CN103263688A - 一种明胶组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种明胶组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种明胶组合物，其包括羟化明胶、微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白质谷氨酰胺酶；其中，所述羟化明胶为20％-60％脯氨酸羟化的明胶。本发明明胶组合物在4℃～10℃条件下仍具有极优的止血效果。本发明还公开了明胶组合物的制备方法及应用。

Description

一种明胶组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种明胶组合物，其包括羟化明胶、微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白质谷氨酰胺酶，该组合物可用作止血剂，用于硬明胶胶囊的预分装制剂。
背景技术
现有技术中明胶已经被广泛用于制备胶囊和止血，如明胶组合物(中国专利申请号：98811268.X)，软明胶胶囊制剂(中国专利申请号：200780010679.0)，强生医疗器材有限公司的Surgiflo流体明胶，壳聚糖明胶(中国专利申请号：200310121182.X)，改性明胶(中国专利申请号：2009102444834.6)以及其他用于止血的明胶，如中国专利200980131973.6，200780051215.4，201110365186.7等；美国专利6,652,840，8,133,484，6,194,138等。)重组明胶(中国专利00818371.6)。一般而言，明胶的融化点随着羟化程度的提高而提高，但是可以提高薄膜强度，且脯氨酸残基的不完全羟化可以保证明胶的低温稳定性。
微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase，缩写MTG)与凝血因子XIII属于同一个家族的酶，在结构上有一定区别，但是在功能上极度相似，且MTG是非钙离子依赖的酶，稳定性比较好，容易制备与纯化。MTG催化明胶中的赖氨酸与谷氨酰胺进行交联，形成良好的网状结构。MTG与明胶作用形成的网状胶不会受热潮解(Chen T，Embree HD，BrownEM，TaylorMM，Payne GF.，Biomaterials.2003Aug；24(17)：2831-41，美国专利：5,834,232)。用MTG增强明胶的交联，以提高其强度和黏性，用于制作止血材料，止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK，Chen T，williams CM，Markley KM，Payne GF.BIOmacromolecules.2004Jul-Aug；5(4)：1270-9；中国专利：200980131973.6和201110365186.7；美国专利8,133,484；欧洲专利W02012017415，W02011132153和CN102124058)。现有的技术所采用的MTG是指在低温4℃～10℃也可完全发挥活性，此种MTG可以通过诱变，基因工程或蛋白质修饰来获得，本发明一些实施例中的MTG为诱变和基因工程获得。MTG作为酶制剂，室温条件下易大活，故须低温保存，但是在手术过程中，会立即从低温中拿出直接用，普通的MTG不能在低温条件下完全发挥活性，导致止血效果差。
蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase，缩写PG)作用于蛋白质或肽的谷氨酰胺，脱去谷氨酰胺的酰胺基，增加蛋白质的溶解度，没有蛋白酶活性，并且不会导致蛋白质的交联和水解，使明胶大去凝胶特性。蛋白谷氨酰胺酶的制备纯化和应用(SHOTAROYAMAGUCHI，MASAAKI YOKOE，A Novel Protein-Deamidating Enzyme fromChryseobacterium proteolyticum sp.nov.，a Newly Isolated Bacterium from Soil，APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2000，p.3337-3343；美国专利：6,770,469和US7,846,709B2)。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明创新地提出一种新的明胶组合物，利用复合酶对明胶进行改性，在改善部分羟化明胶难溶之同时还兼顾羟化明胶本身的硬度和低温稳定性，显著增强在极端条件下的止血效果。
