CN102016057A - 使用酶的蛋白质的改性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使蛋白谷氨酰胺酶及转谷氨酰胺酶两者作用于蛋白质而使蛋白质改性的方法,提供含有经这两种酶改性的蛋白质的食品,提供含有两酶的蛋白质改性用酶制剂,提供简便地发现以适当添加量比将蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的方法。蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间和转谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间大致相同,或者在转谷氨酰胺酶作用于蛋白质之前,或者,通过使作用于蛋白质的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加比例为规定的比例而使蛋白质改性。通过使用同位素标记铵盐标记的蛋白质的NMR信号强度等发现蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比。
Description
技术领域
[相关专利的记载]
本发明基于日本国专利申请:日本特愿2008-066765号(2008年3月14日申请)及特愿2008-294890号(2008年11月18日申请)的优先权主张,该申请中的全部记载内容作为引用包含于本说明书中。
本发明涉及蛋白质的改性方法,其特征在于使用作为修饰蛋白质中的谷氨酰胺残基的酶的转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶两者发挥作用而进行2种酶反应。此外,本发明也涉及含有使用此方法的改性蛋白质的食品、以特定的比例含有蛋白谷氨酰胺酶及转谷氨酰胺酶两者的蛋白质改性用酶制剂、发现向底物蛋白质中添加蛋白质谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比的方法等。
背景技术
转谷氨酰胺酶(以下简称TG)为催化蛋白质及肽中的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基和伯胺之间的酰基转移反应的酶。TG作用于作为酰基受体的蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基,引起蛋白质交联聚合反应。此外,在伯胺不存在的情况下,水可作为酰基受体而发挥作用,而催化将谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基的脱酰胺反应。在食品中应用时,大部分是通过蛋白质的交联反应的,目前利用蛋白质的凝胶形成性赋予或提高,在不加热情况下的蛋白质的凝胶化、粘着等性质,开发应用于鱼饼、火腿、香肠、面类、豆腐、面包等种种用途的TG制剂。
另一方面,蛋白质谷氨酰胺酶(以下简称PG),为对蛋白质中的谷氨酰胺残基的酰胺基具有脱酰胺作用的酶。其详细记述如专利文献1、专利文献2、非专利文献1等的公开所示。依据这些文献,PG直接作用于蛋白质中的酰胺基,因而将蛋白质中的谷氨酰胺残基转转化为谷氨酸残基,生成羧基,因而引起蛋白质的负电荷的增加、静电斥力的上升、等电点的降低、水合力的增加等。其结果是,引起了蛋白质的溶解性、水分散性的增加,乳化力和乳化稳定性的上升等种种机能特性的上升,而期待蛋白质的用途得到扩大。
因此,已知TG和PG均为产业上有用的酶,但是至于在这些酶合用的情况下得到新的附加效果的尝试,却基本无具体实例的报道。相反,在专利文献1中显示了作为TG反应控制剂的PG利用实例,非专利文献2中也记载有在PG、TG共存的情况下,TG引起的交联反应不能发生。故就有关TG和PG的反应性的差异更详细地描述目前的认识。两种酶在其底物蛋白质中的靶标均为相同的谷氨酰胺残基。但是,和TG相比,PG对蛋白质中的各个谷氨酰胺残基的底物特异性更广。认为这是因为,在TG的情况下,除了谷氨酰胺残基以外必须存在赖氨酸残基的ε-氨基,而与此相对,在PG的情况下,除了谷氨酰胺残基以外,只需要在反应环境中存在丰富的水即可。例如,对酪蛋白中的谷氨酰胺残基的反应性来说,从Km值、kcat值来看,PG比TG具有压倒性的高催化效率,在两者共存的情况下,PG反应优先进行,脱酰胺化了的谷氨酰胺残基不能作为TG的底物,不能进行交联反应。实际上,据在使用TG的酪蛋白的交联高分子化反应的途中添加PG的实验显示,结果是酪蛋白的高分子化在添加的同时停止。此外,也确认了用PG事先进行充分脱酰胺化的酪蛋白已经不能作为TG的底物,即不能进行交联高分子化(非专利文献2)。此外,Y.S.Gu等就本酶对α-乳清蛋白的反应性进行了调查,报告称6个谷氨酰胺残基中有4个进行了脱酰胺化(非专利文献3)。另一方面,放线菌TG仅能作用于作为上述4个中的1个的谷氨酰胺54,因此可认为PG的底物特异性广于TG。此外,在专利文献1中,利用PG对谷氨酰胺残基的高反应性,能够在适当的时间点使TG反应停止,列举了PG有代替不适于添加入食品中的EDTA和氯化铵等一般公知的TG阻断剂的可能性。
然而,现在为止尚无举例根据因PG导致TG反应停止以外的观点而将两者合用的方法的提案。不仅如此,至于将TG和PG两者作用于底物蛋白质而得到目的的效果的条件,更详细而言,TG反应不因PG而停止,在有PG共存的条件下也不损害TG反应及其改性效果的条件,仅从目前的认识是不能得知的。此外,对于各种底物蛋白质,使TG和PG在何种比例下作用的情况下,能够显示何种效果等,显示用于有效地使用两酶的具体方法的实例也不存在,故应该说是全新的尝试,如要进行TG、PG引起的改性蛋白质制品的开发,必须依照各用途摸索最适的反应条件是目前的现状。
