CN115380116A - 蛋白质脱酰胺方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于利用蛋白质脱酰胺酶实现脱酰胺反应的促进。本发明通过在盐类或多糖类的存在下使蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质，从而实现脱酰胺反应的促进。根据本发明，可期望反应效率的提高。特别是本发明对于豌豆蛋白质等植物性蛋白质的脱酰胺化是有用的。应用本发明而得到的脱酰胺蛋白质(特别是脱酰胺植物性蛋白质)可以用于各种食品或饮料。

Description

蛋白质脱酰胺方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的脱酰胺化。详细而言，涉及蛋白质的脱酰胺方法及其用途、蛋白质的脱酰胺方法中利用的蛋白质改良剂等。
背景技术
以近年来的健康意向的提高为背景，植物蛋白质等的需求大幅增加。另一方面，利用蛋白质脱酰胺酶的蛋白质的脱酰胺化使蛋白质的溶解性提高，赋予作为乳化剂、起泡剂的功能性，因此期待在包含食品、饮料的各种用途中的利用(例如参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2000-50887号公报
发明内容
发明所要解决的课题
利用蛋白质脱酰胺酶的脱酰胺反应为酶反应，因此受到底物、反应温度等条件的影响，有时反应变得不充分。换言之，由于是酶反应，因此有时得不到期望的效果(由脱酰胺化带来的蛋白质的功能性提高等)。因此，本发明的课题在于，提供促进利用蛋白质脱酰胺酶的脱酰胺反应的方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，如果在盐类和/或多糖类的存在下使蛋白质脱酰胺酶发挥作用，则促进蛋白质的交联反应，从而完成了以下所示的本发明。
[1]一种蛋白质脱酰胺方法，其特征在于，在盐类和/或多糖类的存在下使蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质。
[2]根据[1]所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，盐类为选自由碳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐和柠檬酸盐组成的组中的至少1种。
[3]根据[1]或[2]所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，多糖类为结冷胶(gellangum)。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，蛋白质为植物性蛋白质和/或动物性蛋白质。
[6]一种蛋白质改良剂，其含有盐类和/或多糖类、以及蛋白质脱酰胺酶。
[7]根据[6]所述的蛋白质改良剂，其中，盐类为磷酸盐、多聚磷酸盐或柠檬酸盐。
[8]根据[6]或[7]所述的蛋白质改良剂，其中，多糖类为结冷胶。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
[10]一种脱酰胺蛋白质的制造方法，其包括以下工序：
(1)准备包含蛋白质、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
[11]一种食品或药物的制造方法，其包括以下工序：
(1)准备包含含有蛋白质的食品原料或医药原料、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
[12]根据[10]或[11]所述的制造方法，其中，盐类为选自由碳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐和柠檬酸盐组成的组中的至少1种。
[13]根据[10]～[12]中任一项所述的制造方法，其中，多糖类为结冷胶。
[14]根据[10]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
[15]根据[10]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，蛋白质为植物性蛋白质和/或动物性蛋白质。
附图说明
图1是表示使用在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有磷酸二氢钠或碳酸钠的溶剂，进行Z-Gln-Gly与蛋白质谷氨酰胺酶的反应，测定脱酰胺化的反应效率的结果的图。