本发明提供一种新的明胶组合物，包括羟化明胶、微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白质谷氨酰胺酶；其中，所述羟化明胶是为20％-60％脯氨酸羟化的明胶。优选地，羟化明胶为30％-40％脯氨酸羟化的明胶。本发明中的羟化明胶是指经脯氨酸羟化的明胶，而非赖氨酸羟化。本发明明胶组合物的机械性能(粘合性，弹性，强度)稳定。所述明胶组合物还可以为液态，还可冻干制成固体。
本发明明胶组合物中，组分微生物谷氨酰胺转氨酶可以发挥酶活性对羟化明胶进行改性修饰。进一步地，在较低温度4℃～10℃条件下，所述组合物中的微生物谷氨酰胺转氨酶仍然可以发挥酶活性对羟化明胶进行改性修饰，形成稳定的、高粘合强度的弹性凝胶。本发明明胶组合物，在温度4℃～10℃条件下，能发挥较强的止血效果，并且，用酶制剂替代有害化学抑制剂来控制组合物的柔性和交联程度。
进一步地，本发明明胶组合物中的各成分可溶于各种缓冲液中，形成明胶组合物溶液。优选地，可溶于磷酸盐缓冲液中。所述明胶组合物还可以溶于乙酸盐缓冲液、Tris/HCl缓冲液等其他缓冲液中。明胶组合物溶液的离子强度为约0.01M～0.5M。优选地，离子强度为约0.05M～0.1M。明胶组合物溶液的pH调节为5～8。优选地，pH调节为6～7。
本发明明胶组合物中，组分微生物谷氨酰胺转氨酶的电泳纯度为至少约90％以上。优选地，纯度为95％以上，且比活性大于25U/mg。微生物谷氨酰胺转氨酶在低温4℃～10℃范围内可以较完全发挥活性。
本发明中，微生物谷氨酰胺转氨酶基因序列如序列2(SEQ ID NO.2)所示，是微生物来源的，分子量为38kDa，是在原有茂源链霉菌(Streptoverticillium mobaraense)基础上，让其产酶基因进行定向改造或者进行各种诱变，包括紫外和化学诱变，使其在保持原有酶活性基础上同时可在低温条件下较完全发挥活性。本发明中，微生物谷氨酰胺转氨酶在低温4℃～10℃条件下可发挥较完全活性，在低温储存条件下可拿出即用，使其在急救过程中发挥更出色的止血效果。
本发明明胶组合物中，组分蛋白质谷氨酰胺酶的电泳纯度为至少约90％以上，优选地，纯度为95％以上，且比活性大于10U/mg。
本发明中，蛋白质谷氨酰胺酶是微生物来源的，分子量约为20kDa，是由粘金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)发酵产生的。本发明中，蛋白质谷氨酰胺酶具有脱酰胺基团作用，对蛋白质和肽的谷氨酰胺基团进行脱酰胺作用，不会导致蛋白质的交联和水解，改变蛋白质高级结构，从而增强蛋白质表面亲水性，使其溶解性更好。同时，蛋白质谷氨酰胺酶可以协同调节微生物谷氨酰胺转氨酶对明胶的交联反应，得到交联程度和粘性提高的明胶。较佳地，使本发明明胶组合物达到止血效果最佳时的交联程度。
本发明创新地提出利用复合酶对明胶进行改性，微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白质谷氨酰胺酶两种酶制剂相辅相成，使其结构更加稳定，功能性更强，增强交联后明胶组合物的弹性，在手术缝针时候不会出现止血剂断裂或变脆的情况。本发明明胶组合物维持三链螺旋结构，即交联结构域(Gly-X-Y)。同时修饰过的明胶具有较低的抗原性和过敏原性，这点对于在内脏上用于止血是至关重要的。
本发明还提出明胶组合物的制备方法，将微生物谷氨酰胺转氨酶、蛋白质谷氨酰胺酶分别溶于磷酸盐缓冲液中，形成微生物谷氨酰胺转氨酶溶液、蛋白谷氨酰胺酶溶液；将羟化明胶溶于磷酸盐缓冲液中，形成羟化明胶溶液；将所述羟化明胶溶液与蛋白谷氨酰胺酶溶液按10/1-2(v/v)进行混合，然后，按总体体积1/3的比例加入微生物谷氨酰胺转氨酶溶液。其中，制备过程中涉及的各溶液均可以分别包装低温储存。制备得到的产物明胶组合物作为止血剂，可以在低温条件下拿出后即用。
具体地，将明胶、微生物谷氨酰胺转氨酶、蛋白质谷氨酰胺酶分别溶于磷酸盐缓冲液中，在30℃-50℃温度下水浴溶解，优选地，在37℃水浴溶解；然后，将明胶溶液与蛋白质谷氨酰胺酶按10/1-2(v/v)混合。然后，加入总体积1/3的微生物谷氨酰胺转氨酶溶液。
其中，所述羟化明胶溶液浓度15％w/v到40％w/v范围内，优选地，所述羟化明胶溶液浓度20％w/v到30％w/v范围内。
其中，所述微生物谷氨酰胺转氨酶在本发明明胶组合物中的浓度在约1U/g到180U/g范围内，优选地，在50U/g到100U/g范围内。
其中，所述蛋白质谷氨酰胺酶在本发明明胶组合物中的浓度在约1U/g到80U/g范围内，优选地，在10U/g到50U/g范围内。