此外,由于酶反应因处理时间、温度、酶添加量、底物的种类、状态、底物特异性等种种因素,其反应量及其效果的程度不同,故在共同的底物中使用2种酶并不容易,开发者、加工业者为依照用途决定所需要的食品的制造条件,而需耗费大量的时间和劳力。究其原因,是因为酶反应依处理时间、温度、酶添加量、底物的种类、状态、底物特异性等种种因素的不同而引起其反应量及其效果的程度不同,除此之外,若要使两种酶同时发挥作用,必须对所有的组合进行研究。因此要求开发自如使用具有共同底物的2种酶的方法。
不过,现在为止,作为对TG的底物特异性进行研究的方法,已知有使用NMR的方法(专利文献3)。也就是说,在15N标记的氯化铵存在下使任意蛋白质与TG作用,将作为TG的底物的谷氨酰胺残基的羧酰胺氮用15N标记的蛋白质用NMR进行观测,而追踪TG的反应的方法。若使用这种方法,可以使用蛋白质底物同时解析反应性和底物特异性。然而,在专利文献3中,并未记载PG反应的谷氨酰胺残基的羧酰胺氮能用15N进行标记。
专利文献1:日本特开2000-50887号公报
专利文献2:日本特开2001-218590号公报
专利文献3:日本特开2002-332295号公报
非专利文献1:Yamaguchi等、Eur.J.Biochem.Vol.268,2001,1410-1412页
非专利文献2:食品酶化学的最新技术和应用-食品蛋白混合物的展望-(CMC出版)、146~153页
非专利文献3:Y.S.Gu等、J.Agric.Food Chem.Vol.49,2001,5999-6005页
发明内容
发明所要解决的课题
上述专利文献1~3及非专利文献1~3的全部公开内容作为引用而记载于本说明书中。
以下分析是依照本发明的观点得出的。
本发明的目的在于提供使蛋白谷氨酰胺酶及转谷氨酰胺酶两者作用于蛋白质而使蛋白质改性的方法,提供含有使用两酶进行改性的蛋白质的食品,提供含有两酶的蛋白质改性用酶制剂,提供简便地发现蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比的方法。
解决课题的手段
本发明者们针对上述情况进行了深入的研究,结果发现,现在为止,在PG存在的情况下TG不能发挥作用,难于得到PG、TG的合用效果,但在特定条件下,在PG和TG共存的情况下,发现两酶对底物蛋白质发挥作用,可得到两酶的合用效果。此外,发现了以下事实:PG和TG一样,除了可以催化蛋白质中谷氨酰胺残基的脱酰胺化之外,也可以催化和铵盐的交换反应。也就是说,TG或PG所反应的谷氨酰胺残基的羧酰胺氮可以用15N标记。因此发现,检出15N标记的检测法,例如若进行1H-15N HSQC测定,可由NMR信号强度估算15N标记率,可获知各反应性的差异。此外,还发现,对于各种蛋白质,TG和PG的存在比例与各自的NMR信号强度比例具有良好的相关性。此外还发现了在以PG对TG的信号强度比例(以下简称PG/TG信号强度比)在0.2~3.0的范围的PG/TG的酶重量比或活性比是如下情况的条件:TG反应不因PG而停止,即使在PG共存的条件下也不损害TG反应及其改性效果。即,在15N标记铵盐存在的情况下,使TG或PG分别作用于各种底物,使用NMR比较两者的底物特异性,能够简便地发现得到两酶合用效果的条件。本发明人等不仅发现使PG和TG同时作用的优点,而且成功制定现实地且容易地决定该条件的方法。也就是说,本发明如下所述。
(1)蛋白质的改性方法,其通过使蛋白谷氨酰胺酶及转谷氨酰胺酶作用于蛋白质而使蛋白质改性,其中,蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间和转谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间大致相同或者在转谷氨酰胺酶作用于该蛋白质之前。
(2)(1)中记载的方法,其中,以活性比计,添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.05~3∶1。
(3)(1)或(2)中记载的方法,其中,以重量比计,添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.01~0.7∶1。
(4)(1)至(3)中任一项记载的改性方法,其中,以NMR信号强度比计,是添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1的条件。
(5)(1)至(4)中任一项记载的方法,其中,蛋白质为选自乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麦谷蛋白、血浆、肌肉蛋白质、胶原及明胶的1种或2种以上的蛋白质。
(6)食品,其含有使用(1)至(5)中任一项记载的方法改性过的蛋白质。
(7)蛋白质改性用酶制剂,其中,以活性比计,转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.05~3∶1。
(8)蛋白质改性用酶制剂,其中,以重量比计,转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.01~0.7∶1。