图2是表示使用在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有碳酸钠的溶剂，进行各种底物蛋白质与蛋白质谷氨酰胺酶的反应，测定脱酰胺化的反应效果的结果的图。
图3是表示在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有碳酸钠的溶剂中测定蛋白质谷氨酰胺酶的热稳定性的结果的图。
具体实施方式
1.蛋白质的脱酰胺方法
本发明的第一方面涉及将蛋白质脱酰胺化的方法(蛋白质脱酰胺方法)。在本发明中，通过在盐类和/或多糖类的存在下用蛋白质脱酰胺酶对蛋白质原料进行处理，从而实现蛋白质脱酰胺反应的促进。
本发明中供酶处理的蛋白质(底物蛋白质)只要是受到上述酶的作用的物质就没有特别限定，对其起源、性状等没有特别限制，可以是植物性蛋白质、动物性蛋白质、菌类来源的蛋白质、藻类来源的蛋白质等中的任一种。
作为植物性蛋白质，可以列举例如：来源于大豆(Soy beans)、豌豆(Green peas)、小扁豆(Lentils)、鹰嘴豆(Chickpeas)、黑豆(Black beans)、蚕豆(Fava bean)等豆类的蛋白质；来源于小麦、大麦、燕麦(Oat)、黑麦、米等谷类的蛋白质；来源于扁桃仁、花生等坚果的蛋白质；来源于大麻籽(Hemp)、奇亚籽(Chia)、藜麦(Quinoa)、苋(Amaranthus)等种子类的蛋白质等作为其例子。
作为动物性蛋白质，可以是哺乳动物来源或昆虫来源中的任一种。作为来源于哺乳动物的蛋白质，可以列举例如：酪蛋白、β-乳球蛋白等乳蛋白；卵白蛋白等卵蛋白；肌氨酸、肌动蛋白等肉蛋白；血清白蛋白等血蛋白；明胶、胶原蛋白等肌腱蛋白质等。另外，作为昆虫来源的蛋白质，例如可列举出蟋蟀来源的蛋白质等。
作为菌类来源的蛋白质，例如可列举出酵母来源的蛋白质、丝状菌来源的蛋白质、真菌类来源的蛋白质(蘑菇来源的菌蛋白等)等。
这些底物蛋白质中，作为脱酰胺化的对象，可优选列举出植物性蛋白质和动物性蛋白质，可更优选列举出植物性蛋白质。
另外，底物蛋白质可以是基于酸、碱等的化学性部分分解蛋白质、基于蛋白酶等的酶促部分分解蛋白质、基于各种试剂的化学修饰蛋白质、或合成肽等。
底物蛋白质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
以上那样的底物蛋白质以溶液或浆料或糊剂状态供于反应，但其浓度没有特别限定，根据目标脱酰胺蛋白质的所期望的性状、状态来确定浓度即可。另外，不限于水溶液，也可以将作为与油脂的乳液的溶液、浆料或糊剂供于反应。进而，也可以在底物蛋白质的溶液、浆料或糊中根据需要添加盐类、糖类、蛋白质、香料、保湿剂、着色剂等。
本发明中使用的盐类优选为水溶性的盐类。对于水溶性的盐类的种类没有特别限定，例如可以举出硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐、二酸化盐(二酸化塩)、磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐、硫氰酸盐、硫代硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐等无机盐；乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、山梨酸盐等有机酸盐。另外，关于构成水溶性盐类的金属原子的种类，没有特别限定，例如可以举出钠、钾等碱金属；镁、钙等碱土金属；锰、铜、锌等其它金属等。其中，优选碱金属。
另外，盐类中，关于多聚磷酸盐，可以为直链状、支链状或环状中的任一种，优选为环状。另外，关于多聚磷酸盐的磷酸的聚合度，没有特别限定，例如可列举出2～1000、优选为3～100、更优选为4～10、进一步优选为5～7。多聚磷酸盐中，可优选列举出六偏磷酸盐。
作为本发明中使用的盐类，可优选列举出磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐、柠檬酸盐、山梨酸盐和碳酸盐；可进一步优选列举出磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、多聚磷酸钠、柠檬酸三钠、碳酸钠。特别是，在使用碳酸盐作为盐类的情况下，能够格外高效地进行底物蛋白质的脱氨基化，进而，还能够提高蛋白质脱酰胺酶的热稳定性。
