JP7171560B2 - ラクターゼ原末及びラクターゼ製剤 - Google Patents
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Description
本発明は以下の発明を含む。
前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超50μmol以下である、ラクターゼ原末。
項2. 前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超30μmol以下である、項1に記載のラクターゼ原末。
項3. 前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超8μmol以下である、項1に記載のラクターゼ原末。
項4. 105℃で4時間放置後の残存活性が10%以上である、項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
項5. 105℃で4時間放置後の残存活性が50%以上である、項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
項6. 105℃で4時間放置後の残存活性が75%以上である、項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
項7. 前記ラクターゼが、Aspergillus oryzaeが産生するラクターゼである、項1から6のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
項8. 項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末を含む、ラクターゼ製剤。
項9. 105℃で4時間放置後の残存活性が10%以上である、項8に記載のラクターゼ製剤。
項10. 糖賦形剤をさらに含む、項8又は9に記載のラクターゼ製剤。
項11. 前記糖賦形剤の含有量が10質量%以上である、項10に記載のラクターゼ製剤。
項12. ラクターゼ製剤中のガラクトース及びグルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超である、項8から11のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
項13. 医薬品である、項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
項14. サプリメントである、項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
項15. 食品添加物である、項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
項16. 以下の工程(1)及び(2)を含む、ラクターゼ原末の製造方法:
(1)グルコース及びガラクトースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超50μmol以下であるラクターゼ含有液を準備する工程;及び
(2)上記ラクターゼ含有液を乾燥する工程。
項17. 以下の工程(1)~(3)を含む、ラクターゼ製剤の製造方法:
(1)グルコース及びガラクトースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり0μmol超50μmol以下であるラクターゼ含有液を準備する工程;
(2)上記ラクターゼ含有液を乾燥する工程;及び
(3)ラクターゼ乾燥物を製剤化する工程。
項18. 項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、医薬品の製造方法。
項19. 項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、サプリメントの製造方法。
項20. 項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、食品添加物の製造方法。
項21. 項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末、項8から12及び15のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を飲食材料に添加する工程を含む、飲食物の製造方法。
本発明のラクターゼ原末は、ラクターゼ原末の製造工程の最終工程である乾燥工程後に何も添加されていない乾燥状態のラクターゼ濃縮物であり、所定量のグルコース及び/またはガラクトースの混在を許容する。
また、ラクターゼ原末の製造工程において発生する成分(培地成分や培養工程などで生成した夾雑タンパク質、製造工程にて添加した成分など)が混在していても良い。工業的製造の観点から、好ましくは、安定性低下に大きく影響しない程度に、上記成分を含んでいる。ラクターゼ原末の形態としては、特に限定されないが、例えば、粉末状、顆粒状等が挙げられ、好ましくは粉末状が挙げられる。
