CN102727929A - 一种止血剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种止血剂，包括明胶、微生物谷氨酰胺转胺酶酶原以及所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的激活剂；所述明胶、微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和激活剂的比例为100000:1~200:1~100。本发明还公开了该止血剂的制备方法及应用。本发明止血剂具有更好稳定性和止血效果，其安全性和可靠性增强。
Description
技术领域
本发明涉及一种止血材料相关技术领域，具体涉及一种止血剂及其制备方法和应用。
背景技术
现有技术中明胶已经被广泛用于止血，如强生医疗器材有限公司的Surgiflo?流体明胶，壳聚糖明胶（中国专利申请号：200310121182.X），改性明胶（中国专利申请号：200910244834.6）以及其它用于止血的明胶，如中国专利02121201.5，98117763.8，03126852.8，02104346.9，01142070.7等；美国专利6,652,840，,413,713，6,238,688，6,194,138 5,645,849，4,596,788，4,539,204等。明胶具有止血效果，可以用于外伤或者手术止血。
微生物谷氨酰胺转胺酶（microbial transglutaminase，缩写MTG）与凝血因子FACTOR XIII属于同一个家族的酶，很多研究表明了其在凝血反应中的作用。利用MTG可以交联明胶，形成良好的多空物或者网状物，例如，它可以交联I型胶原蛋白形成抗高温的胶（Nomura Y, Toki S, Ishii Y, Shirai K. Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Apr;65(4):982-5）；MTG与明胶作用形成的胶不会受热溶解（Chen T, Embree HD, Brown EM, Taylor MM, Payne GF.，Biomaterials. 2003 Aug;24(17):2831-41，美国专利：5,834,232）并可用于细胞固定（Chen T, Small DA, McDermott MK, Bentley WE, Payne GF.，Biomacromolecules. 2003 Nov-Dec;4(6):1558-63），生物支架（Broderick EP, O'Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Jan 15;72(1):37-42.；Chen RN, Ho HO, Sheu MT. Biomaterials. 2005 Jul;26(20):4229-35）。用MTG增强明胶的交联，以提高其强度和黏性，用于制作止血材料、止血敷料或止血用密封材料（McDermott MK, Chen T, Williams CM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug;5(4):1270-9；中国专利：200980131973.6和200780051215.4；美国专利：8,133,484；欧洲专利：WO2012017415、WO2011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341及CN102124058）。现有技术所采用的MTG是指将谷氨酰胺酶原（pro-MTG）切除前肽后所获得的成熟的酶。在通常保存条件下MTG较易失活而不稳定，对温度比较敏感，不稳定，且必须在较高纯度条件下才能发挥交联作用。
MTG是成熟的酶，是谷氨酰胺酶原（pro-MTG）被切除前肽后所获得的（Ralf PASTERNACK, Simone DORSCH, Jens T. OTTERBACH, Isabella R. ROBENEK, Sabine WOLF and Hans-Lothar FUCHSBAUER，Eur. J. Biochem. 257, 5702576 (1998)）。在生物体内发生，能将酶原切割出活性MTG分子的蛋白酶有Streptomyces albogriseolus来源的SAM-P20、SAM-P26、SAMP45和SAP以及Streptomyces mobaraensis来源的内源性TG激活酶TAP和Streptomyces hygroscopicus中的丝氨酸蛋白酶等（Taguchi S, Arakawa K, Yokoyama K, et al. J Biosci Bioeng, 2002,94(5):478-81. Zhang D, Wang M, Wu J, et al. J Agric Food Chem, 2008,56(21):10261-4.）。但上述反应不能被用于成熟MTG的工业应用。
由于纤维蛋白和胶原蛋白的完整性是实现人体正常凝血功能的必要因素之一，而激活剂，如分散酶（dispase），不仅会切割微生物谷氨酰胺转胺酶酶原，还会切割纤维蛋白和胶原蛋白（Stenn KS, Link R, Moellmann G, et al. J Invest Dermatol,1989,93(2):287-90.），因此，在止血类产品中通常不使用分散酶等激活剂，以防其对上述酶原及蛋白的切割作用。