这些盐类可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。作为2种盐类的组合的一例，可举出磷酸氢盐与碳酸盐的组合。组合使用磷酸氢盐和碳酸盐时，对它们的比率没有特别限定，例如，相对于磷酸氢盐1重量份，可以列举碳酸盐为4～46重量份、优选为15～43重量份、更优选为20～41重量份。
本发明中使用的多糖类优选为水溶性的多糖类。对水溶性的多糖类的种类没有特别限定，例如可以举出淀粉、糊精、葡聚糖、纤维素、木聚糖、罗望子胶、瓜尔胶、塔拉胶、刺槐豆胶、阿拉伯胶、卡拉胶、结冷胶(gellan gum)、黄原胶、刺梧桐胶、果胶、聚半乳糖醛酸、海藻酸等。这些多糖类可以为盐的形态。作为多糖类的盐，例如可列举出钠盐、钾盐等碱金属盐等。
这些多糖类中，可优选列举出酸性多糖类(在构成单糖的至少1个中具有羧基的多糖)；可更优选列举出卡拉胶、结冷胶、黄原胶、刺梧桐胶、果胶、聚半乳糖醛酸、海藻酸；可更优选列举出结冷胶。
本发明中所说的蛋白质脱酰胺酶是将蛋白质中的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的酰胺基脱酰胺的酶，例如可以举出以下的酶。
(1)将蛋白质中的谷氨酰胺残基脱酰胺化，转化为谷氨酸的酶(例如蛋白质谷氨酰胺酶)。
(2)将蛋白质中的天冬酰胺残基脱酰胺化，转化为天冬氨酸的酶(例如蛋白质天冬酰胺酶)。
(3)将蛋白质中的精氨酸残基脱酰亚胺化，转化为瓜氨酸的酶(例如，精氨酸脱氨酶(アルギニンデイミナーゼ)、蛋白精氨酸脱氨酶(プロテインアルギニンデイミナーゼ)、肽基精氨酸脱氨酶(ペプチジルアルギニンデイミナーゼ))。
通常将蛋白质中的谷氨酰胺和天冬酰胺残基脱酰胺化，产生羧基时，该蛋白质的负电荷增加，其结果是等电点降低，水合力增加。进而，由于静电斥力的上升而导致蛋白质间的相互作用的降低，即缔合性的降低。通过这些变化，蛋白质的可溶性、水分散性大幅增大。另外，蛋白质的负电荷的增加解开该蛋白质的折叠，使高级结构变化，使埋在分子内部的疏水性区域在分子表面露出。因此，脱酰胺化蛋白质具有两亲性，成为理想的表面活性剂，蛋白质的乳化力、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性大幅提高。这样，蛋白质的脱酰胺化带来蛋白质的各种功能特性的提高，该蛋白质的用途飞跃性地增大。另外，在将蛋白质中的精氨酸残基脱亚氨基化的情况下，也使蛋白质的疏水性增大，使蛋白质的高级结构变化。
作为蛋白质脱酰胺酶的例子，可举出来自金黄杆菌属(Chryseobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、短稳杆菌属(Empedobacter)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)或香味菌属(Myroides)的蛋白质脱酰胺酶。这些蛋白质脱酰胺酶在日本特开2000-50887号公报、日本特开2001-218590号公报、WO2006/075772等中公开。
另外，作为对蛋白质中的谷氨酰胺残基的侧链进行脱酰胺的酶，具体而言，可以举出来自金黄杆菌属的蛋白谷氨酰胺酶。
另外，作为对蛋白质中的天冬酰胺残基进行脱酰胺的酶，具体而言，可以举出来自叶黄微球菌(Luteimicrobium)属、壤霉菌(Agromyces)属、微杆菌(Microbacterium)属、或雷氏菌(Leifsonia)属的蛋白质脱酰胺酶。这些蛋白质脱酰胺酶例如公开于WO2015/133590中。
另外，作为对蛋白质中的精氨酸残基进行脱亚氨基化的酶，具体而言，可举出来自镰刀菌(Fusarium)属的精氨酸去亚胺酶。该蛋白质脱酰胺酶例如公开于WO2008/000714中。
作为这些蛋白质脱酰胺酶，可优选列举出蛋白质谷氨酰胺酶，可更优选列举出金黄杆菌属来源的蛋白质谷氨酰胺酶，可进一步优选列举出解朊金黄杆菌来源的蛋白质谷氨酰胺酶。解朊金黄杆菌来源的蛋白质谷氨酰胺酶例如作为蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500(天野Enzyme株式会社制)市售，可以使用该市售品。
另外，蛋白质脱酰胺酶也可以是通过蛋白质工程学方法进行了修饰的酶。