其中，所述羟化明胶溶液、所述蛋白质谷氨酰胺酶溶液与所述微生物谷氨酰胺转氨酶溶液的体积比为10∶1-2∶4。
利用复合酶在不同时间段对明胶进行修饰，添加量和添加顺序如上述制备过程所述。
本发明还提出了所述明胶组合物作为止血剂的应用，可广泛用于内脏和外伤的止血。本发明应用中，明胶组合物可以为液态，还可以冻干制成固体，可打泡冻干制成明胶海绵。本发明明胶组合物的各组成成分均可以被人体吸收，不会引起炎症反应。
本发明应用中，所述明胶组合物可应用在4℃～10℃低温下的止血。所述明胶组合物中的微生物谷氨酰胺转氨酶在低温储存后，可以直接应用，在急救过程中发挥更出色的止血效果。本发明中，所采用的PG不仅作用于明胶，将明胶进行改性，使其在低温的条件下也能溶解，让其与MTG协同控制明胶的交联反应，产生更加稳定，强度和黏性更高的网状结构。同时，PG可以控制MTG的交联反应时间，使明胶达到我们所希望的交联程度和功能性质。而不需要添加那些对人体有害的化学物质如三氯乙酸等来终止反应。本发明明胶化合物用于止血剂。
附图说明
图1表明温度对本发明明胶组合物中的MTG酶活性的影响；
图2表明本发明明胶组合物中的MTG纯化后的电泳图；
图3表明本发明明胶组合物中的MTG通过强阳离子交换柱后的电泳图；
图4表明本发明明胶组合物中的PG纯化后的电泳图；
图5表明本发明明胶组合物中的MTG对不同浓度明胶的作用；其中，A为1min后凝结情况检测结果，B为20min后凝结情况检测结果；
图6表明本发明明胶组合物中的MTG和明胶对血液的凝结作用；
图7表明本发明明胶组合物在外伤口的止血作用；其中，A为羟化明胶、MTG和PG组合物，B为羟化明胶和MTG组合物。
图8表明本发明明胶组合物在肝脏伤口的止血作用；其中，A表示手术前，B表示伤口切开后，自然流血10秒后施加本发明的明胶组合物，C表示施加本发明明胶组合物后2min30s的情况，D表示施加本发明明胶组合物后5分钟的情况，E表示用手动方式检验本发明明胶组合物的粘合性。
图9表明PG添加量对本发明明胶组合物中的MTG-明胶凝胶性能的影响。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1基因工程方法制备微生物谷氨酰胺转氨酶(MTG)
野生MTG菌株基因如序列1(SEQ ID NO.1)所示，本发明所用的MTG菌株基因如序列2(SEQ ID NO.2)所示，在73位G变为T，750位T变为G。野生MTG氨基酸序列如序列3(SEQ ID NO.3)所示，本发明所用的MTG氨基酸序列如序列4(SEQ ID NO.4)所示，第25位Gly突变为Cys，第250位Ser突变为Arg。设计并委托生物技术公司(如北京全式金生物技术有限公司，上海生物工程公司)合成SEQ ID NO.2所示序列的MTG菌株基因，然后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-32的EcoRV位点上，再将表达载体转到大肠杆菌BL21中，形成工程菌。基因工程菌在LB培养基中培养，培养24小时后，超声破碎菌体，12000rpm4℃离心10min去菌体，沉淀溶于50mM PBS pH6.0缓冲液中，12000rpm4℃离心5min，收集上清。
实施例2微生物谷氨酰胺转氨酶MTG的精细纯化
将实施例1得到的上清液用0.22μm滤膜进行过滤，收集滤液。通过强阳离子交换柱，离子交换柱为GE公司的预装柱HiPrep16/10SP XL，流速2ml/min，样品通过离子交换柱之前先用50mM pH6.0磷酸盐缓冲液平衡柱子。洗脱为0-1M氯化钠线性梯度洗脱，在100mM氯化钠时洗脱峰为MTG，收集峰，再通过凝胶过滤柱HiLoad16/60Superdex，流速1ml/min，用50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集峰。
将纯化得到的MTG在不同温度下检测酶活，实验结果如图1所示，图1表明本发明的微生物谷氨酰胺转氨酶最适反应温度在30℃～40℃之间，并且在4℃到10℃之间，微生物谷氨酰胺转氨酶可以发挥最适温度时酶活的70％～80％。
SDS-PAGE电泳如图2所示，图2中泳道M为蛋白质maker，泳道2位纯化后MTG。泳道2可以看出纯化以后只有约38kDa的MTG主要条带，其他杂蛋白条带几乎没有，进行密度分析表明纯度大于95％。
实施例3微生物谷氨酰胺转氨酶MTG的发酵
菌株：诱变筛选获得的茂源链霉菌(Streptoverticillium mobaraense)，经测序所得结果与SEQ ID NO.1的序列相同。
