CN108157585B - 一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒及其制备方法和用途，其制法包括以下步骤：将大豆蛋白酶解不溶性聚集体与去离子水混合，加入白藜芦醇粉末，超声处理5‑30min，超声过程中控制样品温度低于25℃；超声后的样品离心，去除少量不溶物，即得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒。本发明制备负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的方法，工艺操作简单，且制备过程未涉及醇类等有机试剂，安全无毒副作用；且制备的纳米颗粒具有稳定性好，包载率高、生物相容性好等优点。

Description

一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒及其制法和用途
技术领域
本发明涉及功能性纳米生物制品，具体涉及一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒及其制法和用途。
背景技术
近年来，纳米技术在功能食品、化妆品和医药等材料加工中的应用备受关注。各种纳米尺度的输送体系如纳米颗粒悬浮液、纳米乳液在改善难溶性药物及其他活性成分的生物利用度上显示了巨大的应用潜力。
目前常用来制备纳米颗粒悬浮液或纳米乳液的食品级原料主要有蛋白类如大豆分离蛋白、乳清分离蛋白和β-乳球蛋白等，淀粉纳米晶体，淀粉纳米球，纤维素纳米晶体，几丁质纳米晶体等。随着食品工业的发展和人们对天然来源的产品或绿色产品的需求日益强烈，越来越驱动着科研工作者寻找或开发生物来源的原料用于制备各种纳米材料。
白藜芦醇(Resveratrol)是一种常见的膳食多酚类化合物，具有广泛的生物和药理活性。研究已发现其具有抗肿瘤、抗病毒、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、保护心脑血管等功能，且毒性低、不良反应小。然而白藜芦醇的水溶性差，性质不稳定，紫外照射下易发生异构化，强酸强碱、光照及高温下易发生氧化，严重限制了白藜芦醇的生物利用度。因此研究和开发一种纳米颗粒载体对白藜芦醇进行荷载以提高其溶解度和稳定性尤为重要。
大豆蛋白酶解不溶性聚集体是大豆活性肽生产过程中产生的大量不溶性组分。这部分组分由于难溶于水，工业生产中通常被丢弃或用作动物饲料，很少应用于食品行业供人类消费，大大降低了大豆蛋白的工业价值。
然而研究发现这部分副产物必需氨基酸含量高，具有很高的营养价值。因此，开发利用这部分酶解不溶性聚集体可以很大程度上提高大豆蛋白的附加值。基于上述大豆蛋白酶解不溶性聚集体不溶于水的颗粒性质，探讨采用纳米技术将其应用于纳米颗粒和药物载体方面具有非常大的开发前景。
发明内容
为了提高白藜芦醇的稳定性和与载体的结合率，本发明的首要目的在于提供一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒。
本发明的再一目的在于提供上述负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白溶于水中，加入碱性蛋白酶(Alcalase)或诺维信复合蛋白酶Protamex进行酶解，酶解条件为：pH值6.0-9.0，酶添加量为大豆分离蛋白质量的0.1-1.0％，反应温度为40-60℃，反应时间为12-24h；酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH值至7.0，离心，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解不溶性聚集体；
(2)将大豆蛋白酶解不溶性聚集体与去离子水混合，得到不溶性聚集体的分散液，分散液的蛋白含量为1-20mg/mL；
(3)将白藜芦醇粉末直接加入到步骤(2)的分散液中，搅拌均匀，白藜芦醇的质量浓度为0.05-1.00mg/mL；
(4)将步骤(3)的混合液超声处理5-30min，超声过程中控制样品温度低于25℃；超声后的样品离心，去除少量不溶物，即得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒；
步骤(1)和(4)所述的离心，优选8000-10000rpm下离心10-20min；
步骤(2)中，分散液的蛋白含量优选10mg/mL以下，此时纳米颗粒溶液体系的PDI值较小，体系较稳定；分散液的蛋白含量特别优选10mg/mL，此时白藜芦醇与大豆蛋白酶解不溶性聚集体的结合率达到较高水平；
步骤(3)中，白藜芦醇的质量浓度优选0.2mg/mL以下，此时白藜芦醇与大豆蛋白酶解不溶性聚集体具有较高的结合率；
步骤(4)所述的超声处理，其他条件为：超声波功率为150W，输出频率20kHz；
步骤(4)所述的超声处理优选10min，该时间下得到的大豆蛋白基纳米颗粒PDI值最小，体系最为稳定；
步骤(4)所述的控制样品温度低于25℃，优选将样品冰浴。
本发明制备的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒可实现对白藜芦醇的高效输送和定向释放，可作为新型功能性食品配料添加到食品体系中提高产品的营养价值及生理活性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次公开利用大豆蛋白酶解不溶性聚集体作为载体材料对白藜芦醇进行负载，有利于大豆蛋白的高效利用，提高大豆蛋白的附加值。
(2)本发明制备负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的方法，工艺操作简单，且制备过程未涉及醇类等有机试剂，安全无毒副作用；且制备的纳米颗粒具有稳定性好，包载率高、生物相容性好等优点。
附图说明
图1为实施例1中超声处理10min形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的透射电镜图。
图2为实施例1中超声处理10min形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用的大豆蛋白酶解不溶性聚集体通过如下方法得到：
以市售豆粕为原料，通过碱溶酸沉法得到大豆分离蛋白；将大豆分离蛋白溶于水中，加入Alcalase或诺维信复合蛋白酶Protamex进行酶解，酶解条件为：pH值6.0-9.0，酶添加量为0.1-1.0％，反应温度为40-60℃，反应时间为12-24h。酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH值至7.0，并于8000-10000rpm下离心20min，收集不溶性沉淀组分，水洗2-3次，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解不溶性聚集体。
白藜芦醇的结合率(％)＝(1-游离的白藜芦醇含量/总的白藜芦醇含量)×100％
白藜芦醇的装载量(mg/g)＝结合的白藜芦醇含量/蛋白含量
实施例1
一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
称取大豆蛋白酶解不溶性聚集体分散于去离子水中，配成蛋白浓度为10mg/mL的不溶性聚集体分散液，室温搅拌2h后，加入0.2mg/mL的白藜芦醇粉末，搅拌均匀后用超声波破碎仪超声处理5-30min，超声波功率为150W，输出频率20kHz，超声过程中用冰浴控制样品温度低于25℃。将超声后的样品10000g离心10min去除少量不溶物，得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒。