此外，热处理的微生物谷氨酰胺转胺酶原（pro-MTG）可以有效抑制MTG的活性（Christa Pfleiderer, Martina Mainusch, Johannes Weber，Microbiological Research 160 (2005) 265—271），因此，如果反应过程中是需要利用成熟MTG活性的，通常要求先严格去除pro-MTG，以避免pro-MTG对MTG活性的抑制。
发明内容
本发明克服现有技术以上缺陷，提供了一种止血剂，可用于各类伤口止血、手术止血，创新提出了将激活剂用于止血剂的技术方案，不仅避免了激活剂分解所述酶原及蛋白的副作用，还显著增强了止血效果。
本发明提出了一种止血剂，包括明胶、微生物谷氨酰胺转胺酶酶原、以及所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的激活剂。
其中，所述明胶、所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和所述激活剂的比例为100000: 1~200: 1~100。
其中，所述明胶的强度不低于300布鲁姆。
其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的纯度不低于80%。优选地，其纯度不低于99%。
其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原在被完全激活时的最小比酶活不低于20U/mg。
其中，所述激活剂是分散酶(dispase)。
本发明中，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原是微生物来源的，分子量大约为42kDa，包含376个氨基酸残基，其序列为GenBank CAA77128.1。优选地是由茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）发酵产生的。本发明中，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原没有酶活性的，其所含有的前肽未被切割，不能催化蛋白质交联。在常温条件下，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原比MTG更加稳定，不容易受热变性或被酶解。本发明不需要分离去除微生物谷氨酰胺转胺酶原（pro-MTG），仍可利用成熟MTG的活性，实现显著良好的止血效果，其止血机制明显不同于现有技术。
本发明中，激活剂是指可以激活酶原产生成熟MTG或者使酶原具有催化蛋白质发生谷氨酰胺转胺基反应从而导致蛋白质交联的任何蛋白酶。本发明中，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的激活剂是一类蛋白水解酶，可以水解纤维连接蛋白、IV胶原蛋白等，特异性较好，对某些胶原蛋白的水解能力较差；在一定条件下可以催化微生物谷氨酰胺转胺酶酶原（pro-MTG）分解释放出成熟的具有催化活性的MTG。本发明中，激活剂可以是各种能活化pro-MTG的各种蛋白酶，如TAP、SAP、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、SAM-P20、SAM-P26、SAMP45、丝氨酸蛋白酶等，这类蛋白酶在一定浓度时不会水解明胶或仅有轻微水解明胶。这类蛋白酶对人体没有明显的免疫刺激。
本发明首次创造性地提出利用不具有酶活性的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原，并在其中加入适量激活酶，例如，在酶原中加入0.25-1倍酶原质量的激活酶，无需分离纯化即可进一步催化明胶形成交联从而实现止血目的。在本发明的条件下，pro-MTG不仅可以在被激活后进一步催化明胶蛋白交联，而且不会抑制MTG活性。本发明内容至目前为止尚未见有任何文献报道。本发明较现有技术具有更好稳定性和止血效果，有利于保存和维持活性，增加安全性和可靠性。
本发明还提出了一种止血剂的制备方法，包括步骤：将所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原及所述激活剂溶解于生理盐水中，形成混合液；然后，将所述明胶粉末加入前述混合液中，混合后得到所述止血剂；其中，所述生理盐水的体积（ml）为所述明胶粉末重量（g）的1-4倍。本发明将微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和激活剂与明胶分别包装，例如，置于不同的无菌针管中，在使用时将其混合溶于水后立刻使用。
本发明还提出了一种止血剂的应用，用于伤口止血、手术止血。本发明止血剂的各组成成分可以被人体部分或者完全被吸收，且几乎不会引起炎症反应，可广泛应用于各类伤口止血或手术止血。本发明止血剂可以注射、涂抹或其他方式使用。本发明止血剂具有良好的止血效果，其止血效果显著优于单一成分的明胶以及明胶与谷氨酰胺转胺酶的组合物。