诱变方法：向茄子瓶斜面培养基(高氏一号培养基)中加入10ml冷无菌种子培养基，用接种针充分刮取表面菌丝，倒入装有20～30颗玻璃珠的瓶子中，30℃下，200r/min震荡培养1h，使孢子处于萌发状态。操作在红灯或避光条件下进行，提前0.5h开紫外灯，使光源稳定。取稀释到10倍后的孢子悬浮液5ml置于直径为9cm带磁力搅拌子的灭菌培养皿中，进行紫外诱变。诱变条件为：紫外灯功率15W，照射高度30cm，磁力搅拌器搅拌。照射时间一般为90s。避光1h以上，钝化修复酶，防止光修复。照射后的孢子悬浮液稀释至104-105′涂布于高氏培养基上。28℃培养7d。
种子培养基(组分g/L)：甘油20，酵母膏5，鱼粉蛋白胨25，MgSO4·7H2O2，K2HPO4·3H2O2，pH7.4，121℃灭菌20min。发酵培养基(组分g/L)：甘油20，酵母膏6，鱼粉蛋白胨25，MgSO4·7H2O2，K2HPO4·3H2O2，pH7.4，121℃灭菌20min。
培养方法：茄子瓶斜面培养7d后，用无菌水洗下斜面孢子，混匀后接种孢子悬液于装有种子培养基摇瓶中，30℃、200r/min条件下培养24h。将培养好的种子液按8％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中，30℃、200r/min条件培养36h。
初步纯化：将发酵液离心出去菌体后，超滤浓缩，浓缩液用酒精沉淀，冷冻干燥。
实施例4微生物谷氨酰胺转氨酶的分离纯化
将2.5％上述实施例3得到的冻干的酶粉(或泰兴市东圣食品科技有限公司的食品级MTG，型号TG-I)溶解于50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液中来制备MTG溶液。然后离心留上清液。上清液再用0.22μm的滤膜进行过滤，收集滤液。通过强阳离子交换柱，离子交换柱为GE公司的预装柱HiPrep16/10SP XL，流速2ml/min，样品通过离子交换柱之前先用50mMpH6.0的磷酸盐缓冲液进行平衡柱子。洗脱为0-1M的氯化钠线性梯度洗脱，在100mM氯化钠时洗脱峰为MTG，收集峰，进行脱盐处理，超滤浓缩，冻干。
酶活测定方法：采用氧肟酸比色法。(Grossowicz N，Wainfan E， Borek E，et al.Theenzymatic formation of hydroxamic acids from glutamine and asparagine[J].J Biol Chem，1950，187(1)：111-125.)一个MTG酶活单位定义为37℃下每分钟催化底物(CBZ-Gln-Gly)生成1μmolL-谷氨酸-γ-单羟氧肟酸所需的酶量。
Folin-酚法检测蛋白含量；通过显色基质法测定内毒素含量。
实验结果为：所得到的纯化的MTG比活性大于25u/mg，内毒素经鲎试剂检测小于5EU/g。
所得到的纯化的MTG经SDS-PAGE电泳，如图3所示，泳道M为蛋白质maker，泳道1为未纯化的MTG，泳道2为纯化后的MTG，泳道3～6为线性洗脱过程中其他波峰收集的样品，泳道2进行密度分析表明纯度大于90％。表明本实施例的纯化工艺可以将发酵后的含有大量杂蛋白的MTG纯化为更适合医用的MTG组合物。
实施例5蛋白质谷氨酰胺酶的发酵
种子培养基(1000ml)：多聚蛋白胨10g，酵母提取物2g，硫酸镁1g。调pH至7.0。发酵培养基：(1000ml)：乳糖5g；蛋白胨10g；Na2HPO4·12H2O3.8g；KH2PO40.25g；MgSO4·7H2O：0.25g；FeSO4·7H2O：0.05g。调pH至7.2。
发酵罐的空消，配制发酵培养基进行实消，经过种子培养基培养的菌种(Chryseobacteriumgleum JCM2410)(参见专利US6,770,469B2)以2～5％(v∶v)的量接种，培养条件为：温度，30℃；罐压0.05～0.06MPa；搅拌转速为300rpm；pH7.2；通气量：0.5V/V·M。每隔2个小时取样测酶活，在酶活达到最大时停止发酵。发酵液进行离心去菌体，超滤浓缩，酒精沉淀，冷冻干燥得到粗酶。
实验结果为：蛋白质谷氨酰胺酶可以通过微生物发酵大量获得，成本低，且为外分泌蛋白更容易进行提取和纯化。图4中的泳道2所示，发酵得到的粗酶，电泳纯度很低，含有大量的杂蛋白，比活性仅有500U/g。无法用于医用材料，需实施例6进一步分离纯化。
实施例6蛋白质谷氨酰胺酶的分离纯化
将5％上述实例4冻干的酶粉(或Amano的商品PG产品，食品级)溶解于50mM pH7.0的磷酸盐缓冲液中来制备PG溶液。然后离心留上清液。上清液再用0.22μm的滤膜进行过滤，收集滤液。通过弱阳离子交换柱，离子交换柱为GE公司的预装柱HiPrep16/10CM FF，样品通过离子交换柱之前先用50mM pH7.0的磷酸盐缓冲液进行平衡柱子，流速为2ml/min，洗脱为0-1M的氯化钠线性梯度洗脱，在150mM氯化钠时洗脱峰为PG，收集峰，进行脱盐处理，超滤浓缩，冻干。