ラクターゼ原末に含まれるラクターゼは、工業的に微生物の発酵作用を利用して生産されるものであれば、その由来としては特に限定されるものではない。具体的には、真菌、酵母、細菌等の微生物から単離されたものが挙げられる。これらの微生物のうち、真菌としては、コウジカビ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・キャンディダス(Aspergillus candidus)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)等のアスペルギルス(Aspergillus)属のもの、及び、ペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)等のペニシリウム(Penicillium)属のものが挙げられる。酵母としては、クリプトコッカス・テレストリス(Cryptococcus terrestris)、クリプトコッカス・ローレンティ(Cryptococcus laurentii)等のクリプトコッカス(Cryptococcus)属、スポロボロマイセス・シングラリス(Sporobolomyces singularis)等のスポロボロマイセス(Sporobolomyces)属、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)等のクルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、サッカロミセス・フラジリス(Saccharomyces fragilis)、トルラ・クレモリス(Torula cremoris)、およびトルラ・ユーティリス(Torula utilis)等が挙げられる。細菌としては、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・アミノリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)などのバチルス(Bacillus)属細菌、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)などのラクトバチルス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属等の乳酸菌が挙げられる。これらの微生物はそのままラクターゼの生産菌として使用しても良く、自らのラクターゼ遺伝子や他の微生物由来のラクターゼ遺伝子を遺伝子組み換えして生産する際の宿主として使用しても良い。また、上記微生物由来のラクターゼ遺伝子を上記微生物以外の宿主に遺伝子組み換えして使用しても良い。
ラクターゼ原末には、グルコース及びガラクトースのうち、グルコースのみが混在してよいし、ガラクトースのみが混在していてもよいし、その両方が混在していてもよいが、ガラクトースのみが混在していることが好ましい。
ラクターゼ原末には、上述のグルコース及びガラクトース以外の他の糖類が含まれていてもよい。他の糖類としては、多糖、オリゴ糖、二糖、及びグルコース及びガラクトース以外の単糖が挙げられる。他の糖類が含まれる場合、他の糖類は、1種または複数種の混合状態で含まれていてよい。ラクターゼ原末中の他の糖類の含有量は、例えば0質量%以上50質量%以下、好ましくは0質量%以上20質量%以下、さらに好ましくは0質量%以上10質量%以下であってよい。
ラクターゼ原末の保存安定性は、105℃で4時間の超促進条件下で保存した場合に、当該保存前の活性を100%とした場合の残存活性が例えば10%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは75%以上、一層好ましくは80%以上、より一層好ましくは90%以上である。
ラクターゼ原末の製造方法は、グルコース及びガラクトースの総量がラクターゼ10万単位当たり0μmol超50μmol以下であるラクターゼ含有液を準備する工程(工程(1))と、前記ラクターゼ含有液を乾燥する工程(工程(2))とを含む。工程(1)及び工程(2)ともに、工業的に用いられる手法が特に限定されることなく用いられる。
ラクターゼ原末は、そのままで所定の用途に用いられてよい。また、ラクターゼ原末は、当該所定の用途に供されうるラクターゼ製剤の製造における原料用途に用いられてもよい。
ラクターゼ製剤は、上述のラクターゼ原末を有効成分として製剤化されたものであればよく、ラクターゼ原末の成形物として製剤化されたもの、ラクターゼ原末と他の成分との混合物として製剤化されたもの、及びラクターゼ原末と他の成分との混合物の成形物として製剤化されたものが挙げられる。好ましくは、他の成分を含んで製剤化されたものである。ラクターゼ製剤の製剤形態としては、経口で摂取できれば特に限定されず、例えば粉末剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤などの形態が挙げられる。
ラクターゼ製剤中のラクターゼの量は、例えば1質量%以上99質量%以下、好ましくは10質量%以上90質量%以下、より好ましくは55質量%以上65質量%以下であってよい。
本発明のラクターゼ製剤は、他の成分として糖賦形剤を含んでいても良い。つまり本発明のラクターゼ製剤に含まれていてよい糖賦形剤は、ラクターゼの濃縮の過程において濃縮すべきラクターゼ液中に加えられたものではなく、濃縮されて乾燥状態となったラクターゼ原末に対し乾燥状態で混合されたものである。
本発明のラクターゼ製剤が糖賦形剤を含んでいる場合、ラクターゼ製剤は、ラクターゼの作用により糖賦形剤から生じたガラクトース及び/又はグルコースを含んでよい。ラクターゼ製剤に含まれるガラクトース及びグルコースの総量は、ラクターゼの作用により糖賦形剤から生じた分と、ラクターゼ原末に含まれていた分とを合わせた総量として、賦形効果及び/又はラクターゼ製剤の保存安定性を良好に得る観点から、適宜設定できるが、ラクターゼ10万単位当たり例えば0μmol超、好ましくは0.1μmol以上1000μmol以下、より好ましくは1μmol以上500μmol以下、さらに好ましくは5μmol以上300μmol以下、一層好ましくは50μmol以上200μmol以下であってよい。
本発明のラクターゼ製剤は、他の成分として糖賦形剤を含んでも良好な保存安定性を有する。具体的には、ラクターゼ製剤の保存安定性は、105℃で4時間の超促進条件下で保存した場合に、当該保存前の活性を100%とした場合の残存活性が例えば10%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、一層好ましくは75%以上、であってよい。