采用透射电子显微镜(JEOL-2100)观察制得的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径形貌。将新鲜制备的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒溶液稀释到0.1mg/mL，取一滴该稀释液加到碳膜铜网上，置于白炽灯下60s后，用滤纸轻轻吸走过量样品，然后向铜网上滴加适量的磷钨酸(1％，w/v)，染色60s后再用滤纸轻轻吸走过量染色液，干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。超声处理10min形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的透射电镜图如图1所示，颗粒呈较为均匀的球状结构分布。
采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制得的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的平均粒径、PDI和Zeta电位，结果见表1。
超声处理10min形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径分布如图2所示，其粒径分布在30-600nm之间。其中，横坐标为负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径(nm)，纵坐标为负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的数量百分比(％)。
表1
Figure BDA0001539889890000051
由表1和图1、2可以看出，超声处理可以诱导大豆蛋白酶解不溶性聚集体和白藜芦醇粉末从不溶性的大颗粒变成分散性较好的纳米颗粒，颗粒平均粒径在200nm以下。随着超声时间的延长，颗粒粒径减小。超声10min制备的纳米颗粒PDI值最小，表明该体系最为稳定。
实施例2
一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
称取大豆蛋白酶解不溶性聚集体分散于去离子水中，配成蛋白浓度为10mg/mL的不溶性聚集体分散液，室温搅拌2h后，加入一定量(0.05-1.00mg/mL)的白藜芦醇粉末，搅拌均匀后用超声波破碎仪超声处理10min，超声波功率为150W，输出频率20kHz，超声过程中用冰浴控制样品温度低于25℃。将超声后的样品10000g离心10min去除少量不溶物，得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒。
采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制备的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的平均粒径、PDI和Zeta电位，并测定白藜芦醇的结合率和装载量，结果见表2。
表2
Figure BDA0001539889890000061
由表2看出，随着白藜芦醇浓度的增加，负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径变化不明显，且PDI都在0.2左右，所有体系均呈现较好的稳定性。而随着白藜芦醇浓度的增加，白藜芦醇的结合率逐渐降低，白藜芦醇浓度在0.2mg/mL以下时均具有较高的结合率。
实施例3
一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将大豆蛋白酶解不溶性聚集体分散于去离子水中，配成蛋白浓度为1-20mg/mL的不溶性聚集体分散液，室温搅拌2h后，分别加入0.2mg/mL的白藜芦醇粉末，搅拌均匀后用超声波破碎仪超声处理10min，超声波功率为150W，输出频率20kHz，超声过程中用冰浴控制样品温度低于25℃。将超声后的样品10000g离心10min去除少量不溶物，得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒。采用纳米粒度电位仪(Malvern Nano-ZS)测定制备的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的平均粒径、PDI和Zeta电位，并测定白藜芦醇的结合率和装载量，结果见表3。
表3
Figure BDA0001539889890000071
由表3可以看出，随着大豆蛋白酶解不溶性聚集体分散液蛋白浓度的增加，制备形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的粒径呈现增长趋势，当浓度在10mg/mL以下时，纳米颗粒溶液体系的PDI值较小，均在0.2左右，说明形成的负载姜黄素的大豆蛋白基蛋白颗粒溶液体系较稳定；而浓度高于10mg/mL时，形成的纳米颗粒粒径增加较大，体系的PDI值也较大，此时形成的负载白藜芦醇的大豆蛋白基蛋白颗粒溶液体系较不稳定。
另外，白藜芦醇的结合率随着不溶性聚集体分散液蛋白浓度的增加呈现增长的趋势，在蛋白浓度达到10mg/mL时白藜芦醇的结合率达到较高水平。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白溶于水中，加入碱性蛋白酶或诺维信复合蛋白酶Protamex进行酶解，酶解条件为：pH值6.0-9.0，酶添加量为大豆分离蛋白质量的0.1-1.0％，反应温度为40-60℃，反应时间为12-24h；酶解反应结束后，调节蛋白酶解液的pH值至7.0，离心，收集不溶性沉淀组分，水洗，冷冻干燥，得到大豆蛋白酶解不溶性聚集体；
(2)将大豆蛋白酶解不溶性聚集体与去离子水混合，得到不溶性聚集体的分散液，分散液的蛋白含量为10mg/mL；
(3)将白藜芦醇粉末直接加入到步骤(2)的分散液中，搅拌均匀，白藜芦醇的质量浓度为0.20mg/mL；
(4)将步骤(3)的混合液超声处理10min，超声过程中控制样品温度低于25℃；超声后的样品离心，去除少量不溶物，即得到负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒；
步骤(4)所述的超声处理，超声波功率为150W。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的超声处理，输出频率20kHz。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(4)所述的离心，是在8000-10000rpm下离心10-20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的控制样品温度低于25℃，是将样品冰浴。
5.一种负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒，其特征在于：是由权利要求1-4任一项所述的方法制得。
6.权利要求5所述的负载白藜芦醇的大豆蛋白基纳米颗粒在食品中的应用。
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