附图说明
图1 表明在不同发酵时间微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的表达量。
图2表明微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的纯化电泳图。
图3 表明微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和微生物谷氨酰胺转胺酶在不同温度下作用1个小时后的相对酶活。
图4 表明微生物谷氨酰胺转胺酶酶原经不同用量的分散酶处理30分钟后的酶活。
图5 表明本发明止血剂（明胶、微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和分散酶混合物）比相同用量的明胶和微生物谷氨酰胺转胺酶的凝血效果比较。
图6 表明不同纯度的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原在被分散酶切割不同时间后的比酶活（U/mg）。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明。以下实施本发明的过程及方法，包括统计或计算方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵
本实施例中谷氨酰胺转胺酶酶原的生产菌株为茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis）。本发明中，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原还可以来源于枯草杆菌、链霉菌、谷氨酸棒杆菌等发酵产生。
斜面培养基（g/L）：淀粉 20，KNO3 1，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂 20。发酵培养基（g/L）：甘油20，酵母膏 6，蛋白胨 25，MgSO4·7H2O 2，K2HPO4·3H2O 2 10。
首先将菌落接种到斜面培养基上，培养7天。收集所有微生物，接种到发酵培养基中，分别在8，12，16，20，24小时处取样，用电泳方法测定pro-MTG的表达量。
对产酶菌株发酵8，12，16，20，24小时后电泳，用灰度扫描方法进行测定相对含量，再根据上样蛋白总量计算产酶的量，以时间为变量作图，得到各不同取样点谷氨酰胺转胺酶酶原的表达量情况，实验结果如图1所示，在发酵16小时时，微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的表达已经达到了最高值。
实施例2 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的分离纯化
将上述实施例1中发酵20小时的发酵液离心去除菌体。收集上清，加入2倍体积的无水乙醇，搅拌30分钟。离心收集沉淀。利用离子交换柱进行蛋白分离纯化。填料为DEAE-825，平衡液为0.05M的tris缓冲液，pH7.4。流动相为pH6.0的 0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液。收集各个组分，电泳检测，得到纯度较好的pro-MTG蛋白。将该组分脱盐后冻干保藏。如图2电泳结果显示，在离子交换后收集目标组分，电泳检测目标蛋白纯化后的纯度在99%以上。
将上述实验条件下获得的蛋白质用高效液相-质谱分析，检测结果表明，pro-MTG的纯度大于80%，最高纯度可以达99%。
实施例3 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原与谷氨酰胺转胺酶的稳定性比较
将pro-MTG和MTG分别在不同温度下放置处理1个小时，其中，酶原pro-MTG用分散酶处理，MTG直接加缓冲液处理。然后调节到37℃，分别加入等体积含50%（w/w）lipase或不含lipase的无菌水，30分钟后，测定MTG的酶活，分别比较不同处理点与最初酶活，计算相对的残余酶活。与未处理前的酶活进行比较，1.0代表酶活100%，即没有酶活损失。
实验结果如图3所示，在70摄氏度下作用1小时后pro-MTG的酶活仅有轻微下降，而MTG的酶活已经减少了50%。在90摄氏度下作用1小时后pro-MTG仍然保留了约75%的酶活，而此时MTG的酶活只剩20%左右。可见，与MTG相比较，在37度以上高温条件下，本发明在激活剂作用下的pro-MTG体现出显著良好的热学稳定性。
实施例4 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的激活
在含有0.1mg/mLpro-MTG的100μl微生物谷氨酰胺转胺酶酶原溶液中加入10μl含有5μg、2.5μg、1μg和0μg分散酶溶液，37℃下作用30分钟，然后测定反应后酶混合液的MTG活性。如图4所示，在未加入分散酶溶液时，pro-MTG没有表现出酶活性。但在加入1μg分散酶溶液后，pro-MTG立即被激活且表现出很高活性。实验结果还表明，本发明中即使有少量pro-MTG酶残余也不会完全抑制MTG活性。而现有技术中由于pro-MTG的存在会抑制MTG活性，因此现有技术对MTG纯度要求严格。