Folin-酚法检测蛋白含量；显色基质法测定内毒素含量。
实验结果：所得到纯化后的PG比活性大于10u/mg，内毒素经鲎试剂检测小于5EU/g。所得到的纯化的PG经SDS-PAGE电泳，如图4所示，泳道M为蛋白质maker，泳道1为纯化后的PG，泳道2为未纯化的PG，泳道1进行密度分析表明纯度大于95％。表明本实施例的纯化工艺可以将发酵后的含有大量杂蛋白的PG纯化为更适合医用的PG组合物。
实施例7蛋白质谷氨酰胺酶酶活测定
原理：蛋白质谷氨酰胺酶作用于底物Cbz-Gln-Gly，分解出游离的氨。氨在硝普钠的催化作用下，以次氯酸钠为氧化剂，与苯酚生成蓝绿色的靛酚蓝染料，630nm测定吸光值。
试剂，包括：
0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)：称取2.722g磷酸二氢钾(KH2PO4)，加水溶解，定溶至1000ml(Solution I).称取2.839g磷酸氢二钠，加水定溶至1000ml(Solution II)。加入适量的Solution I到Solution II中(即用Solution I调节Solution II的pH)，调节pH至7.0
0.176mol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)：称取23.95g磷酸二氢钾，加水溶解，定容至1000ml(SolutionIII)。称取24.98g磷酸氢二钠，加水溶解，定容至1000ml(SolutionIV)。加适量SolutionIII到SolutionIV中，调节pH至6.5。
三氯乙酸溶液：称取65.36g三氯乙酸，加水溶解，定容至1000ml。
显色剂A：称取40.06g苯酚和0.15g硝普钠，加水溶解，定容到1000ml。4℃避光保存。
显色剂B：称取49.94gKOH，加水溶解，定容到1000ml，4℃保存。
显色剂C：称取200.04g无水碳酸钾，和8.33ml次氯酸钠(食品级)，加水定容至1000ml，现用现配。
标准氨溶液
实验步骤：
1)氨的标准曲线的测定
称取0.314g氯化铵，加水溶解，定容至1000ml。然后分别取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1ml，加入到试管中，加水至10ml，使每支试管中的终浓度分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10微克/ml.
取0.18ml氯化铵溶液，加0.72ml水，混匀，然后依次加入0.9mlA液，混匀，加0.45ml显色剂B，混匀，再加0.9mlC，混匀，37℃温浴20min，流水冷却，以水为参比(即将0.18ml的氯化铵溶液换成水)，630nm测OD值。
2)蛋白质谷氨酰胺酶酶活的测定
底物溶液：10mM的Cbz-Gln-Gly
称取0.337g的Cbz-Gln-Gly，用0.176mol/L，pH6.5的磷酸缓冲液溶解，定溶至100ml。
样品溶液：待测溶液
取0.1ml的样品溶液加入到试管中，37℃温浴1min；然后向其中加入已在37℃预热10min的底物溶液1ml，37℃温浴反应60min。然后加入1ml的三氯乙酸溶液，混合均匀，终止反应。进而测定氨的含量。即取0.18ml的反应溶液，加0.72ml水，混匀，然后依次加入0.9mlA液，混匀，加0.45ml显色剂B，混匀，再加0.9mlC，混匀，37℃温浴20min，流水冷却，A630测OD值。对照组为0.1ml的样品溶液，加入1ml的三氯乙酸溶液，混匀，37℃温浴60min，再加入1ml的底物溶液，混合均匀。
实施例8MTG，PG和明胶对凝血作用
本实施例的实验材料：A型猪明胶(Sigma公司)，EDTA(sigma公司)，微生物谷氨酰胺转氨酶MTG(泰兴市东圣食品科技有限公司，食品级型号TG-I)，经纯化后其纯度为95％以上，磷酸氢二钠十二水合物和磷酸二氢钠二水合物(sigma公司)，蛋白质谷氨酰胺酶(Amano或Sigma公司)。本实施例用的蛋白质谷氨酰胺酶PG为Aamano的protein-glutaminase“Amano”50，经纯化后其纯度为95％以上。
实验步骤：将明胶按不同浓度溶于2ml50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液中，37℃水浴，然后将分别加入100U/ml的MTG溶液200μl，再加入50U/ml的PG溶液100μl，充分混合后，1分钟和20分钟后观察交联情况。