蛋白质脱酰胺酶可以使用由产生蛋白质脱酰胺酶的微生物的培养液制备的蛋白质脱酰胺酶。蛋白质脱酰胺酶的制备中使用的微生物没有特别限定，可以使用产生该酶的微生物，例如属于金黄杆菌属、黄杆菌属、短稳杆菌属、鞘氨醇杆菌属、金杆菌属、或香味菌属的微生物。另外，也可以使用通过基因工程导入了蛋白质脱酰胺酶基因的微生物。作为适合于蛋白质脱酰胺酶的制备的微生物的具体例，可以举出属于金黄杆菌属的金黄杆菌物种(Chryseobacterium sp.)No.9670。
例如，可以由上述微生物的培养液或菌体得到蛋白质脱酰胺酶。即，如果是分泌型蛋白质，则可以从培养液中回收，如果是其以外，则可以从菌体内回收。由培养液制备蛋白质脱酰胺酶的方法可以使用公知的蛋白质分离、纯化方法(离心分离、UF浓缩、盐析、使用离子交换树脂等的各种色谱法等)。例如，可以将培养液离心分离而除去菌体，然后组合盐析、色谱法等而得到目标酶。从菌体内回收酶的情况下，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，由此可以取得目标酶。需要说明的是，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体后，进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、纯化)。酶可以通过冷冻干燥、减压干燥等干燥法进行粉末化，此时也可以使用适当的赋形剂、干燥助剂。
本发明中使用的蛋白质脱酰胺酶优选利用纯化后的纯度高的物质，但只要能够催化所期望的反应，则可以是任何纯度。另外，这些酶制剂也可以添加各种盐类、糖类、蛋白质、脂质、表面活性剂作为酶的稳定剂。
作为蛋白质脱酰胺酶之一的蛋白质谷氨酰胺酶的酶活性测定只要没有特别说明，则以Z-Gln-Gly(Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine，苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸)为底物，通过以下记载的方法进行。
<活性测定法>
向含有10mmol/l Z-Gln-Gly的176mmol/l磷酸缓冲液(pH6.5)100μl中添加酶溶液10μl，在37℃下孵育60分钟后，加入12％三氯乙酸溶液100μl停止反应。离心分离(15000rpm、4℃、5分钟)后，对上清液如下使用Ammonia Assay Kit(Sigma-Aldrich公司制)进行测定(A1)。另外，使用水代替酶溶液同样地进行测定(A2)。向100μl F-kit ammonia试剂2中加入10μl上清液和190μl水，在室温下放置5分钟后使用100μl测定340nm的吸光度(E1)。向剩余的200μl中加入1.0μl的试剂3(谷氨酸脱氢酶)后，进一步在室温下放置20分钟后，测定剩余的200μl的340nm的吸光度(E2)。将在上述条件下每1分钟游离1μmol的氨的酶量作为1个单位，按照下式求出。
U/ml＝1.76×[A1(E1-E2)-A2(E1-E2)]
蛋白质的脱酰胺通过培养含有蛋白质、盐类和/或多糖类、以及蛋白质脱酰胺酶的反应液来进行。
只要具有本发明的效果、即促进蛋白质的脱酰胺反应，则利用蛋白质脱酰胺酶进行的处理的条件没有特别限定，通过预备实验调整蛋白质浓度、反应温度、反应pH、反应时间、盐类添加量(添加盐类的情况)、多糖类添加量(添加多糖类的情况)和酶添加量(酶浓度)等，设定与使用的酶相应的最佳的反应条件即可。
并不限定于该例，蛋白质质量在反应溶液中为0.1～30重量％，优选为0.5～20重量％，更优选为0.9～11重量％。酶量相对于1g蛋白质，脱酰胺酶为0.01～1000U，优选为0.1～100U，更优选为0.5～20U，进一步优选为1～10U。盐类量在反应溶液中为0.01～20％(W/V％)，优选为0.05～15％(W/V％)，更优选为0.1～11％(W/V％)。多糖类量在反应溶液中为0.001～10％(W/V％)，优选为0.005～5％(W/V％)，更优选为0.01～1％(W/V％)。反应温度为5～80℃、优选为20～70℃、更优选为30～60℃。反应溶液的pH为2～10、优选为4～8。反应时间为10秒～48小时、优选为10分钟～24小时、更优选为30分钟～12小时、进一步优选为30分钟～4小时。通过以上的反应条件，可以得到脱酰胺化的蛋白质。这些反应的条件可以根据蛋白质的物性、使用的盐类、多糖类、蛋白质脱酰胺酶来适当选择。需要说明的是，最佳的反应条件通过预备实验来决定即可。
2.脱酰胺蛋白质、或含有脱酰胺蛋白质的食品或医药品的制造方法
