CN112273654A - 一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法及其应用。该方法包括：将大豆蛋白酶解聚集体与水混合，调节pH至碱性，加入姜黄素粉末，混匀后，回调pH至中性，离心，收集上清液，即得大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒分散液，经干燥处理后即得到粉末状大豆蛋白酶解聚集体荷载姜黄素纳米制品。本发明制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，工艺操作简单，制备过程无有机试剂引入，安全无毒副作用，能量输入低，可规模化生产；且制备的纳米颗粒具有稳定性好，荷载量高、生物相容性好等优点，可促进大豆蛋白酶解聚集体作为活性输送载体在新型肽基功能性食品配料中的开发和应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米荷载技术领域，具体涉及一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法及其应用。
背景技术
现代社会人们越来越注重饮食对机体营养及健康的改善功能，大量生物活性物质或功能因子被广泛地应用于各类新型功能食品的研究和开发。然而，大多数食源性功能因子如植物多酚等水溶性差，生物可及性(bioaccessibility)和生物可利用度(bioavailability)较低，是功能性食品开发应用及食品工业亟待解决的技术难题。姜黄素(Curcumin)是一种药理活性很强的天然植物多酚，已发现其具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。然而其水溶性和稳定性差，经人体摄入后在胃肠道环境中不稳定，难以被机体吸收，生物利用率和生物效价低，严重限制了姜黄素在食品工业中的应用。
近年来，纳米技术在功能食品、化妆品和医药等材料加工中的应用备受关注。通过纳米载体输送技术可有效实现活性成分或功能因子的稳态化，提高其生物可利用度。目前常用的纳米输送体系包括纳米颗粒分散体系和纳米乳液体系，其中纳米颗粒分散体系具有高荷载效率、高饱和溶解度和溶出率以及高口服吸收的高重现性等优点成为当前最具有前景的纳米技术策略之一。研究表明，蛋白质、淀粉质、纤维素、脂质等均可作为制备纳米颗粒分散体系的生物材料，用于活性物质的包埋输送。随着食品工业的发展和人们对天然来源的产品或绿色产品的需求日益强烈，越来越驱动着科研工作者寻找或开发更多生物来源的原料用于制备各种纳米材料。
大豆蛋白酶解聚集体是大豆高活性ACE抑制肽生产过程中产生的大量不溶性组分。这部分组分由于难溶于水，工业生产中通常被丢弃或用作动物饲料，很少应用与食品行业供人类消费，大大降低了大豆蛋白的工业价值。然而研究发现这部分副产物氨基酸组成丰富，必需氨基酸含量高，是一种优质的蛋白基资源。因此，开发利用这部分酶解聚集体可以很大程度上提高大豆蛋白的附加值。基于大豆蛋白酶解聚集体难溶于水的颗粒性质，探讨采用纳米技术将其应用于纳米颗粒和活性载体方面具有非常大的开发前景。发明人前期研究发现现代超声技术可诱导大豆蛋白酶解聚集体自组装形成大豆肽基纳米颗粒，且该颗粒能成功荷载姜黄素，提高姜黄素的水溶性和生物可利用度(Zhang,Y.,Zhao,M.,Ning,Z.,Yu,S.,Tang,N.,&Zhou,F.Development of a sono-assembled,bifunctional soypeptide nanoparticle for cellular delivery of hydrophobic activecargoes.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018，66,4208–4218.)。但是超声处理所需的能耗大，不适合产业化大规模应用。因此，寻求和开发新的简单快速、适合于食品工业应用的酶解聚集体纳米组装及荷载技术意义重大。近期，Pan等(Pan,K.,Luo,Y.,Gan,Y.,Bask,S.J.,&Zhong,Q.pH-driven encapsulation of curcumin in self-assembled casein nanoparticles for enhanced dispersibility andbioactivity.Soft Matter,2014,10,6820-6830.)发展出了一种新型的纳米组装和活性荷载方法，即pH驱动法。该方法主要通过调节溶液中溶质所处微环境的酸碱性，使溶质分子在这一过程中发生分子间相互作用并形成新的稳定体系。与现代超声和传统反溶剂等荷载方法相比，该方法具有简单快速、无需能耗输入、无有机试剂引入、绿色安全等优点，是一种适合于工业化生产的纳米组装及活性荷载技术。
基于此，探讨并利用pH驱动法制备具有高活性包埋率和物化稳定性的大豆蛋白酶解聚集体纳米颗粒具有非常广阔的开发应用前景。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法及其应用。
本发明的首要目的是为了提高姜黄素与载体的结合率和物化稳定性，提供一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒，推进大豆蛋白酶解聚集体的绿色可持续化应用和新型肽基功能配料的开发。