本発明のラクターゼ製剤には、他の成分として、上述の糖賦形剤以外のさらなる他の成分を含んでよい。たとえば、糖賦形剤以外の賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、制酸剤などが挙げられる。糖賦形剤以外の賦形剤としては、例えばタルク等の無機賦形剤が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばカルボキシメチルスターチナトリウム、カルメロースカルシウム、カルメロース、トウモロコシデンプン等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール等が挙げられる。制酸剤としては、クエン酸三ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウムが挙げられる。上述以外にも、他の成分としては、ラクターゼ製剤の用途(例えば、医薬品、サプリメント、食品添加物等)に応じた成分(添加剤)が適宜当業者によって選択されてよい。例えば、保存料、安定剤、乳酸菌、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、製造用剤、甘味料、調味料等が挙げられる。
ラクターゼ製剤は、例えば上述のラクターゼ原末を製剤化することで得られる。つまり、ラクターゼ製剤の製造方法は、上述の工程(1)及び工程(2)と、ラクターゼ原末を製剤化する工程(3)とを含む。工程(3)においては、ラクターゼ原末の成形及び/又は他の成分との混合が行われる。成形としては、粉末化、顆粒化、打錠等が挙げられる。他の成分は、上述の通りである。これによって、経口で摂取できる任意の製剤形態(例えば、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤)に製剤することができる。工程(3)は、終始乾燥状態で行われることが好ましい。糖賦形剤を用いて製剤化する場合は、ラクターゼ原末と糖賦形剤とはいずれも乾燥状態で混合する。ラクターゼ原末と糖賦形剤とを含む混合物は、液体化されることなくラクターゼ製剤として得る。
ラクターゼ製剤は、そのままで所定の用途に用いられてよい。ラクターゼ製剤の当該所定の用途としては、産業用酵素剤としての用途及び酵素試薬としての用途などが挙げられる。
(A)ラクターゼ原末(乾燥ラクターゼ濃縮物)の調製
以下のようにして、ラクターゼ原末(乾燥ラクターゼ濃縮物)を調製した。
1.生産菌(Aspergillus oryzae)を液体培養で30℃、5日間培養した。小麦ふすま4w/v%、黄粉1w/v%、リン酸アンモニウム0.25w/v%、可溶性でんぷん3w/v%を含む培地を使用した。
2.ケイソウ土ろ過によって生産菌体を除去した。
3.限外ろ過膜によってラクターゼ原末の活性が10,000ALU/g以上になるよう濃縮した。
4.限外ろ過膜によって、等量加水し、元の液量まで濃縮する工程を5回以上繰り返すことで脱塩すると共にガラクトース及びグルコースの総量を調節した。
5.噴霧乾燥あるいは凍結乾燥で粉末化した。
乾燥ラクターゼ濃縮物中のガラクトース含量を、ガラクトース測定キットであるLactose/D-Galactose(R-Biopharm、catalog No.10 176 303 035)を用い、自動分析装置TBA-120FR(東芝メディカルシステムズ)にて測定した。
乾燥ラクターゼ濃縮物中のグルコース含量を、グルコース測定キットであるグルコースCII-テストワコー(和光純薬工業、Code 439-90901)を用いて測定した。
乾燥ラクターゼ濃縮物中の還元糖総量を、DNS法(ジニトロサリチル酸法)にて測定した。具体的には、DNS溶液(0.7w/v% 3,5-ジニトロサリチル酸、1.21w/v% 水酸化ナトリウム、0.02w/v% 酒石酸カリウムナトリウム、0.57w/v% フェノール、0.55w/v% 炭酸水素ナトリウム)0.6mLを試験管に分注し、さらに、乾燥ラクターゼ濃縮物を精製水で適当な濃度に希釈したラクターゼ溶液を0.2mL加えた。沸騰水中で5分間加熱発色させ、流水中で15分間冷却した後、4.2mLの精製水を添加し、分光光度計で波長550nmの吸光度を測定した。また、ラクターゼ溶液の代わりにグルコース溶液(0、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)で同様の操作を行いグルコース検量線を作成した。作成した検量線より乾燥ラクターゼ濃縮物中の還元糖量の総量をグルコースの量として算出した。
乾燥ラクターゼ濃縮物の保存安定性を、加速保存安定性試験により評価した。加速条件としては、乾燥ラクターゼ濃縮物を105℃で4時間保存とした。評価は、加速条件での保存前後におけるラクターゼ活性から以下に基づいて残存活性(%)を算出した。
残存活性(%)=保存後の活性(ALU/g)/保存前の活性(ALU/g)×100
ラクターゼ活性は、米国食品化学物質規格(FCC:Food Chemical Codex)第4版にLactase(Acid)(β-galactosidase)として収載されている方法に準じて測定した。具体的には、o-ニトロフェニル-β-ガラクトピラノシド(ONPG)を基質として、反応温度37℃、反応pH4.5で15分間反応させたとき、1分間に1μmolのo-ニトロフェノールを遊離する酵素量を1単位(1ALU;1 Acid Lactase Unit)とした。
実施例1で得られたラクターゼ原末(乾燥ラクターゼ濃縮物)を精製水に溶解し、ラクターゼ溶液を調製した。ラクターゼ溶液に異なる濃度でガラクトースを添加して溶解し、その後、凍結乾燥にて粉末化し、ガラクトース量の異なる乾燥ラクターゼ濃縮物を調製した。得られた乾燥ラクターゼ濃縮物について、実施例1と同様にガラクトース及びグルコースの含有量及び還元糖総量を測定し、かつ、保存安定性を評価した。
実施例1で得られたラクターゼ原末(乾燥ラクターゼ濃縮物)を精製水に溶解し、ラクターゼ溶液を調製した。ラクターゼ溶液に異なる濃度でグルコースを添加して溶解し、その後、凍結乾燥にて粉末化し、グルコース量の異なる乾燥ラクターゼ濃縮物を調製した。得られた乾燥ラクターゼ濃縮物について、実施例1と同様にガラクトース及びグルコースの含有量及び還元糖総量を測定し、かつ、保存安定性を評価した。