如果使用本发明的蛋白质脱酰胺方法，则可以制造脱酰胺蛋白质、或含有其的食品、医药品。因此，本发明还提供脱酰胺蛋白质的制造方法和含有脱酰胺蛋白质的食品或医药品的制造方法。脱酰胺蛋白质的制造方法的典型的一个方式包括以下的工序(1)和(2)。需要说明的是，也可以在工序(2)之后追加蛋白质脱酰胺酶的失活工序。关于以下的工序(1)和(2)的具体条件，如上述“1.1.蛋白质的脱酰胺方法”一栏中记载的那样。
(1)准备包含蛋白质、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
另一方面，食品或医药的制造方法的典型的一个方式包括以下的工序(1)和(2)。需要说明的是，也可以在工序(2)之后追加蛋白质脱酰胺酶的失活工序。关于以下的工序(1)和(2)的具体条件，如上述“1.1.蛋白质的脱酰胺方法”一栏中记载的那样。
(1)准备包含含有蛋白质的食品原料或医药原料、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
作为上述(1)的工序中准备好的溶液的一例，可以举出在使用植物性蛋白质制备的植物性乳中添加盐类和/或多糖类而得到的溶液。
通过本发明的方法制造的脱酰胺蛋白质其自身具有商品价值。另一方面，作为各种食品、饮料等的原材料或材料也是有用的。因此，本申请还提供配合有通过本发明的制造方法得到的脱酰胺蛋白质的食品或饮料。此处的食品和饮料没有特别限定。若列举食品及饮料的例子，则可以列举出：水产加工品(竹轮、鱼糕、鱼豆腐、鱿鱼干、干菜、腌渍菜、鱼肉香肠、海味煮、罐头等)、肉食加工品(火腿、培根、香肠、熏肉、咸牛肉、成型肉等)、蔬菜加工品(蔬菜罐·瓶、番茄加工品、蘑菇类加工品、泡菜、干燥蔬菜、炖蔬菜等)、面条·面包类(各种面条、面包、甜点面包等)、谷类加工品(谷麦片、燕麦片、麦片粥、米加工品、麸皮、麦茶等)、乳制品(牛奶、加工乳、乳饮料、浓缩乳、奶粉、炼乳、发酵奶、乳酸菌饮料、酸奶、黄油、奶酪、冰淇淋等)、果实加工品(果实罐·瓶、果酱、酸果酱、干果等)、点心·甜点类(饼干类、烤制点心、米点心、油点心、日式生点心、西洋生点心、半生点心、日式点心、糖果类、巧克力类、口香糖、零食点心、果冻、冷点心等)、饮料等(清凉果汁饮料、碳酸饮料、咖啡饮料、蔬菜品类饮料、茶饮料、无酒精饮料、酒精饮料等)、调味料(蘸料、汤汁、调味汁、沙司等)、汤类、豆腐、面类、面包类、植物原料的替代肉/替代乳制品(替代奶酪、替代乳发酵食品)、调味块(咖喱块、汤块等)、营养辅助食品/饮料(蛋白质粉末、蛋白质饮料、补充剂、营养饮料等)、宠物用食品、宠物用营养辅助食品。进而，作为新型的蛋白质来源的原材料，可用于包含化妆品、医疗用品、微胶囊的原材料、固定化酶等的载体等的广泛的产业。
3.蛋白质改良剂
本发明还提供能够用于蛋白质的脱酰胺化的蛋白质改良剂。本发明的蛋白质改良剂典型地用于本发明的蛋白质脱酰胺方法、脱酰胺蛋白质的制造方法、或食品或医药的制造方法。本发明的蛋白质改良剂除了蛋白质脱酰胺酶以外，还含有盐类和/或多糖类作为有效成分。蛋白质脱酰胺酶、盐类和多糖类的详细情况如上所述，因此省略其说明。作为蛋白质脱酰胺酶的含量，每1g制剂为1～2000U，优选为10～1500U，更优选为50～1000U，但并不限定于该例。作为盐类的含量，每1U蛋白质脱酰胺酶为0.1～10g，优选为0.2～9g，更优选为0.5～8g。多糖类量相对于每1U蛋白质脱酰胺酶为0.01～10mg，优选为0.05～5mg，更优选为0.1～1mg。另外，蛋白质改良剂的最终形态可以为液体状，也可以为固体状(包括粉体状)。蛋白质改良剂除了有效成分以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。
实施例
以下示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
<实施例1>