实施例5 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原与激活剂混合物用量对明胶的交联
制备明胶溶液：将含有20%低熔点明胶的溶液加热至60℃并磁力搅拌器搅拌，然后将溶液冷却至37℃保温过夜备用。
制备微生物谷氨酰胺转胺酶酶原与激活剂的混合物：将谷氨酰胺转胺酶酶原按照5mg/mL浓度溶解于水中，往该溶液中加入分散酶至浓度为1mg/mL形成混合物。然后，按照下述用量将该混合物加入至明胶溶液中：在50mL明胶溶液中分别加入1mL，0.5mL，0.1mL，0.01mL上述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原与激活剂的混合物，对得到的终溶液测定粘度。
粘度测定：在每次粘度计测试中，将上述加入混合物的明胶溶液置于烧杯中，追踪混合的明胶-微生物谷氨酰胺转胺酶酶原-激活剂溶液经历胶凝时的粘度。通过记录每个测试组达到最大粘度的30%和90%所需时间来比较不同的测试组。最大粘度是指能够在比速下且具有用于那个测试的特定转子的粘度计记录。
本实验采用具有T-E“t-bar”转子的DV II +PRO数字粘度计（Brolkfield公司），转子最大可记录粘度是10×106cP，因此，最大粘度的30%和90%点分别为3×106cP 和9×106cP，是指凝胶溶液粘度到达3×106cP 和9×106cP所需的时间。整个反应过程测试溶液都浸没在37摄氏度水浴中。大于10分钟的点则不再测量（-表示）。
表1可见，加入酶原-激活剂混合物过高时凝胶所需要的时间反而较长，可能是由于分散酶对明胶的水解对明胶凝聚产生干扰。如表1所示，本实施例表明最佳浓度为每g明胶中添加谷氨酰胺转胺酶酶原0.25mg、0.05mg分散酶。表明本发明适当量的分散酶不仅不会影响明胶的交联，而且促进明胶交联并增强止血效果，见实施例6。本发明突破了现有技术所认为的因分散酶能切割明胶因此不能将其与明胶联合用于制备大分子交联明胶的局限。
表1 不同酶原-激活剂混合物添加量对凝胶时间的影响
| 组别 | 酶原-激活剂混合物添加量 | 30%点时间 | 90%点时间 |
| 1 | 1mL | 204秒 | 599秒 |
| 2 | 0.5mL | 140秒 | 231秒 |
| 3 | 0.1mL | 311秒 | 579秒 |
| 4 | 0.05mL | 512秒 | - |
| 5 | 0.01mL | - | - |
实施例6 止血剂的使用
本实验中，明胶可以是市售的医用明胶或者是其他可以被允许的明胶。例如中国专利CN200780051215.4中制备的明胶。明胶可提取来源于鱼类、哺乳动物等。选用的明胶强度不低于300布鲁姆。明胶强度过低可能导致血压过高时破坏止血剂的止血效果。将明胶冻干置于10mL无菌医用注射器中，每管装1g。
将按实施例2制备获得的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原冻干，与分散酶干粉按照4：1比例混合，置于另一支 10mL无菌医用注射器中，每管装0.25mg混合物。该谷氨酰胺转胺酶酶原冻干粉与分散酶干粉的比例也可以是400:1。微生物谷氨酰胺转胺酶酶原纯度为80%，优选地，还可以是99%。
使用时，先用装有0.25mg谷氨酰胺转胺酶酶原与分散酶混合物的注射器吸5mL生理盐水，然后用连接管与另一支装有1g明胶的注射器连接。来回推动注射器5或15次使其充分混匀。取下空注射器和连接管，接上注射导管，将充分混匀后的止血剂直接涂抹于流血伤口处，用纱布按压2-5分钟。使用时，各组分明胶、谷氨酰胺转胺酶酶原和分散酶均需要用生理盐水混匀。优选地，生理盐水体积（mL）为明胶重量（g）的2倍；还可以是生理盐水体积（mL）为明胶重量（g）4倍或10倍。一般地，当组分明胶、谷氨酰胺转胺酶酶原和分散酶之间的比例关系放大时，所用生理盐水也按同样比例放大。
将混合制备得到的本发明止血剂（含有明胶、谷氨酰胺转胺酶酶原和分散酶，其比例为16：4：1）均匀涂于出血部位，作为样品组。以同样方法制备不加谷氨酰胺转胺酶酶原和分散酶的明胶溶液，作为对照组。
取两组大鼠，分别为样品组和对照组，每组各3个大鼠。经麻醉后绑定，分别在左腿动脉处用手术刀割一个深度一致，约1cm长的伤口。待流血5分钟后，用医用棉花擦净血块。将样品组大鼠伤口处均匀注射1mL本发明止血剂并用纱布按压2分钟；将对照组大鼠伤口处均匀注射未加酶原及分散酶的明胶溶液并用纱布按压2分钟。经2个小时后对比观察，样品组各大鼠的伤口已经止住血并开始结痂；而对照组各大鼠伤口均仍有渗血。实验结果表明本发明止血剂具有良好止血效果。
实施例7 止血剂的安全性评价
用皮下多点注射办法，将本发明止血剂（含有25%明胶、10%酶原、10%激活剂）0.5mL注射到6个6周龄的Balb/c小鼠背部皮下，为样品组。将等量0.5mL明胶溶液注射到小鼠，作为对照组。24小时后处死小鼠，取血，用流式细胞仪测定淋巴细胞的数量。T检验显示两组小鼠没有显著性差异，实验结果如表2，表明与对照组相比较，本发明止血剂不会引起小鼠的免疫反应。
表2 小鼠血液中淋巴细胞的比率
| 对照组 | 样品组 | |
| 淋巴细胞 | 41.12%±0.52% | 41.08%±0.4% |