本发明的再一目的在于提供上述大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的用途。
本发明提供的制备方法是一种以大豆蛋白酶解聚集体为载体材料，采用pH驱动法制备纳米颗粒并对姜黄素进行包埋的方法。
本发明引进pH驱动法诱导大豆蛋白酶解聚集体的纳米结构化，并实现对姜黄素的高效荷载。pH驱动法是一种低耗能、低成本、绿色安全高效的技术。已有大量研究表明pH驱动法可诱导蛋白质大分子自组装形成纳米结构并用于荷载/包埋生物活性物质。本发明主要通过调节大豆蛋白酶解聚集体的酸碱性，使其发生一定的相互作用，获得了一种包埋率高、稳定性好、粒径较为均一的大豆蛋白酶解聚集体纳米颗粒，并利用该颗粒对姜黄素进行包埋和保护。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
(1)将大豆蛋白酶解聚集体分散于去离子水中，混合均匀，得到聚集体分散液；
(2)调节步骤(1)所述聚集体分散液的pH为碱性，搅拌30min使pH维持稳定，然后加入姜黄素粉末，搅拌均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为7.0-7.5，搅拌30min使pH维持稳定，离心取上清液，得到所述pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。
进一步地，步骤(1)所述大豆蛋白酶解聚集体为大豆活性肽制备过程中的副产物；所述大豆蛋白酶解聚集体的制备，包括：
将商业大豆分离蛋白加入水中，混合均匀，加入Alcalase酶进行酶解反应，得到蛋白酶解液，调节所述蛋白酶解液的pH为7.0，然后沸水浴灭酶处理，离心取沉淀，用水洗涤2-3次，冷冻干燥，得到所述大豆蛋白酶解聚集体。
优选地，所述离心取沉淀的离心速率为8000-10000rpm，离心取沉淀的时间为20min。
进一步地，所述Alcalase酶的加入量为大豆分离蛋白质量的0.1-1wt％；所述酶解反应中的体系pH值为8.0-9.0，酶解反应的温度为45-55℃，酶解反应的时间为4-12h；所述沸水浴灭酶处理的时间为10-20min。
优选地，步骤(1)所述混合均匀，可以在室温下磁力搅拌2h，使体系混合均匀。
进一步地，在步骤(1)所述聚集体分散液的蛋白浓度为5-40mg/mL。
优选地，步骤(1)所述聚集体分散液的蛋白浓度为5-20mg/mL。
进一步地，步骤(2)中，可以使用NaOH溶液调节所述聚集体分散液的pH为10.0-12.0。
优选地，步骤(2)所述调节聚集体分散液的pH值为11.0-12.0。
进一步地，步骤(2)所述姜黄素粉末与步骤(1)所述大豆蛋白酶解聚集体的质量比为1:100-1:10(w/w)。
进一步地，步骤(2)中，可以使用HCl溶液调节所述混合液的pH为7.0-7.5。
优选地，步骤(2)所述离心的条件为：离心力8000-10000g，离心时间10-20min。
进一步地，步骤(2)所述大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒经冷冻干燥或喷雾干燥后即可得到粉末状纳米制品。
本发明提供一种由上述制备方法制得的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒，其特征在于，平均粒径均在200nm以下，均分散系数小于0.3，大豆蛋白酶解聚集体的回收利用率高达60％，姜黄素的荷载量高可达到80mg/g大豆蛋白酶解聚集体的量，体外消化后，姜黄素的生物可利用度可达到70％。
本发明提供的制备方法以大豆蛋白酶解聚集体为载体，利用聚集体及姜黄素在不同pH值下的溶解特性，采用pH驱动法结合分子自组装技术制备得到大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。
本发明提供的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒是由大豆蛋白酶解聚集体作为载体包埋了姜黄素后得到的复合物。
本发明制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒可实现对姜黄素的高效荷载和定向释放，可作为新型肽基功能性食品配料添加到食品体系中提高产品的营养价值和生理活性。
本发明提供的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒能够作为新型肽基功能性食品配料应用在制备食品中。
本发明制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒一方面可实现对姜黄素的高效输送和定向释放，可作为新型肽基功能性食品配料添加到食品体系中提高产品的营养价值及生理活性；另一方面可实现对大豆蛋白酶解聚集体的可持续化绿色应用，提高大豆蛋白在食品工业的利用价值。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，利用大豆蛋白酶解聚集体作为载体材料对姜黄素进行包埋，一方面可极大的提高姜黄素的水溶性、稳定性及生物可利用度；另一方面有利于大豆蛋白酶解聚集体的绿色可持续化高值应用，提高大豆蛋白的附加值；
