：4、包埋时间为30min。该组合能使包埋率最高，包埋率达86.69％。
测试例3
螯合物与微胶囊的理化性质表征
1、实物形态对比：取实施例1制备的阿胶肽-铁螯合物和微胶囊，拍照进行形态对比分析。如图4所示，图4a中螯合物呈棕褐色，具有阿胶的特征颜色，颗粒小，更干爽；图4b中微胶囊呈淡棕色，分析是大豆分离蛋白和果胶对其的稀释作用，颗粒更大，发生团聚，吸湿性强。二者外观形态有明显差异，且气味也发生了较明显的改变，由铁锈味变为淡淡的乳粉香气。
2、粒径对比：使用激光粒度仪分别测定螯合物与微胶囊的粒径分布，进行对比分析。如图5所示，图5a中酶解法制备的阿胶肽-铁螯合物粒度分布呈偏态分布，分布较为分散，D50为89.48μm，D90为235.80μm，认为粒径测定时物料可能出现聚集；图5b中制备的微胶囊粒度分布较为集中，D50为119.50μm，D90为216.80μm。说明微胶囊化可以制备粒径分布较为集中的产品，改善了芯材粒径分布过于分散的问题。
3、显微结构对比：采用冷场发射扫描电子显微镜(FESEM)扫描，分别放大1000倍、5000倍对比观察螯合物与微胶囊的结构。。
如图6所示，图6a中1000倍电镜下阿胶肽-铁螯合物呈大小不一的片状结构，图6b中微胶囊呈凝聚粘连的球状结构，可见在微胶囊化的过程中，其形态发生了明显变化；图6c中5000倍电镜下观察阿胶肽-铁螯合物，发现其表面有疏松的孔洞，与螯合过程中的肽铁分布有关；图6d中微胶囊呈更明显的包埋球状，表面致密，但球形不够光滑，是因为果胶的包埋使微胶囊表面严密且相互粘连。
测试例4
稳定性及生物可及性探究
1、模拟胃肠道消化稳定性
基于实施例1的基础上，分别制备2.0mg/mL螯合物溶液和微胶囊分散体→各取5.0mL置于50mL离心管，37℃预热10min→加入5.00mL模拟胃液，振荡混匀后置于37℃水浴锅避光保温2h，于消化开始0min、15min、30min、60min、90min、120min时分别取1.00mL反应液，100℃灭酶10min，采用邻菲啰啉比色法对各阶段所取样品Fe2+含量进行测定。在胃消化2h后剩余的4.00mL体系中，加入2.00mL模拟肠液，振荡混匀后置于37℃水浴锅避光保温3h，每隔30min分别取0.50mL反应液，100℃灭酶10min，采用邻菲啰啉比色法对各阶段所取样品Fe2+含量进行测定。
结果如图7所示，图7a中在胃消化初期，肽-铁螯合物就释放出大量Fe2+，随着时间变化，略有浮动；微胶囊在胃消化前30min释放的Fe2+明显较少，在30min至60min这段时间内Fe2+含量升高显著，而在实验时间60min后，Fe2+升高幅度明显不如在其30min至60min所呈现的大，升高趋势减缓。说明微胶囊在消化过程中速度较肽-铁螯合物更加缓慢，但达到胃消化终点时与芯材相差较小，证明其在胃酸环境下稳定性仍有所不足。
图7b中二者在肠道消化过程中Fe2+释放趋势相同，增长都比较缓慢，但微胶囊释放的Fe2+明显低于肽-铁螯合物，这说明在肠道消化环境下，微胶囊比起肽-铁螯合物更稳定。分析其原因，可能是微胶囊中，有大豆分离蛋白与果胶保护阿胶肽-铁螯合物，从而使Fe2+在消化道中保持更久结合形态，便于直接以肽-铁螯合物分子的形式被人体吸收，能够提高其利用率。在60min至90min的消化过程中，肽-铁螯合物和微胶囊组所释放的Fe2+浓度都有所下降，推测此时游离Fe2+与肽重新发生了螯合。氨基酸残基与金属相互作用的有效性与pH有关，肽的净电荷也是如此，它可能变成中性、负性或正电荷，从而阻碍或促进静电相互作用。
2、热稳定性
称取一定质量的阿胶肽铁螯合物加入适量去离子水溶解，分别置于20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃水浴2h，采用邻菲罗啉法测量不同温度条件下阿胶肽铁螯合物的螯合量。
结果如图8所示，通常情况下，阿胶肽铁螯合物的生产、储运、销售及使用温度均为常温。随着温度的升高，阿胶肽铁螯合物Fe2+螯合量均能保持在80％以上，原因是由于阿胶肽铁螯合物仅具备蛋白质复杂空间结构中较为简单的一级结构，相较而言更为稳定，因此对于不同环境温度的耐受能力更强。但铁螯合量随着温度的升高逐渐下降，50℃时螯合量达到最低，50℃以上趋于稳定。经过微胶囊包埋处理后，阿胶肽铁螯合物微胶囊的螯合量得到提升，在各个温度下，螯合量均高于阿胶肽铁螯合物。表明阿胶肽铁螯合物微胶囊具有更高的热稳定性。
3、含水量和吸水率
含水量及吸水性的测定：取实施例1的微胶囊2.0g封装粉干在预先干燥冷却的培养皿，100℃，24h后称重。然后根据式2计算水分含量。
Figure BDA0003543037460000141
吸水率的测定，取最优条件下制备的微胶囊样品2.0g置于培养皿中，放入含有Na2SO4的密闭的塑料容器中让其渗透，一周后，样品增加的质量即为样品的吸水率。阿胶肽铁螯合物及其微胶囊的含水量和吸水率如表3所示。
表3阿胶肽铁螯合物及其微胶囊产品特性
Figure BDA0003543037460000142
通过EPI与其微胶囊化产品吸水性的比较，发现亚铁螯合肽的吸水性是其微胶囊产品吸水性的约两倍左右，即微胶囊产品的吸水性显著低于其芯材自由状态下的吸水性，更便于储藏。
(4)肠道缓释行为分析