为了研究蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺化反应是否因盐类的存在而被促进，使用了以豌豆蛋白质(产品名：NOW(注册商标)Sports Organic Pea Protein公司制)为底物的实验。在纯化水中混合豌豆蛋白质10重量％(终浓度)、蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、AmanoEnzyme株式会社制)、柠檬酸钠0.5％(W/V％)(终浓度)，使用盐酸或氢氧化钠调整至pH7.5后，在52.5℃下孵育1.5小时，使其反应。反应结束后，对通过蛋白质谷氨酰胺酶而游离出的氨如下地进行定量。通过将反应溶液在85℃下处理10分钟而使反应停止，对1mL反应液进行离心分离(13000rpm，10min)，将所得的上清液用超纯水稀释100倍，使用Ammonia Assay Kit(Sigma-Aldrich)对氨进行定量。关于酶量，设为每1g底物蛋白质为7.5U的蛋白质谷氨酰胺酶(终浓度)。脱酰胺化率是将每1g豌豆蛋白质的通过蛋白质谷氨酰胺酶游离的氨量除以1g豌豆蛋白质的通过酸解(6N盐酸(终浓度)中、110℃、24小时反应)游离的氨量而算出的。另外，为了进行比较，除了不添加柠檬酸钠以外，在与上述相同的条件下进行酶反应，测定脱酰胺化率。
将结果示于表1。通过在柠檬酸钠的存在下使蛋白质谷氨酰胺酶反应，与不存在盐类的情况相比，豌豆蛋白质的脱酰胺化率显著提高。
[表1]
促进剂 脱酰胺化率(％) 比率
无 15.4％ 1
0.5％柠檬酸钠 19.2％ 1.25
<实施例2>
研究蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺化反应是否因无机盐类的存在而被促进。除了使用磷酸氢二钾(DKP)1.0％(W/V％)(终浓度)代替柠檬酸钠0.5％(W/V％)(终浓度)以外，通过与实施例1同样的方法进行反应和评价。另外，为了进行比较，除了不添加磷酸氢二钾以外，在与上述相同的条件下进行酶反应，测定脱酰胺化率。
将结果示于表2。通过在DKP的存在下使蛋白质谷氨酰胺酶反应，与不存在无机盐的情况相比，豌豆蛋白质的脱酰胺化率大幅提高。
[表2]
促进剂 脱酰胺化率(％) 比率
无 15.4％ 1
1％磷酸氢二钾 20.8％ 1.35
<实施例3>
关于无机盐类的脱酰胺化反应的促进效果，研究了处理pH和无机盐类浓度的影响。除了变更了豌豆蛋白质(在本实施例中，使用产品名：PURIS Pea Protein 870、PURISFoods公司制)、变更了处理pH和磷酸氢二钾(DKP)的浓度以外，通过与实施例2同样的方法进行了反应和评价。需要说明的是，pH的调节使用盐酸或氢氧化钠来进行。
将结果示于表3。在全部pH条件(pH6.5～8.5)下，与不存在DKP的情况相比，无论DKP浓度如何，在DKP的存在下利用蛋白质谷氨酰胺酶的豌豆蛋白质的脱酰胺化率都提高。
[表3]
促进剂 处理pH 脱酰胺化率(％) 比率
无 6.5 28.7％ 1
0.5％磷酸氢二钾 6.5 31.3％ 1.09
1％磷酸氢二钾 6.5 32.2％ 1.12
2％磷酸氢二钾 6.5 32.2％ 1.12
无 7.5 27.5％ 1
0.5％磷酸氢二钾 7.5 29.6％ 1.07
1％磷酸氢二钾 7.5 30.6％ 1.11
2％磷酸氢二钾 7.5 33.1％ 1.20
无 8.5 24.0％ 1
0.5％磷酸氢二钾 8.5 25.1％ 1.05
1％磷酸氢二钾 8.5 25.6％ 1.07
2％磷酸氢二钾 8.5 25.5％ 1.06
<实施例4>
研究蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺化反应是否因多糖类的存在而被促进。变更了豌豆蛋白质(本实施例中，使用产品名：PURIS Pea Protein 870、PURIS Foods公司制)，使用结冷胶0.02％(W/V％)(终浓度)代替柠檬酸钠0.5％(W/V％)(终浓度)，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行反应和评价。另外，为了进行比较，除了不添加结冷胶以外，在与上述相同的条件下进行酶反应，测定脱酰胺化率。
将结果示于表4。通过在结冷胶的存在下使蛋白质谷氨酰胺酶反应，与不存在结冷胶的情况相比，豌豆蛋白质的脱酰胺化率大幅提高。
[表4]
促进剂 脱酰胺化率(％) 比率
无 26.9％ 1
0.02％结冷胶 29.9％ 1.11
<实施例5>
研究了蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺化反应是否通过多糖类和无机盐类的共存而被促进。除了结冷胶0.02％(W/V％)(终浓度)以外，还使用磷酸氢二钾(DKP)1.0％(W/V％)(终浓度)，除此以外，利用与实施例4相同的方法进行反应及评价。另外，为了进行比较，除了不添加结冷胶和DKP两者以外，在与上述相同的条件下进行酶反应，测定脱酰胺化率。