(2)本发明提供的制备方法，采用pH驱动法制备得到大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒，该法具有低能量输入，无有机试剂引入，安全无毒副作用，工艺操作简单，可产业化大规模生产。
附图说明
图1为实施例1中pH 12.0条件下形成的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的粒径分布图；
图2为实施案例1中pH 12.0条件下形成的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的透射电镜图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本发明所用的大豆蛋白酶解聚集体为大豆活性肽制备过程中的副产物，主要通过如下方法获得：
以商业大豆分离蛋白为原料，将其溶于水中，加入Alcalase进行酶解，酶解条件为：pH 8.0-9.0，酶添加量为0.1-1％，反应温度为45-55℃，反应时间为4-12h。酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH至7.0，沸水浴灭酶10-20min，并于8000-10000rpm下离心10-20min，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解聚集体。
姜黄素的结合率(％)＝(离心后上清液中的姜黄素含量/总的姜黄素含量)×100％
姜黄素的荷载量(mg/g)＝离心后上清中的姜黄素含量/大豆蛋白酶解聚集体的量
实施例1
一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
以商业大豆分离蛋白为原料，将其溶于水中，加入Alcalase进行酶解，酶解条件为：pH 8.0，酶添加量为0.1％，反应温度为45℃，反应时间为12h。酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH至7.0，沸水浴灭酶10min，并于8000rpm下离心10min，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解聚集体。称取一定量的大豆蛋白酶解聚集体分散于去离子水中，配成蛋白浓度为10mg/mL(w/v)的聚集体分散液，室温搅拌2h。取3份聚集体分散液，分别用4M的NaOH溶液将分散液的pH分别调至pH 10.0、11.0、12.0，磁力搅拌30min以维持pH恒定，分别按姜黄素：大豆蛋白酶解聚集体＝1:100(w/w)的比例往这3份聚集体分散液中加入姜黄素粉末，继续搅拌30min，混合均匀，得到3份混合液，分别用4M的HCl溶液将这3份混合液的pH回调至pH 7.0，然后于10000g离心10min，弃去沉淀，得到的上清液即为pH驱动法制备得到的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的平均粒径、PDI，并测定大豆蛋白酶解聚集体的回收利用率及姜黄素的结合率和荷载量，结果见表1。
表1
由表1可以看出，pH驱动法可以诱导大豆蛋白酶解聚集体和姜黄素组装形成分散性较好的纳米级颗粒，颗粒平均粒径均在200nm以下，PDI均小于0.30。其中，pH为12.0条件下形成的颗粒粒径最小，聚集体回收利用率及姜黄素的结合率和荷载量均最高。图1和图2分别为pH 12.0条件下形成的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的粒径分布图和透射电镜图，可以看出，颗粒呈现较为均匀的球状结构分布，粒径在几十到一百纳米左右。因此，优选pH 12.0为调节大豆蛋白酶解聚集体分散液碱性的最佳pH。
实施例2
一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
以商业大豆分离蛋白为原料，将其溶于水中，加入Alcalase进行酶解，酶解条件为：pH 8.5，酶添加量为0.5％，反应温度为50℃，反应时间为8h。酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH至7.0，沸水浴灭酶15min，并于10000rpm下离心15min，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解聚集体。称取一定量的大豆蛋白酶解聚集体分散于去离子水中，配成蛋白浓度为20mg/mL(w/v)的聚集体分散液，室温搅拌2h。用4M的NaOH溶液将分散液的pH调至pH 12.0，磁力搅拌30min以维持pH恒定，取4份分散液，分别按姜黄素：大豆蛋白酶解聚集体＝1:100、1:50、1:20及1:10(w/w)的比例分别加入姜黄素粉末，继续搅拌30min，混合均匀，得到4份混合液，用4M的HCl溶液分别将这4份混合液的pH回调至pH 7.0，于8000g离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为pH驱动法制备得到的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的平均粒径、PDI，并测定姜黄素的结合率和装载量，结果见表2。
表2