实验结果如表1、图5(A，B)所示。
表1
MTG添加量(μL) 200 200 200 200 200 200
PG添加量(μL) 100 100 100 100 100 100
明胶添加量(mg/ml) 0 20 40 60 80 100
1min后 不凝结 不凝结 不凝结 不凝结 凝结 凝结
20min后 不凝结 不凝结 不凝结 微量凝结 凝结 凝结
表1说明当MTG和PG的添加量固定时，明胶的浓度越高越容易凝结。
图5中，图5(A)为1min后检测各试管中明胶的凝结情况，可见1min后1～3试管仍为流体，4～5试管凝结；图5(B)为20min后检测各试管中明胶的凝结情况，可见20min后1～2试管仍为流体，3试管开始凝结，但凝结不完全，4～5试管凝结。
根据以上结果，选择60mg/ml的明胶浓度做MTG和明胶共同对凝血的作用，实验结果如下表2所示。
表2MTG，PG和明胶各自以及共同对凝血的作用的影响
血液添加量(加抗凝血剂)(ml) 2 2 2 2 0
MTG添加量(μL) 200 0 200 200 200
明胶添加量(mg/ml) 0 60 60 60 60
PG添加量(μL) 100 100 100 0 100
磷酸盐缓冲液 0 0 0 0 2
1min后 不凝结 不凝结 凝结 不凝结 不凝结
2min后 不凝结 不凝结 凝结 凝结 不凝结
如表2和图6所示，图6中试管1血液加MTG，试管2液加明胶，试管3血液加明胶和MTG，试管4明胶和MTG，试管1～3表明只有MTG和明胶共同作用才可将血液凝固，各自单独无法将血液凝结，试管3和试管4表明MTG不仅交联明胶，也可交联血液中的纤维蛋白原或其他蛋白来促使血液凝固。同时PG可以促进羟化明胶的溶解速度，同时协调MTG对明胶的凝胶速度。
实施例9温度对凝胶时间的影响
同时参照实施例8的方法，将明胶溶于2ml50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液中，明胶浓度为60mg/ml，然后将分别加入100U/ml的MTG溶液200μl，再加入50U/ml的PG溶液100μl在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃水浴溶解各组份，接着充分混合此混合物，管中的混合物每10s经受倒置，且凝胶时间定义为组合物停止流动的时间。实验结果如表3所示。
表3温度对凝胶时间的影响
温度(℃) 25 30 35 40 45 50
凝胶时间(s) 100 90 70 70 90 120s
表3说明，在25℃至35℃，随着温度增加，凝结时间逐渐减少。相反，在40℃至50℃，随着温度增加，凝结时间逐渐增加。虽然低温对MTG的影响较小但是PG的作用不能完全发挥导致随着温度的增加交联时间增加，同时随着温度增加MTG和PG都会因高温导致酶大活致使凝结时间增加。
实施例10本发明低温MTG与现有技术中的普通MTG比较
普通MTG为东圣食品科技有限公司的食品级型号TG-I经实施例3纯化方法获得的酶。本发明明胶组合物中的低温MTG为上述实施例2纯化得到的酶。
制备反应液：盐酸羟胺3.475g，还原型谷胱甘肽1.536g底物(cbz-glu-gly)5.060g，加400ml蒸馏水，磁力搅拌器搅拌20min，再加入12.110g Tris，搅拌，调节PH至6.0，500ml容量瓶定容，最后过滤。
制备终止液：先配0.1mol盐酸(2ml12mol/L的盐酸溶于240ml的蒸馏水)，加12g氯化铁，配成5％的三氯化铁溶液(w/v)，过滤，取200ml3mol/L盐酸(50ml盐酸溶于140ml蒸馏水，用200ml容量瓶定容)12％的三氯乙酸(w/v)l∶1∶1的等体积比混溶。
酶活性比较
第一，四组试管前三个加2ml反应液(平行)，第四个加2ml终止液液，37℃保温5min；第二，三组试管前三个加2ml反应液液(平行)，第四个加2ml终止液液，4℃保温5min。第一，四组加0.2ml普通MTG；第二，三组加0.2ml低温MTG反应10min，加反应液的试管加2ml终止液终止反应，加终止液的试管加2ml反应液作为对照，525nm测OD值。
实验结果如下：
反应温度(℃) 4 37 50 80
普通MTG酶活(U/ml) 0.5 10 12 0
低温MTG酶活(U/ml) 7.6 10 8.3 1
实验结果表明：本发明明胶组合物中的MTG和普通MTG在37℃下能达到相同的酶活。但是，在4℃时，本发明明胶组合物中的低温MTG的酶活能发挥至37℃时酶活的75％，但是普通MTG的酶活却达不到37℃时酶活的5％。