将结果示于表5。通过在结冷胶和DKP的存在下使蛋白质谷氨酰胺酶反应，与不存在多糖类和DKP的情况相比，豌豆蛋白质的脱酰胺化率大幅提高。
[表5]
促进剂 脱酰胺化率(％) 比率
无 25.2％ 1
1％磷酸氢二钾+0.02％结冷胶 32.1％ 1.27
<实施例6>
研究了蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺化反应是否通过多糖类和多聚磷酸的共存而被促进。使用多聚磷酸钠(六偏磷酸钠)(SPP)0.5％(W/V％)(终浓度)代替磷酸氢二钾(DKP)1.0％(W/V％)(终浓度)，除此以外，利用与实施例5相同的方法进行反应及评价。另外，为了进行比较，除了不添加结冷胶和SPP两者以外，在与上述相同的条件下进行酶反应，测定脱酰胺化率。
将结果示于表6。通过在结冷胶和SPP的存在下使蛋白质谷氨酰胺酶反应，与不存在多糖类和SPP的情况相比，豌豆蛋白质的脱酰胺化率大幅提高。
[表6]
促进剂 脱酰胺化率(％) 比率
无 27.0％ 1
0.5％多聚磷酸钠+0.02％结冷胶 31.4％ 1.16
<实施例7>
使用在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有磷酸二氢钠或碳酸钠的溶剂，进行Z-Gln-Gly(Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine，苄氧基羰基-L-谷氨酰氨基甘氨酸)与蛋白质谷氨酰胺酶的反应，评价磷酸二氢钠或碳酸钠的补充添加对脱酰胺化的反应效率造成的影响。具体而言，准备了如下的溶液：在Mcilvaine缓冲液(含有pH7.0、16.5mM的磷酸氢二钠和1.8mM的柠檬酸)中加入Z-Gln-Gly(终浓度60mM)，进一步补充磷酸二氢钠或碳酸钠(追加成分的终浓度0～1.0M)，将pH调整为7.0。在该溶液中添加含有0.13U/ml的蛋白质谷氨酰胺酶(产品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、AmanoEnzyme株式会社制)的酶液0.1ml，在37℃下反应20分钟。然后，添加0.4M三氯乙酸溶液1.0ml，使反应停止。接着，使用氨测定试剂盒(制品名：Ammonia Test Wako，富士胶片和光纯药株式会社制)测定通过蛋白质谷氨酰胺酶游离的氨量。将在不补充添加磷酸二氢钠或碳酸钠的条件(即，仅含有16.5mM的磷酸氢二钠作为盐类的情况)下游离的氨量设为100％，求出补充添加磷酸二氢钠或碳酸钠时的游离的氨量的相对值。
将结果示于图1。其结果可知，在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加磷酸二氢钠或碳酸钠时，脱氨基化的反应效率依赖于磷酸二氢钠或碳酸钠的浓度而提高。特别是在含有磷酸氢钠的溶液中补充添加碳酸钠的情况下，脱氨基化的反应效率显著提高，因此可知即使单独使用碳酸钠作为盐类，也能够提高脱氨基化的反应效率。
<实施例8>
使用在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有碳酸钠的溶剂，进行各种底物蛋白质与蛋白质谷氨酰胺酶的反应，评价脱酰胺化的反应效率。具体而言，准备了如下的溶液：在Mcilvaine缓冲液(含有pH7.0、16.5mM的磷酸氢二钠和1.8mM的柠檬酸)中加入卵白蛋白、牛奶酪蛋白、鹰嘴豆蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白或小麦面筋(终浓度1.0W/V％)，进一步补充添加碳酸钠(终浓度0.5M)，将pH调整为7.0。在该溶液中添加含有0.13U/ml的蛋白质谷氨酰胺酶(产品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、AmanoEnzyme株式会社制)的酶液0.1ml，在37℃下反应20分钟。然后，添加0.4M三氯乙酸溶液1.0ml，使反应停止。接着，使用氨测定试剂盒(制品名：Ammonia Test Wako，富士胶片和光纯药株式会社制)测定通过蛋白质谷氨酰胺酶游离的氨量。在未补充添加碳酸钠的条件(即，仅含有16.5mM的磷酸氢二钠作为盐类的情况)下也进行同样的测定，将在该条件下游离的氨量设为100，求出补充添加碳酸钠时的游离的氨量的相对值。