(9)蛋白质改性用酶制剂,其特征在于,以NMR信号强度比计,是转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1的条件。
(10)蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比的发现方法,通过使转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶分别在同位素标记的铵盐的存在下作用于该蛋白质,将该蛋白质的谷氨酰胺残基的官能团进行同位素标记,测定其NMR信号强度来进行。
发明效果
依据本发明,可以提供与单独使用TG或PG的任一种酶的情况不同的蛋白质的改性效果,即TG和PG的合用效果,具体而言,可对受食品所含蛋白质影响的该食品的性质进行改性,其结果是能够得到改善含有蛋白质食品的口感(硬度、顺滑性等)的效果、能够提供蛋白质的新型改质方法。此外,能够提供含有使用这样的改性方法而得到的具有新型特征的蛋白质的食品。此外,还能提供简便地发现在蛋白质中使TG及PG两种酶共同对底物发挥作用而得到前述效果那样的合适的条件(添加条件)的方法。
附图简述
[图1]15NH4Cl存在下的α-乳清蛋白的NMR中的1H-15N HSQC谱。(实验例1)
发明的实施方式
本发明使用的TG,广泛应用于明胶、奶酪、酸奶、豆腐、鱼饼、火腿、香肠、面类等食品的制造和食用肉的肉质改善中(日本特开昭64-27471号公报<参考文献1>)。此外,也是用于热稳定的微胶囊的素材、固定化酶的载体的制造等、应用于产业上种种的目的中的酶。TG催化蛋白质分子中的肽链内的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基的酰基转移反应。若TG使蛋白质分子中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体而发挥作用,在蛋白质分子中及分子间形成ε-(γ-谷氨酸)-赖氨酸键。需要说明的是,参考文献1的记载内容作为引用含在本说明书中。
作为TG,有钙非依赖性的和钙依赖性的,均可使用于本发明中。作为前者的实例,可列举放线菌、枯草菌等微生物来源的(例如,参考日本特开昭64-27471号公报<参考文献2>)。作为后者的实例,可列举豚鼠肝脏来源的(例如,参考日本特公平1-50382号公报<参考文献3>),人表皮角蛋白细胞TG(Phillips,M.A.等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,9333.<参考文献4>),人凝血因子XIII(Ichinose,A.等.(1990)Biochemistry 25,6900.<参考文献5>),卵菌等微生物来源的,牛血液、猪血液等动物来源的,鲑鱼、真鲷等鱼来源的(例如、关信夫等、“日本水产学会志56卷125~132页、1990年<考文献6>),牡蛎来源的等。除此之外,可列举通过基因重组而生产的(例如,参考日本特开平1-300889号公报<参考文献7>、日本特开平6-225775号公报<参考文献8>、日本特开平7-23737号公报<参考文献9>。)等。本发明可使用任意一种,对其来源及制法并无限定。此外,存在因为同位素标记蛋白质的性质而在含钙的溶剂中的酶反应不佳的情况,故对于这类蛋白质优选使用钙非依赖性的TG。例如,上述微生物来源的(MTG)(例如,参考日本特开昭64-27471号公报<参考文献10>。)等也可以满足此条件,可以认为是在现阶段最适合的。例如,灰橙轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium griseocameum)IFO 12776、肉桂链轮丝菌肉桂亚种(Streptoverticillium cinnamoneumsub sp.cinnamoneum)IFO 12852、茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)IFO 13819等来源的。以下有时将茂原轮枝链霉菌来源的转谷氨酰胺酶称为MTG。需要说明的是,上述参考文献2~10的记载内容作为引用含在本说明书中。
本发明中使用的TG的活性单位依如下测定并进行定义。即,以苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(Z-Gln-Gly)和羟胺作为底物进行反应,生成的氧肟酸在三氯乙酸存在的情况下转换成铁络合物后,在525nm的吸光度下测定其量。用这样生成的氧肟酸的量作成校正曲线,将1分钟内生成1μ摩尔的氧肟酸盐的酶量定义为,1单位活性单位。此测定方法的细节如已有的报告中所述(例如,参考日本特开昭64-27471号公报<参考文献11>等。)。需要说明的是,参考文献11的记载内容作为引用含在本说明书中。
本发明中使用的PG具有直接作用于蛋白质的酰胺基、不伴随切断肽键及交联蛋白质而脱酰胺的作用。只要具有该作用即可,对其种类并无限定。作为这样的酶的实例有专利文献1或专利文献2中公开的酶,但并不特别限定于此。PG可使用产生PG的微生物的培养液进行配制。PG配制中使用的微生物并无特别限定,但可示例如金黄杆菌(Chryseobacterium)属、黄杆菌(Flavobacterium)属、稳杆菌(Empedobacter)属的微生物。