实施例8 止血剂效果比较
将按照实施例6制备的含有1g明胶、0.2g微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和0.05g分散酶的混合物5mL作为试验组，用相同方法制备的含有1g明胶、0.2g微生物谷氨酰胺转胺酶的混合物5mL作为对照组，按照实施例6的方法用于小鼠止血实验。按压处理伤口5分钟后去掉表面的混合物，实验组已经止住流血，而对照组仍然有血流出。该结果证明，本发明的止血剂止血效果优于明胶与微生物谷氨酰胺转胺酶的组合。
为进一步研究本发明止血机理，将含有0.2g微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和0.05g分散酶的1mL作为试验组，将含有0.2g微生物谷氨酰胺转胺酶1mL作为对照组，用1mL生理盐水作为空白组，室温放置30分钟后分别加入至新鲜取得的10mL家兔血液中，室温放置20秒，如图5所示，试验组的血已经凝固较完全，而对照组的血液尚未完全凝固。可见，本发明的止血效果是显著优于对照组的止血效果，本发明中的分散酶和pro-MTG本身以及两者协同促进血液凝固。
实施例9 不同组分配比的止血剂及其止血作用
根据实施例6的方法，按如下组分配比制备混合物止血剂：
| 序号 | 明胶（g） | 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原（mg） | 分散酶（mg） | 生理盐水（mL） |
| 1 | 50 | 0.5 | 0.5 | 250 |
| 2 | 50 | 100 | 50 | 250 |
| 3 | 50 | 50 | 0.5 | 250 |
| 4 | 50 | 50 | 10 | 500 |
| 5 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 |
| 6 | 01 | 0.1 | 0.1 | 1 |
| 7 | 1 | 1 | 0.5 | 10 |
| 8 | 1 | 1 | 0.5 | 5 |
| 9 | 5 | 10 | 5 | 13 |
| 10 | 5 | 5 | 5 | 20 |
将1~10组止血剂混合物用于动物（大鼠）的止血实验，结果显示，与单独的明胶溶液相比较，上述1~10组止血剂的止血效果更优，均在2分钟之内止住出血，而使用明胶溶液的则需要超过10分钟止血。
实施例10 微生物谷氨酰胺转胺酶酶原与分散酶作用后比酶活的测定
将纯度分别为80%、90%、99%，浓度为1mg/mL的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原溶液中分别加入10微升含有10mg/mL分散酶的溶液；37摄氏度作用30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟和30分钟，测定谷氨酰胺转胺酶的总酶活，计算比活力。比活力的计算方法为：比酶活（U/mg）=蛋白质的总酶活（U）/蛋白质质量（mg）。结果如图6所示。图中显示，在切割完全后，各微生物谷氨酰胺转胺酶酶原比酶活均大于20U/mg。
上述具体实施方案对本发明作详细描述，但本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不偏离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种止血剂，其特征在于，包括明胶、微生物谷氨酰胺转胺酶酶原、以及所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的激活剂。
2.如权利要求1所述的止血剂，其特征在于，所述明胶、所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原和所述激活剂的比例为 100000: 1~200: 1~100。
3.如权利要求1所述的止血剂，其特征在于，所述明胶的强度不低于300布鲁姆。
4.如权利要求1所述的止血剂，其特征在于，所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的纯度不低于80%。
5.如权利要求1所述的止血剂，其特征在于，所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原在被完全激活时的最小比酶活不低于20U/mg。
6.如权利要求1所述的止血剂，其特征在于，所述激活剂是分散酶。
7.如权利要求1所述止血剂的制备方法，其特征在于，将所述微生物谷氨酰胺转胺酶酶原及所述激活剂溶解于生理盐水中，形成混合液；然后，将所述明胶粉末加入前述混合液中，混合后得到所述止血剂；其中，所述生理盐水的体积为所述明胶重量的1-4倍。
8.如权利要求1所述止血剂的应用，其特征在于，其用于伤口止血。
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| Publication number | Publication date |
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