动物进驻后，建立缺铁性贫血(IDA)小鼠模型，IDA模型组小鼠饲喂低铁饲料，饮用去离子水3周后，观察到小鼠开始出现毛皮粗糙稀疏且缺乏光泽、精神萎蔫不振等现象。饲养到后期，部分小鼠开始出现背部毛发脱落、活动量较少的现象。喂养期间，从第2周开始，每周定期对小鼠进行尾静脉采血，测定正常组和模型组小鼠血液中HGB含量，直至小鼠HGB含量低于标准浓度90g/L即显示造模成功。当饲喂到第4周时，小鼠的血液中HGB含量为85.67±3.04g/L，模型组小鼠血液中的HGB含量与正常组小鼠存在显著性差异且低于90g/L(P<0.05)，显示缺铁性贫血模型造模成功。
将实验动物分为EPI组和EPI微胶囊组。灌胃前间隔1h收集小鼠粪便，灌胃前后均正常饲喂低铁饲料，正常饮用去离子水。以中剂量2.0mg Fe/kg·bw对小鼠灌服EPI和EPI微胶囊溶液，灌胃后2h开始，每间隔1h收集小鼠粪便，并进行低温冷冻干燥，称量各时段粪便样品重量及进行含铁量测定。
灌胃前收集小鼠各个时段的粪便，并进行铁含量测定，将小鼠粪便冷冻干燥后分别取50-100mg转移到聚四氟乙烯消解罐中，加入5ml浓硝酸按照表4的消解程序进行微波消解，得到澄清溶波，转移消解液超纯水定容至25mL，用原子吸收分光光度法测定小鼠舞便中的铁合量，结果如图9所示。
表4微波消解程序
Figure BDA0003543037460000151
图9a看出由于仍摄食低铁饲料，故IDA小鼠粪便中仍有少量的铁，铁含量呈小范围波动，但总体平稳。
图9b看出当补充了EPI后，粪便中的铁释放量在4h后开始快速上升，在接近6h时达到最高值9.66g/h，6h后铁含量逐渐下降，8h后略微升高，后下降并趋于平缓。补充了EPI微胶囊后，粪便铁含量在6h后快速上升，并在接近8h时达到最高值6.80g/h，8h后铁含量降低，在9-10h略有上升后趋于平缓。从结果中可以发现，补充EPI及微胶囊后粪便中的铁含量都出现了快速上升的高峰，这是由于灌胃补铁剂引起瞬时铁浓度上升，机体消化吸收后排出的剩余铁所引起的粪便铁含量升高。但是EPI微胶囊的铁含量高峰出现的时间较EPI延后2h，分析原因，是微胶囊有壁材包裹，胃肠道中的酶先对果胶和大豆分离蛋白进行酶解消化，故而延缓了EPI释放的时间，表明微胶囊达到了缓释的效果。
分别计算EPI曲线4-7h和EPI微胶囊曲线6-9h下的面积(最高峰出现时段)，其面积大致可以反映粪便排出的最大铁量，表明摄入EPI曲线面积为37.67g，EPI微胶囊的曲线面积为26.92g，表明EPI微胶囊可以降低粪便中残余铁的含量，提高铁的吸收利用度。
综上所述，本发明对阿胶肽-铁螯合物的微胶囊化过程较为完善，通过微胶囊与阿胶肽-铁螯合物的对比，证明了微胶囊化能使阿胶肽-铁螯合物的微观形态发生变化、粒径分布更加均匀，Fe2+的不良风味也得到了改善；通过对溶解性的考察，证明了微胶囊在酸性和中性溶液中可以更缓慢地溶解，比阿胶肽-铁螯合物具有更高的pH稳定性，能有效防止其成分的流失；通过对体外模拟消化稳定性的比较，证明了本申请制备的微胶囊可以暂缓、减少部分消化过程中的损失，提高了阿胶肽-铁螯合物的生物可及性，意味着可能提高阿胶肽-铁螯合物的生物利用度，但仍有较大的改进空间，最终得到风味、稳定性有明显改善的微胶囊产品，有较为广阔的发展利用空间。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：向阿胶肽-铁螯合物中加入植物油、蛋白质溶液进行均质，再加入植物胶溶液，800-1000r/min的转速包埋10-50min，后进行预冷、冷冻干燥，得到所述阿胶肽-铁螯合物微胶囊；所述微胶囊的壁芯比为0.3-3：1；所述蛋白质和植物胶的质量比为3-7：5。
2.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述植物油为大豆油、花生油和菜籽油中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述蛋白质为大豆分离蛋白、花生蛋白和豌豆蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述植物胶为果胶、卡拉胶和魔芋胶中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述阿胶肽-铁螯合物和大豆油的质量比为1：2-5。
6.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述蛋白质溶液的质量浓度为10％-25％，pH为6.0-10.0。
7.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述植物胶溶液的质量浓度为10％-25％。
8.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述预冷的温度为-25℃至-15℃，预冷的时间为8-14h。
9.根据权利要求1所述的阿胶肽-铁螯合物微胶囊的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-60℃至-40℃，冷冻干燥的时间为30-42h。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法制备的阿胶肽-铁螯合物微胶囊。
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