至于从微生物的培养液中配制PG的方法,可使用公知的蛋白质分离、精制方法(离心分离、UF浓缩、盐析、使用离子交换树脂等的各种色谱法等)。例如离心分离培养液以除去菌体,随后组合盐析、色谱法等可获得目的酶。在从菌体内回收酶的情况下,可例如将菌体通过加压处理、超声波处理等破碎后,和上述同样地进行分离、精制而获得目的酶。而且,也可以通过过滤、离心处理等事先从培养液中回收菌体后,进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、精制)。还可以通过冷冻干燥、减压干燥等干燥法而使酶粉末化,此时也可使用合适的赋形剂、干燥辅剂。
本发明的PG的活性单位使用对专利文献1记载的方法进行改良的方法,即,用下述方法进行测定。
(1)在含有30mM Z-Gln-Gly的176mM的磷酸缓冲液(pH6.5)100μl中添加含有PG的水溶液10μl,在37℃下温育10分钟后,加入12%TCA溶液100μl以停止反应。此时,使用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)进行适当稀释,以使酶浓度为0.05mg/ml。
(2)离心分离(12000rpm、4℃、5分钟)后,使用F-kit氨(Roche生产)对上清进行NH3的定量。此方法如下所述。
(3)在试药II液(F-kit附件)100μl中添加上清10μl和0.1M三乙醇胺缓冲液(pH8.0)190μl,在室温下放置5分钟后,取100μl测定340nm处的吸光度(E1)。在剩余的200μl中加入1.0μl的试药III(谷氨酸脱氢酶)后,于室温下再放置20分钟后,测定剩余的200μl在340nm的吸光度(E2)。使用附于F-kit的氨标准液制成表示氨浓度和吸光度(340nm)的变化量的关系的校正曲线,通过此校正曲线求出反应液中的氨浓度。
(4)蛋白质浓度的测定使用蛋白质分析CBB(考马斯亮蓝)溶液(Nacalai Tesque),在检测波长595nm下进行测定。作为标准,使用BSA(Pierce会社生产)。
(5)PG的活性用下式进行计算。
在本发明中,有关PG和TG添加于需改性的蛋白质中的时间,PG添加到蛋白质中的时间和TG添加到蛋白质中的时间大致相同,或者在TG作用于该蛋白质之前。因此,专利文献1中记载的将TG反应通过添加PG来停止的方法为PG添加至蛋白质中的时间为TG作用于该蛋白质之后,故并不包含于本发明中。需要说明的是,PG添加到蛋白质中的时间和TG添加到蛋白质中的时间大致相同,意味着在一系列原料投与的工序中投与PG和TG。即,在商业规模的生产中,以在投与原料A后,依次投与原料B、原料C...的方式来进行,一般是多个原料事先不混合而依次投与,但在一系列原料投与的工序中,只要是投与PG和TG,就包含在本发明的“蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间和转谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间大致相同”中。当然,事先混合含有PG、TG的多种原料而进行添加的情况,也包含在本发明的“大致同时”中。
使PG、TG发生反应的温度一般为3℃~60℃,若保持在此温度下,在约1分钟~约48小时程度下二者进行反应。但是,优选在5℃~50℃程度下进行约5分钟~约24小时的程度。在食品中添加PG、TG的方法是在含有作为底物的蛋白质的原料中仅添加PG、TG,或是和其他的原料一起添加也可。PG和TG的添加量随着改性蛋白质的种类、最终制品和作为目的的效果而可自由地变化,但例如相对于食品原材料中每克蛋白质重量,TG的添加量在标准上为0.1~100单位。另一方面,相对于食品原材料中每克蛋白质重量,PG在标准上为0.01~120单位。需要说明的是,两者的上述添加量只是标准,只要是发挥本发明所期待的效果即可,并不一定限制于此。
在本发明中,作用于蛋白质的PG和TG的比例很重要。在对蛋白质添加PG的时间与添加TG的时间大致相同或是在TG作用于该蛋白质之前的情况下,以活性比计,在蛋白质中添加蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为PG∶TG=0.05~3∶1、优选PG∶TG=0.05~2∶1,PG、TG均作用于蛋白质,故可以改性蛋白质。或者以重量比计,PG∶TG=0.01~0.7∶1,优选PG∶TG=0.01~0.4∶1,更优选PG∶TG=0.01~0.3∶1,PG、TG均作用于蛋白质,故可以改性蛋白质。在PG的比例大于上述比例的情况下,PG的作用与TG相比过于有效而不能发挥合用的效果,此外,在小于上述比例的情况下,相反地由于PG的作用过弱而无法期待合用效果。
此外,以NMR信号强度比计,对蛋白质添加蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为PG∶TG=0.2~3.0∶1,优选0.2~2.3∶1,如在此条件下,则不管PG、TG的添加时间,由于PG、TG均作用于蛋白质,故可以改性蛋白质。在PG的比例比上述比例大的情况下,PG的作用与TG相比过于有效而不能发挥合用的效果,此外,在小于上述比例的情况下,相反地由于PG的作用过弱而无法期待合用效果。