实施例11不同羟化程度的明胶对本发明组合物的稳定性影响
配置0.05M的PBS缓冲液中的不同羟化程度的25％(w/w)明胶，0.05M的PBS缓冲液中的MTG溶液，酶活为100U/ml，0.05M的PBS缓冲液中的PG溶液，酶活为100U/ml。
将终体积为10ml的25％(w/w)的不同羟化程度的明胶先与100U/ml的PG按10∶1(v/v)混合后，再加入3ml100U/ml的MTG溶液。
实验结果：
明胶羟化程度 交联凝胶的描述
无羟化 凝胶是脆的，无粘合性
10％-20％羟化 凝胶保持良好的粘合性，但是5min后变脆
30％-40％羟化 凝胶具有良好的粘合性和弹性，具有非常好的稳定性
50％-70％羟化 凝胶具有良好的粘合性，具有良好的稳定性，但是硬度太强
80％-100％羟化 凝胶具有良好的稳定性，但是融化点也相应提高，硬度太强，无弹性
结果表明：无羟化的明胶形成的凝胶形成无粘合性的高度柔性，不稳定的凝胶。高度羟化的明胶会因为硬度太强而无弹性。适当的明胶羟化，可以形成结实，稳定性更好的凝胶，这些凝胶可以在诸如手术缝合应用中在身体腔内原位交联。部分羟化可以提高组合物的稳定性，又不会因为羟化程度过高导致组合物的融化点过高，硬度太强，无弹性。
实施例12缓冲液的离子强度对交联时间的影响
配置0.01M的PBS缓冲液中的羟化程度40％的25％(w/w)明胶(A)，配置0.05M的PBS缓冲液中的羟化程度40％的25％(w/w)明胶(B)，配置0.5M的PBS缓冲液中的羟化程度40％的25％(w/w)明胶(C)，配置1M的PBS缓冲液中的羟化程度40％的25％(w/w)明胶(D)。0.05M的PBS缓冲液中的MTG溶液，酶活为100U/ml，0.05M的PBS缓冲液中的PG溶液，将终体积为10ml的25％(w/w)的不同羟化程度的明胶先与100U/ml的PG按10∶1(v/v)混合后，再加入3ml100U/ml的MTG溶液。
实验结果如下表所示，发现缓冲液的离子浓度升高到0.5M将减少交联时间，然而当离子浓度达到1M以后，并不形成凝胶，且高离子浓度的缓冲液形成的凝胶比低离子浓度形成的凝胶稳定性差。
Figure BDA00003170730600111
实施例13优化实验
优化实验以确定组成成分明胶、谷氨酰胺转氨酶、蛋白质谷氨酰胺酶的合适量。分别配置10％(w/w)，20％(w/w)，30％(w/w)，40％(w/w)，50％(w/w)明胶溶于50mM的PBS缓冲液，pH6.0；分别配置0U/ml，1U/ml，10U/ml，100U/ml，1000U/ml的MTG溶液；分别配置0U/ml，1U/ml，10U/ml，100U/ml，1000U/ml的PG溶液。进行正交实验。
实验结果：经由粘度计BROOKFIELD DV-II+Pro检测溶液并测定每种明胶，MTG和PG的最佳浓度。检测每种溶液在整个实验过程中达到扭矩达到20％和扭矩达到80％的时间。同时在2min时用TA-XT2i物性测定仪测定弹性和观察粘合性，确定某一条件后，再进一步缩小各组分范围，进行正交实验。
实验结果表明，最终优化结果为：明胶溶液浓度15％w/v到40％w/v范围内，优选地，明胶溶液浓度20％w/v到30％w/v范围内。微生物谷氨酰胺转氨酶在总组合物中的酶活性在约1U/g到180U/g范围内，优选在50U/g到100U/g范围内。蛋白质谷氨酰胺酶在总组合物中的酶活性在约1U/g到80U/g范围内，优选在10U/g到50U/g范围内。
实施例14本发明明胶组合物在外伤口止血的应用
将终体积为10ml的25％(w/w)的明胶先与100U/ml的PG按10∶1(v/v)混合后，再加入3ml100U/ml的MTG溶液，将这组合物作为实验组，同时将10ml的25％(w/w)的明胶只加入3ml100U/ml的MTG溶液的混合物作为对照组。将小鼠麻醉以后固定在鼠板上。将小鼠背部的毛剪掉，用解剖剪将小鼠皮肤剪开，分别加入实验组明胶组合物和对照组明胶混合物。
实验结果：使用本发明的明胶组合物比仅由明胶和MTG的组合在外伤止血过程中形成更好的具有粘性的，弹性强，结实的凝胶，使止血效果更佳。如图7A、图7B所示，两组虽然都能起到止血的作用，但是，如图7B所示，对照组的明胶在缝针的时候破碎，说明这种混合物脆弱，在缝针过程中会粉碎而大去作用。如图7A所示，实验组明显可以完整保存，一直封闭伤口，不让伤口出血。
实施例15本发明明胶组合物在肝脏伤口止血的应用
将终体积为10ml的25％(w/w)的明胶先与100U/ml的PG按10∶1(v/v)混合后，再加入3ml100U/ml的MTG溶液，将大鼠麻醉以后固定在鼠板上。将大鼠腹部的毛剪掉，用解剖剪将大鼠皮肤剪开，将肝脏剪一伤口，伤口流血后加入明胶组合物。5min后检测凝胶强度，然后缝好伤口，让大鼠缓慢复醒。