将结果示于图2。其结果可知，若在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加0.5M的碳酸钠，则利用蛋白质谷氨酰胺酶的底物蛋白质的脱氨基化得到促进。另外，在添加了盐类的反应体系中，对于植物性蛋白质和动物性蛋白质中的任一种，利用蛋白质谷氨酰胺酶的脱氨基化反应均得到促进，特别是对于植物性蛋白质，脱氨基化反应的促进效果显著提高。
<实施例9>
使用在含有磷酸氢二钠的溶液中补充添加有碳酸钠的溶剂，评价蛋白质谷氨酰胺酶的热稳定性。具体而言，将碳酸钠(终浓度为1.0M)补充添加到Mcilvaine缓冲液(含有pH7.0、41.2mM的磷酸氢二钠和4.4mM的柠檬酸)中，在将pH调整为7.0的溶液中添加蛋白质谷氨酰胺酶(制品名：蛋白质谷氨酰胺酶“Amano”500、AmanoEnzyme株式会社制)使其为0.13U/ml，在50℃下孵育120分钟、或在60℃下孵育60分钟，随时间测定蛋白质谷氨酰胺酶的活性。蛋白质谷氨酰胺酶的活性通过上述方法进行。将孵育前的蛋白质谷氨酰胺酶的活性值设为100％，求出蛋白质谷氨酰胺酶的残留活性值。另外，为了进行比较，除了不添加1.0M的碳酸钠以外，在与上述相同的条件下进行试验，经时测定蛋白质谷氨酰胺酶的活性。
将结果示于图3。其结果，确认了在碳酸钠的存在下蛋白质谷氨酰胺酶的热稳定性提高。
产业上的可利用性
根据本发明的蛋白质脱酰胺方法，可实现脱酰胺反应的促进，可期望反应效率的提高。通过本发明得到的脱酰胺蛋白质其自身具有商品价值，另外，也可以用作各种食品、饮料或医药的原材料或材料。即，本发明特别期待在食品、饮料领域及医药领域中的利用、应用。
本发明完全不受所述发明实施方式以及实施例说明限定。在不脱离权利要求书的记载的情况下，在本领域技术人员能够容易想到的范围内，各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报及专利公报等的内容通过引用其全部的内容来引用。

Claims (15)

1.一种蛋白质脱酰胺方法，其中，在盐类和/或多糖类的存在下使蛋白质脱酰胺酶作用于蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，盐类为选自由碳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐和柠檬酸盐组成的组中的至少1种。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，多糖类为结冷胶。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质脱酰胺方法，其中，蛋白质为植物性蛋白质和/或动物性蛋白质。
6.一种蛋白质改良剂，其含有盐类和/或多糖类、以及蛋白质脱酰胺酶。
7.根据权利要求6所述的蛋白质改良剂，其中，盐类为磷酸盐、多聚磷酸盐或柠檬酸盐。
8.根据权利要求6或7所述的蛋白质改良剂，其中，多糖类为结冷胶。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的蛋白质改良剂，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
10.一种脱酰胺蛋白质的制造方法，其包括以下工序：
(1)准备包含蛋白质、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
11.一种食品或药物的制造方法，其包括以下工序：
(1)准备包含含有蛋白质的食品原料或医药原料、以及盐类和/或多糖类的溶液的工序；
(2)用蛋白质脱酰胺酶对准备好的溶液进行处理的工序。
12.根据权利要求10或11所述的制造方法，其中，盐类为选自由碳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、多聚磷酸盐和柠檬酸盐组成的组中的至少1种。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的制造方法，其中，多糖类为结冷胶。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的制造方法，其中，蛋白质脱酰胺酶为蛋白质谷氨酰胺酶。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的制造方法，其中，蛋白质为植物性蛋白质和/或动物性蛋白质。
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