本发明的NMR信号强度比如下算出:TG或PG在同位素标记铵盐(15N或是14N)的存在下作用于底物蛋白质,在对该蛋白质的谷氨酰胺残基进行同位素标记之后,测定标记了的蛋白质的NMR谱,通过NMR信号强度算出。对NMR的测定法并无特别限定,但可以采用例如在检测15N标记了的谷氨酰胺残基的情况下,可以测定1H和15N的相关谱,例如可以采用测定HSQC谱。在可得到2个以上的信号的情况下,算出各信号强度的总和作为信号强度来计算。也就是说,NMR信号强度比用“使PG作用的情况下的信号强度的和”÷“使TG作用的情况下的信号强度的和”来表示。作为标记化合物,可以为铵盐,也可广泛列举为氯化铵、硫酸铵等。若为15N标记,则使用氮为15N的铵盐即可,若为14N标记,则使用氮为14N的铵盐即可。标记方法为,在水性溶剂中约pH3.0~约pH9.0的范围、优选约pH4.0~约pH8.0的范围内,在温度为约4℃~约65℃的范围、更优选约25℃~约60℃的范围内,可保持需标记蛋白质及铵盐即可。反应时间并无特别限定,为约30秒~一周,更优选约1分钟~约1日。在此反应中,相对于需标记蛋白质的浓度,铵盐浓度为约10倍以上,优选约200倍以上较好,更优选需标记蛋白质的浓度为约1μM~约40mM的范围,铵盐的浓度为约10μM~约10M的范围。需要说明的是,α-乳球蛋白、酪蛋白、大豆球蛋白、肌球蛋白、肌动球蛋白等食品中含有的蛋白质可以进行同位素标记,故本发明的NMR信号强度比可以测定所有含蛋白质的食品。
以下显示了通过TG或PG的作用,而使蛋白质和同位素标记的氯化铵进行反应的实例。在将α-乳清蛋白(α-lactalbumin,以下简称α-La)作为底物使用的情况下,配制底物溶液(10mg/ml α-La、200mM15NH4Cl、5%D2O/20mM Tris-HCl(pH7.0)),添加TG或PG以使底物-酶比为1000∶1以后,在37℃下温育26.5小时。温育后的溶液转移至NMR样品管中,使用Bruker会社生产的Avance600等,进行1H-15N HSQC检测。羧酰胺的氮若使用15N标记,由于在15N上结合了2个1H,故对于1个15N的化学位移能成对地观测到2个信号。算出“PG作用情况下的信号强度的和”÷“TG作用情况下的信号强度的和”,以此作为NMR信号强度比。
本发明的蛋白质并无特别限定。可列举为乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麦谷蛋白、肌肉蛋白质、血浆、胶原、明胶等。此外,还可为将这些蛋白质2种以上进行混和得到的物质。作为符合本发明的食品,只要含有对上述蛋白质合用PG、TG而进行改性的蛋白质即可,不论原料的种类和加工状态。包含例如经杀菌的状态,经脱脂的状态,经稀释的状态、经浓缩的状态、经干燥的状态、除此以外,也包括经过各种各样的加工的状态。
随后,对本发明的酶制剂进行说明。本发明的蛋白质改性用酶制剂只要为以下条件的制剂即可:以活性比计,,作为必须构成成分的转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为PG∶TG=0.05~3∶1、优选PG∶TG=0.05~2∶1,或以重量比计,掺混比例为PG∶TG=0.01~0.7∶1、优选PG∶TG=0.01~0.4∶1、更优选PG∶TG=0.01~0.3∶1,或以NMR信号强度比计,PG∶TG=0.2~3.0∶1、优选PG∶TG=0.2~2.3∶1,除PG、TG之外,还可掺混在此领域中经常使用的乳糖、蔗糖、麦芽糖醇、山梨醇、糊精、支链糊精、环糊精、淀粉类、多糖类、胶类、果胶等种种任意成分。此外,还可以含有动物性蛋白质和大豆蛋白质、小麦蛋白质等植物性蛋白质。此外,也可根据需要在在本酶制剂中掺混碳酸氢钠、枸橼酸钠、磷酸钠、氯化钠、氯化钾等生理学上允许的无机盐类。此外,还可以适当掺混调味料、砂糖、香料、色素、发色剂(color coupler發色剤)、抗坏血酸、其盐类等的有机盐类、乳化剂、油脂等。
本发明包括简便地发现蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比的方法。即,如上所述,使PG和TG在同位素标记的铵盐的存在下分别作用于蛋白质,用同位素标记该蛋白质的谷氨酰胺残基的官能团、测定其NMR信号强度,发现在NMR信号强度比中,通过使蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1、优选0.2~2.3∶1的条件,能确定PG和TG的适当添加量比。PG和TG的NMR信号强度比的上述适当范围,和底物蛋白质的种类无关,蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1,优选0.2~2.3∶1,NMR信号强度比和各底物蛋白质中的PG和TG的适当添加量比(活性比、重量比)之间存在相关,故无需重复多次试验来对PG和TG的适当添加量比(活性比、重量比)进行试错,能够简单的发现适当的添加量比。
以下的实施例为列举实施例来对本发明进行详细的说明,但本发明并不限于这些实施例。
实验例1
将α-乳清蛋白(α-lactalbumin,以下简称α-La)(Sigma生产)作为底物使用。配制底物溶液(10mg/ml α-La、200mM 15NH4Cl、5%D2O/20mM Tris-HCl(pH7.0)),添加TG(来自味之素“Activa”TG的酶精制品)或PG(专利文献1记载的金黄杆菌(Chryseobacterium)属来源的)以使底物-酶比为1000∶1,然后于37℃下温育26.5小时。温育后的溶液移至NMR样品管中,使用NMR(Bruker会社生产Avance600),进行1H-15N HSQC测定。26.5小时后进行1H-15N HSQC测定的结果如图1所示。羧酰胺氮使用15N标记后,由于在15N上结合了2个1H,故对于1个15N的化学位移能成对地观测到2个信号。通过图1,可以确定α-La中存在的谷氨酰胺残基的羧酰胺氮中的一部分为15N所标记,通过PG成功地显示了15N标记。这样,使用本方法,和TG一样,显示PG不仅使脱酰胺反应进行,也可使氯化铵和谷氨酰胺残基反应。需要说明的是,NMR信号强度为图1的椭圆形的点的区域面积的总和,此区域面积越大表示反应量越多。