Figure BDA00003170730600121
实验结果：本发明的明胶组合物2min30s抑制大鼠肝脏手术93％出血量，可以迅速地达到止血效果。如图8所示，图8(A)表示手术前，图8(B)表示伤口切开后，自然流血10秒后施加本发明的明胶组合物，图8(C)表示施加本发明明胶组合物后2min30s的情况，图8(D)表示施加本发明明胶组合物后5分钟的情况，图8(E)表示用手动方式检验本发明明胶组合物的粘合性。
伤口在加入组合物后在2min30s后会迅速止血，如图8(C)所示，粘合性非常强，将伤口粘合，流血停止。5min后，如图8(D)所示，用镊子检测到基于明胶的组合物粘结强度完全可以止住伤口，不会让伤口再次出血。如果MTG溶液储藏在4℃，拿出后即进行实验，伤后在加入组合物后在3min后也会止血，将伤口粘合，流血停止。
实施例16蛋白质谷氨酰胺酶对MTG-明胶凝胶弹性的影响
将终体积为10ml的25％(w/w)的明胶先与0，30U/ml，60U/ml，80U/ml，100U/ml，120U/ml的PG按10∶1(v/v)混合后，再加入3ml100U/ml的MTG溶液，37℃水浴10min后，用英国Stable Micro system公司生产的T A-XT2i物性测定仪，依照英国国际蛋白凝胶强度测定方法进行检测。由电脑控制探头下压到一定深度来测定其凝胶强度及其它参数。P/36不锈钢探头，各参数设定如下：测前速度2.0mm/s；测中速度10.0mm/s；测后速度10.0mm/s；压缩比为40％，测试在室温下完成。每个处理做三个平行样。硬度：第1次冲压样品时的最大力为硬度。弹性：指产品在第1次冲压过程中变形后所能恢复到变形前状态的程度。弹性的度量有多种方法，最具代表性的是第2次冲压的高度同第1次冲压的高度的商。
测试结果表明，微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白谷氨酰胺酶两种酶制剂共同对羟化明胶进行改性修饰，使其结构更加稳定，功能性更强，增强交联后明胶组合物的弹性和硬度。如图9表明：随着蛋白质谷氨酰胺酶添加量增加可以增加MTG-明胶凝胶弹性和硬度，超过100U/ml以后虽然硬度继续增加，但是弹性会相应减小。
Figure IDA00003170731400011
Figure IDA00003170731400021
Figure IDA00003170731400041

Claims (9)

1.一种明胶组合物，其特征在于，所述明胶组合物包括羟化明胶、微生物谷氨酰胺转氨酶和蛋白质谷氨酰胺酶；其中，所述羟化明胶为20％～60％脯氨酸羟化的明胶。
2.如权利要求1所述的明胶组合物，其特征在于，在温度4℃～10℃条件下，所述明胶组合物中的微生物谷氨酰胺转氨酶对羟化明胶进行改性修饰，形成高粘合强度弹性凝胶。
3.如权利要求1所述的明胶组合物，其特征在于，所述微生物谷氨酰胺转氨酶的电泳纯度为90％以上，比活性大于25U/mg。
4.如权利要求1所述的明胶组合物，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶的电泳纯度为90％以上，比活性大于10U/mg。
5.一种明胶组合物的制备方法，其特征在于，将微生物谷氨酰胺转氨酶、蛋白质谷氨酰胺酶分别溶于磷酸盐缓冲液中，形成微生物谷氨酰胺转氨酶溶液、蛋白谷氨酰胺酶溶液；将羟化明胶溶于磷酸盐缓冲液中，形成羟化明胶溶液；将所述羟化明胶溶液与蛋白谷氨酰胺酶溶液混合，然后再加入微生物谷氨酰胺转氨酶溶液，制备得到如权利要求1所述的明胶组合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述羟化明胶溶液浓度为15％w/v～40％w/v范围内；所述微生物谷氨酰胺转氨酶浓度在所述组合物中为1U/g～180U/g范围内；所述蛋白质谷氨酰胺酶浓度在所述组合物中为1U/g～80U/g范围内。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述羟化明胶溶液、蛋白质谷氨酰胺酶溶液与微生物谷氨酰胺转氨酶溶液的体积比为10∶1～2∶4。
8.一种明胶组合物作为止血剂的应用，其特征在于，所述明胶组合物如权利要求1所述。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述明胶组合物可用于4℃～10℃低温下止血。
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