由表2看出，随着姜黄素浓度的增加，制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的粒径、PDI变化不明显，所有体系均呈现较好的稳定性。此外，随着姜黄素浓度的增加，姜黄素的结合率略有降低，姜黄素的荷载量逐渐增加，最高可达79.46mg/g大豆蛋白酶解聚集体的量。
实施例3
一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，包括以下步骤：
以商业大豆分离蛋白为原料，将其溶于水中，加入Alcalase进行酶解，酶解条件为：pH 9.0，酶添加量为1％，反应温度为55℃，反应时间为4h。酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH至7.0，沸水浴灭酶20min，并于9000rpm下离心15min，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解聚集体。称取4份大豆蛋白酶解聚集体分别分散于4份去离子水中，配成蛋白浓度为5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL及40mg/mL(w/v)的聚集体分散液，室温搅拌2h。用4M的NaOH溶液将这4份分散液的pH调至pH 12.0，磁力搅拌30min以维持pH恒定，按姜黄素：大豆蛋白酶解聚集体＝1:20(w/w)的比例分别加入姜黄素粉末，继续搅拌30min，混合均匀，得到4份混合液，用4M的HCl溶液将这4份混合液的pH回调至pH 7.5，于8000g离心20min，弃去沉淀，得到的上清液即为pH驱动法制备得到的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制备的大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的平均粒径、PDI及姜黄素的结合率和装载量，并通过模拟胃肠道消化实验测定姜黄素的生物可利用度，结果见表3。
表3
由表3可以看出，随着大豆蛋白酶解聚集体蛋白浓度的增加，制备形成的聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的粒径逐渐增加，PDI变化不大，体系均呈现较好的稳定性。此外，姜黄素的结合率和荷载量随着聚集体蛋白浓度的增加逐渐增加。模拟体外消化实验中，姜黄素的生物可利用度高达70％左右。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将大豆蛋白酶解聚集体分散于水中，混合均匀，得到聚集体分散液；
（2）调节步骤（1）所述聚集体分散液的pH为碱性，然后加入姜黄素粉末，搅拌均匀，得到混合液；将所述混合液的pH值调节为7.0-7.5，离心取上清液，得到所述pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（1）所述大豆蛋白酶解聚集体为大豆活性肽制备过程中的副产物；所述大豆蛋白酶解聚集体的制备，包括：
将大豆分离蛋白加入水中，混合均匀，加入Alcalase酶进行酶解反应，得到蛋白酶解液，调节所述蛋白酶解液的pH为中性，然后沸水浴灭酶处理，离心取沉淀，洗涤，冷冻干燥，得到所述大豆蛋白酶解聚集体。
3.根据权利要求2所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，所述Alcalase酶的加入量为大豆分离蛋白质量的0.1-1wt%。
4.根据权利要求2所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，所述酶解反应中的体系pH值为8.0-9.0，酶解反应的温度为45-55 ℃，酶解反应的时间为4-12 h；所述沸水浴灭酶处理的时间为10-20 min。
5.根据权利要求1所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，在步骤（1）所述聚集体分散液的蛋白浓度为5-40 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）中，可以使用NaOH溶液调节所述聚集体分散液的pH为10.0-12.0。
7.根据权利要求1所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）所述姜黄素粉末与步骤（1）所述大豆蛋白酶解聚集体的质量比为1:100-1:10。
8.根据权利要求1所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）中，可以使用HCl溶液调节所述混合液的pH为中性。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒，其特征在于，平均粒径均在200 nm以下，均分散系数小于0.3，大豆蛋白酶解聚集体的回收利用率高达60%，姜黄素的荷载量高可达到80 mg/g大豆蛋白酶解聚集体的量，体外消化后，姜黄素的生物可利用度可达到70%。
10.权利要求9所述的pH驱动法制备大豆蛋白酶解聚集体包埋姜黄素纳米颗粒作为新型肽基功能性食品配料制备食品中的应用。
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