实施例1
在市售牛奶、0.2M 15NH4Cl、5%D2O中分别单独添加实验例1中记载的TG或PG,算出各添加浓度中的信号强度。添加TG以使底物/酶比(S/E比)为重量比7400/1。另一方面,添加PG至以重量比计为TG的0.002~5倍。所使用的TG的比活性为每1mg酶蛋白质为26单位,PG的比活性为每1mg酶蛋白质为120单位。添加酶后的溶液于37℃下温育3小时后,移至NMR样品管中,使用实验例1记载的NMR,进行1H-15N HSQC测定。以TG添加量为基准,与此对应的PG添加量分别用酶重量比(PG/TG)及活性比(PG/TG)表示。求得的对应于各比的PG/TG信号强度比的结果如表1所示。
[表1]
使用市售牛奶配制酸奶。将市售牛奶400g加温至50℃,以表2中记载的量添加实验例1记载的TG、PG。所使用的TG的比活性为每1mg酶蛋白质为26单位,PG的比活性为120单位。在50℃下进行90分钟的酶反应后,在沸腾浴中一边混合一边加热。一达到90℃立即置于冰水中,冷却至45℃。添加20g(相对于原料为5%)的发酵剂(明志乳业(株式会社)保加利亚酸奶),充分混合后分别注入试饮杯中,每杯40g。
使用铝箔纸覆盖,于38℃下降低pH至4.5,使其发酵约3~4小时。在低温(4℃)下保存,翌日进行物性评价和感官评价。
至于物性,使用质地分析仪(Texture Analyzer英弘精机生产)测定破断应力。使用10mm直径的圆柱形柱塞,设定破断速度为6cm/min(1mm/秒)。
其结果如表3所示。和对照品相比,仅添加TG的比较品T的破断应力显著增加。这是TG引起乳蛋白交联的结果。有关本发明品1~4,其破断应力仍大于对照品,并未损害TG引起的增加破断应力的效果。然而,比较品T-P的破断应力和比较品P相比则基本无变化,故能确认TG反应因PG的加入而基本停止,TG的效果基本并未体现。
[表2]
[表3]
破断应力(g) | |
对照品 | 18.63 |
本发明品1 | 33.88 |
本发明品2 | 31.74 |
本发明品3 | 24.68 |
本发明品4 | 20.51 |
比较品T | 32.17 |
比较品P | 12.91 |
比较品T-P | 12.44 |
在感官评价中,由6名评审员评价硬度。以对照品为0分,硬实程度为5分,柔软程度为-5分来进行评分,求出平均值。其结果如表4所示。和对照品相比,仅添加TG的比较品T的硬度显著增加。在本发明品1~4中,保持了TG引起的硬度的增加。但是,比较品T-P的硬度和比较品P一样,酸奶被软化,这意味着,TG反应因PG的影响而基本停止,TG的效果基本没有显现。本结果大体上反映了上面显示的物性检测的结果。在评价整体的口感的良好性时,得到了如下良好评价结果:本发明品1~4中保持TG引起的酸奶的硬度提升效果,且与仅添加TG的情况相比顺滑性提升。也就是说,确认了PG、TG的合用效果。
[表4]
1分:不好
2分:稍稍不好
3分:普通
4分:好
5分:非常好
实施例2
为了将Takanashi低脂肪牛奶(乳蛋白3.3%、乳脂肪1.0%)中的乳蛋白调整为3.6%,添加0.85%的脱脂奶粉(低热量型、含有35%乳蛋白,四叶乳业生产),在55℃下一边加温一边溶解,配制成酸奶用原料奶。在沸腾浴中加热该原料奶,在达到95℃并保持2分钟后,立即置于冰浴中进行冷却。达到47℃后,在添加0.006%的乳酸菌发酵剂(Yo-Flex,DVS YC-370、クリスチヤンハンセンCHR HANSEN生产)的同时,添加入如表5记载的TG、PG并充分搅拌。将每一定量的原料奶分别加入塑料杯中,在44℃的培养箱内发酵直至pH为4.5~4.6为止。从发酵开始到结束约需4~5个小时,发酵结束后保存于冷藏库(5℃)中。翌日,观察得到的凝固型酸奶的表面渗出水(syneresis on the surface表面離水)。此外,使用质地分析仪(设备生产商:Stable Macro System,LTD)评价酸奶的物性。感官评价由5名经过训练的评审员进行。酸奶的物性检测条件为测试速度1mm/s,直径10mm的平板柱塞,用来评价10%压缩时的破断应力和附着面积。本发明者们已确定破断应力和酸奶的硬度之间高度相关,附着面积和酸奶的乳脂感之间高度相关。综合的评价结果如表6所示。
[表5]
[表6]
观察到对照品和比较品2的表面渗出水多,此外比较品3表面渗出水稍多。比较品1、本发明品1及2未见表面渗出水,表面有光泽。另一方面,依照物性测定及感官评价的结果,比较品1有硬实、易脆的琼脂样的口感、含在口内感觉水分较多。比较品2、3和对照品相比较,硬度减少、附着性增加。在感官评价中,有虽顺滑却柔软且缺乏实体感的评论。另一方面,本发明品1、2中任一者,其硬度和附着性两者均增加、具有实体感、为顺滑且乳脂状的酸奶。综上,通过对外观、物性·口感方面进行综合的评价,本发明品1、2为最好的酸奶,显示通过适当且平衡地使用TG和PG而可以改善凝固型低脂肪酸奶的口感。
实施例3