実施例1~9及び比較例1~6の結果を表1に示す。このうち、保存安定性について、ガラクトース及びグルコースの総量と残存活性との関係をプロットしたグラフを図1に示す。さらに、図1におけるガラクトース及びグルコースの総量が50μmol/10万単位である場合を横軸方向に拡大したグラフを図2に示す。
実施例1と同様にして、ラクターゼ原末を調製し、ガラクトース及びグルコースの含有量及び還元糖総量を測定し、かつ、保存安定性を評価した。なお、ラクターゼ原末中のタンパク質の量は80±5質量%、多糖及びオリゴ糖の総量は5±10質量%であった。
実施例10で得られたラクターゼ原末に、賦形剤としてデキストリンを乾燥状態で混合してラクターゼ組成物とすることで、ラクターゼ製剤(賦形品)を調製した。得られた賦形品中におけるデキストリンの割合は、20質量%であった。この賦形品についても、実施例1と同様にして、ガラクトース及びグルコースの含有量及び還元糖総量を測定し、保存安定性を評価した。なお、ラクターゼ製剤中のタンパク質の量は60±5質量%、多糖及びオリゴ糖の総量は25±5質量%であった。
実施例10~11の結果を表2に示す。表2においては、比較参照用に、比較例1及び比較例4の結果も併せて示している。さらに、実施例10~11について、図1のグラフに重ねて円ドットでプロットしたグラフを図3に示す。
Claims (21)
- ラクターゼと、ガラクトース及び/又はグルコースとを含み、
前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上50μmol以下である、ラクターゼ原末。 - 前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上30μmol以下である、請求項1に記載のラクターゼ原末。
- 前記ガラクトース及び前記グルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上8μmol以下である、請求項1に記載のラクターゼ原末。
- 105℃で4時間放置後の残存活性が10%以上である、請求項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
- 105℃で4時間放置後の残存活性が50%以上である、請求項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
- 105℃で4時間放置後の残存活性が75%以上である、請求項1から3のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
- 前記ラクターゼが、Aspergillus oryzaeが産生するラクターゼである、請求項1から6のいずれか1項に記載のラクターゼ原末。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末を含む、ラクターゼ製剤。
- 105℃で4時間放置後の残存活性が10%以上である、請求項8に記載のラクターゼ製剤。
- 糖賦形剤をさらに含む、請求項8又は9に記載のラクターゼ製剤。
- 前記糖賦形剤の含有量が10質量%以上である、請求項10に記載のラクターゼ製剤。
- ラクターゼ製剤中のガラクトース及びグルコースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上である、請求項8から11のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
- 医薬品である、請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
- サプリメントである、請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
- 食品添加物である、請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤。
- 以下の工程(1)及び(2)を含む、ラクターゼ原末の製造方法:
(1)グルコース及びガラクトースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上50μmol以下であるラクターゼ含有液を準備する工程;及び
(2)上記ラクターゼ含有液を乾燥する工程。 - 以下の工程(1)~(3)を含む、ラクターゼ製剤の製造方法:
(1)グルコース及びガラクトースの総量が、ラクターゼ10万単位当たり1.9μmol以上50μmol以下であるラクターゼ含有液を準備する工程;
(2)上記ラクターゼ含有液を乾燥する工程;及び
(3)ラクターゼ乾燥物を製剤化する工程。 - 請求項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、医薬品の製造方法。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、サプリメントの製造方法。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末又は請求項8から12のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を、他の成分と混合及び/又は成形する工程を含む、食品添加物の製造方法。
- 請求項1から7のいずれか1項に記載のラクターゼ原末、請求項8から12及び15のいずれか1項に記載のラクターゼ製剤を飲食材料に添加する工程を含む、飲食物の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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