为了将Takanashi低脂肪牛奶(乳蛋白3.3%、乳脂肪1.0%)中的乳蛋白调整为3.94%,添加脱脂奶粉(低热量型、含有35%乳蛋白,四叶乳业生产),在55℃下一边加温一边溶解,配制成酸奶用原料奶。在沸腾浴中加热该原料奶,在达到95℃并保持2分钟后,立即置于冰浴中进行冷却。至47℃后,在添加0.006%的乳酸菌发酵剂(Yo-Flex,DVS YC-370、クリスチヤンハンセン生产)的同时,添加如表7记载的TG、PG并充分搅拌。将每一定量的原料奶分别加入塑料杯中,在44℃的培养箱内发酵直至pH为4.5~4.6为止。发酵结束后于冷藏库(5℃)中冷却后,用网眼状(216μm)的筛滤取,进行搅拌(スタ一ド化)。将得到的经搅拌的酸奶于5℃下保存,在保存阶段分析外观及口感的变化。此外,使用动态黏弹性检测装置(HAAKE、Rheostress RS1)来评价酸奶的物性。感官评价由3名经过训练的评审员实施。酸奶的物性的测定条件为,使用直径6cm的锥板,制成如下程序:于300秒内进行剪断速度0→100[l/s]的增加后,立即以同样的时间进行剪断速度100→0[l/s]的减少。测定温度为10℃,记录剪断速度为100[l/s]时的粘度。综合的结果如表8所示。
[表7]
[表8]
确认在搅拌化之前,对照品中有大量的表面渗出水,而比较品2中有少量的表面渗出水,但在比较品1、本发明品1~4中基本观察不到。搅拌化之后立即进行的感官评价的结果显示,对照品具有粗涩、水分过多、柔软的口感。比较品1虽被赋予了实体感,但具有粗涩的口感,与此相对,比较品2表面具有光泽,顺滑,但有水分过多、柔软的口感。关于本发明品1~4的任一个,表面均有光泽,有实体感,同时,也被赋予了顺滑感。粘度的测定结果和感官评价很一致,证实了和对照品及比较品2相比,本发明品1~4的粘度明显升高,被赋予了实体感。确认3周冷藏保存后的外观及口感发生了变化,比较品1出现了团块,有显著的粗涩的砂样口感,与此相对,本发明品1中这种倾向减轻,本发明品2~4基本改善。对以上的结果进行综合的评价,认为和对照品及比较品1、2相比较,本发明品1~4在物性、口感(保存中的变化)这点上明显较优。
如上所述,和无添加品相比,仅使用TG的酸奶(比较品1)具有赋予实体感的效果,但出现了保存中品质恶化的问题,此外,仅使用PG的酸奶(比较品2)具有顺滑感,但出现了无实体感且水分过多的口感的问题。但是,在以某一添加比例合用了TG和PG的酸奶(本发明品1~4)中,则显示不仅能解决这些问题,也可赋予表面以光泽而提高品质。
实施例4
市售豆浆(大体(タイシ)无调整;最终蛋白质含量4.8%)、0.2M15NH4Cl、5%D2O,分别单独添加实验例1记载的TG或PG并充分混合。添加TG以使底物/酶比(S/E比)为重量比6000/1。另一方面,PG以TG的0.01~1倍进行添加。将在37℃下温育1小时15分钟后的溶液转移至NMR样品管中,使用实验例1记载的NMR,进行1H-15N HSQC检测。和实施例1一样,对各酶重量比(PG/TG)及活性比(PG/TG),分别算出PG/TG信号强度比的结果如表9所示。
[表9]
依照表10记载的添加比合用TG和PG来对豆腐进行调制。在收容容器中加入30%的卤盐(赤穗化成生产)溶液10g(相当于3g卤盐),在不锈钢壶中量取上述市售豆浆1kg,用开水煮加热至55℃。在豆浆中添加酶溶液并搅拌·混合,快速而自然地注入含有卤盐的收容容器中,用搅拌板上下搅拌4次。盖上,移至55℃的培养箱中,静置50分钟。将豆腐移至盛满水的桶中,放置30分钟~1小时后,将豆腐切开,移至豆腐容器中,测定内容物重量。在容器中添水至没过豆腐为止,用薄膜覆盖后加热密封。置于85℃的恒温水槽中,加热45分钟(2次加热),随后,用流水降温,置于冰水中冷却并冷藏保存。翌日,除去容器内的水并测定固态物的重量,并用于物性和感官评价。
[表10]
物性评价由使用流变仪(不动工业会社生产)的破断试验进行。使用的柱塞为5mm直径的圆盘,破断速度为6cm/分(1mm/秒)。感官评价由5名评审员如下进行:以酶无添加品为0分,对于柔软和硬实在±3之间进行7个等级的评价,求出其平均值。结果如表11所示。和对照品相比,添加了TG的比较品T1及T2的破断应力增加。另一方面,和对照品相比,添加了PG的比较品P1及P2的破断应力减少。本发明品1和添加了相同量的TG的比较品T1具有基本相同的破断应力,且在舌触觉上变得更顺滑。和添加了相同量的TG的比较品T2相比,本发明品2的破断应力稍减少,但和对照品相比,破断应力依然大,且也被赋予了顺滑性。和添加了相同量的TG的比较品T2相比,本发明品3的破断应力减少,但和添加了相同量的PG的比较品P2相比,破断应力大,确认了TG的添加效果。比较品T-P和比较品P1、P2具有同等程度的柔软性,虽已发生了TG反应但是并未发现赋予硬度的效果。这意味着,TG反应由于PG而基本停止。此外,感官评价的结果是,在本发明品1~3的任一个中,能保持TG所引起的硬度赋予效果且比单独添加TG具有更好的舌触觉,综合上赋予了好的口感。也就是说,确认了PG、TG的合用效果。
[表11]
破断应力(g) | 评论 | 综合评价(分) | |
对照品 | 33.9 | - | 2.5 |
比较品(T1) | 38.4 | 硬实 | 3.2 |
比较品(T2) | 54.1 | 很硬实 | 3.5 |
比较品(P1) | 28.2 | 柔软 | 2.4 |
比较品(P2) | 17.9 | 很柔软、易脆 | 2 |
比较品(T-P) | 21.5 | 过于柔软 | 2.7 |
本发明品1 | 36.6 | 非常顺滑、乳脂感 | 4.1 |
本发明品2 | 49.2 | 硬实且置于口中顺滑 | 4.8 |
本发明品3 | 34.1 | 非常顺滑、乳脂感 | 4.2 |
1分:不好
2分:稍稍不好
3分:普通
4分:好
5分:非常好
实施例5
使用表12所示的掺混及试作工序调制乌龙面及中华面。转谷氨酰胺酶及蛋白谷氨酰胺酶在加水时溶解于水中。在乌龙面及中华面中的酶添加量如表13所示。将乌龙面在相对于100g面为15倍量的热水中煮20分钟,随后由训练过的评审员(n=5)评价口感。中华面除了煮的时间为5分钟以外,和乌龙面进行相同的评价。以对照品为基准,对硬度、粘性、顺滑性的项目进行评价(明显减弱:××、稍弱:×、相等:△、稍强:○、明显增强:◎)。乌龙面、中华面的评价结果具有几乎相同的倾向,因此汇总在表4中表示。乌龙面、中华面任一者中,以重量比计,PG/TG比为0.01、0.05、0.2(分别为本发明品1、2、3)时具有被平衡性良好地赋予了面的硬度、粘性、顺滑的口感。也就是说,在面类的实例中也显示了使转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶两者发挥作用而得到良好效果的适当比例。
[表12]
[表13]
试验区 | 酶 | TG | PG | 酶重量比 | 酶活性比 |
(mg) | (mg) | (PG/TG) | (PG/TG) | ||
对照品 | - | 0 | 0 | - | - |
比较品1 | PG | 0 | 0.1 | - | - |
比较品2 | PG | 0 | 0.5 | - | - |
比较品3 | PG | 0 | 2 | - | - |
比较品4 | TG | 10 | 0 | - | - |
本发明品1 | TG,PG | 10 | 0.1 | 0.01 | 0.046 |
本发明品2 | TG,PG | 10 | 0.5 | 0.05 | 0.23 |
本发明品3 | TG,PG | 10 | 2 | 0.2 | 0.92 |
[表14]
评价项目 | 硬度 | 粘性 | 顺滑性 | 综合评价 |
对照品 | 基准 | 基准 | 基准 | 基准 |
比较品1 | × | ○ | ○ | △ |
比较品2 | × | ◎ | ◎ | △ |
比较品3 | ×× | ◎ | ◎ | △ |
比较品4 | ◎ | △ | △ | △ |
本发明品1 | ◎ | ○ | ○ | ○ |
本发明品2 | ○ | ◎ | ◎ | ◎ |
本发明品3 | ○ | ◎ | ◎ | ◎ |
××:明显减弱 ×:稍弱 △:相等 ○:稍强 ◎:明显增强
产业上的利用可能性
依照本发明,可得到和转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶各酶单独使用的情况不同的蛋白质改性效果,可生产具有全新特征的蛋白质食品。此外,可简便地发现TG、PG两酶共同作用于底物的适当条件。故,本发明在食品领域极为有效。
需要说明的是,前述的专利文献等各公开作为引用包含在本说明书中。在本发明的全部公开(含权利要求)的框架内,可以进一步基于其基本的技术思想而对实施形态或实施例进行变更、调整。此外,本发明的权利要求的框架内,可以多样地组合或选择种种公开要素。也就是说,本发明当然地含有包含权利要求的全部公开以及从业者依照技术的思想而得到的各种变形、修正。
Claims (10)
1.蛋白质的改性方法,其通过使蛋白谷氨酰胺酶及转谷氨酰胺酶作用于蛋白质而使蛋白质改性,其中,蛋白谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间和转谷氨酰胺酶添加到蛋白质中的时间大致相同或者在转谷氨酰胺酶作用于该蛋白质之前。
2.权利要求1的方法,其中,以活性比计,添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.05~3∶1。
3.权利要求1或2的方法,其中,以重量比计,添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.01~0.7∶1。
4.权利要求1至3中任一项的改性方法,其中,以NMR信号强度比计,是添加至蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的添加量为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1的条件。
5.权利要求1至4中任一项的方法,其中,蛋白质为选自乳蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、小麦谷蛋白、血浆、肌肉蛋白质、胶原及明胶的1种或2种以上的蛋白质。
6.食品,其含有使用权利要求1至5中任一项的方法改性过的蛋白质。
7.蛋白质改性用酶制剂,其中,以活性比计,转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.05~3∶1。
8.蛋白质改性用酶制剂,其中,以重量比计,转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.01~0.7∶1。
9.蛋白质改性用酶制剂,其特征在于,以NMR信号强度比计,是转谷氨酰胺酶∶蛋白谷氨酰胺酶的掺混比例为蛋白谷氨酰胺酶∶转谷氨酰胺酶=0.2~3.0∶1的条件。
10.蛋白质中的蛋白谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶的适当添加量比的发现方法,通过使转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶分别在同位素标记的铵盐的存在下作用于该蛋白质,将该蛋白质的谷氨酰胺残基的官能团进行同位素标记,测定其NMR信号强度来进行。
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