CN116829701A - 耐热性蛋白质谷氨酰胺酶 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种耐热性提高的蛋白质谷氨酰胺酶。包含以下的(1)～(3)中任一项所示的多肽的蛋白质谷氨酰胺酶的耐热性提高：(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成，且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及(3)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐热性蛋白质谷氨酰胺酶。更具体而言，本发明涉及耐热性蛋白质谷氨酰胺酶、编码该耐热性蛋白质谷氨酰胺酶的DNA、重组载体、转化体、酶制剂、该耐热性蛋白质谷氨酰胺酶的制造方法、以及该耐热性蛋白质谷氨酰胺酶的用途。
背景技术
蛋白质谷氨酰胺酶是对蛋白质中的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的γ-酰胺基和β-酰胺基进行脱酰胺的酶，具体而言，已知有来自粘金黄杆菌(Chryseobacterium gleum)JCM2410株的蛋白质谷氨酰胺酶以及来自解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(专利文献1)。
如果利用蛋白质谷氨酰胺酶处理蛋白质，则产生羧基，因此认为带来蛋白质的负电荷增加引起的蛋白质的可溶性和水分散性的增大、以及使蛋白质的高级结构变化引起的蛋白质的乳化能力和乳化稳定性等的提高。
因此，蛋白质谷氨酰胺酶被用于对各种蛋白质的功能特性进行改性的技术。例如，在专利文献2中，公开了使蛋白质谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶作用于蛋白质而对蛋白质进行改性的方法，记载了在使用牛奶的酸奶的制造、使用小麦的豆腐的制造、使用小麦的面条的制造中，通过利用蛋白质谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶进行处理，提高了制造的食品的光滑性的情况。另外，在专利文献3中，公开了使用精氨酸或其盐和蛋白质谷氨酰胺酶的畜肉加工食品的制造方法，记载了在香肠、火腿、汉堡、干炸食品、炸猪排、叉烧等的制造中，通过利用精氨酸或其盐和蛋白质谷氨酰胺酶处理原料畜肉，得到的加工食品的口感提高。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/029685号
专利文献2：国际公开第2009/113628号
专利文献3：国际公开第2012/060409号
发明内容
发明所要解决的技术问题
蛋白质谷氨酰胺酶使蛋白质变性带来的效果被认为是在食品等的蛋白质原材料中产生各种优异的功能特性，认为蛋白质谷氨酰胺酶今后也能够广泛用于食品加工等。另一方面，迄今为止的蛋白质谷氨酰胺酶具有固有的热特性，因此蛋白质的处理中的温度条件根据蛋白质谷氨酰胺酶的热特性而必然受到限制。因此，为了将蛋白质谷氨酰胺酶扩大至更广泛的用途，期望进一步提高耐热性。
因此，本发明的目的在于提供一种耐热性提高的蛋白质谷氨酰胺酶。
用于解决技术问题的手段
本发明人通过从申请人拥有的非公知的菌株文库的筛选，发现具有提高了耐热性的蛋白质谷氨酰胺酶。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供以下揭示的方式的发明。
项1.一种蛋白质谷氨酰胺酶，其包含以下(1)～(3)中任一项所示的多肽：
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及
(3)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
项2.一种DNA，其编码项1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
项3.一种表达盒或重组载体，其包含项2所述的DNA。
项4.一种转化体，其通过项3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。
项5.根据项1所述的蛋白质谷氨酰胺酶的制造方法，其包含培养项4所述的转化体的工序。
项6.一种酶制剂，其包含项1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
项7.一种蛋白质改性剂，其包含项1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
项8.一种改性的蛋白质材料的制造方法，其包含使项1所述的蛋白质谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。
项9.根据项8所述的制造方法，其中，所述蛋白质材料为食用蛋白质材料。
发明效果
根据本发明，提供一种具有提高的耐热性的蛋白质谷氨酰胺酶。
附图说明
图1是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的纯化级分的SDS-PAGE图像。
图2是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的纯化级分的SDS-PAGE图像。
图3是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的温度稳定性试验结果。
图4是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适温度试验结果。
图5是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的pH稳定性试验结果。
图6是来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适pH试验结果。
具体实施方式
以下，对本发明详细进行说明。应予说明，在序列表以外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时用单字符缩写来表述。即，甘氨酸(Gly)为G，丙氨酸(Ala)为A，缬氨酸(Val)为V，亮氨酸(Leu)为L，异亮氨酸(Ile)为I，苯丙氨酸(Phe)为F，酪氨酸(Tyr)为Y，色氨酸(Trp)为W，丝氨酸(Ser)为S，苏氨酸(Thr)为T，半胱氨酸(Cys)为C，蛋氨酸(Met)为M，天冬氨酸(Asp)为D，谷氨酸(Glu)为E，天冬酰胺(Asn)为N，谷氨酰胺(Gln)为Q，赖氨酸(Lys)为K，精氨酸(Arg)为R，组氨酸(His)为H，脯氨酸(Pro)为P。
在本说明书中，表示的氨基酸序列的左端为N末端、右端为C末端。
在本说明书中，“非极性氨基酸”包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。“非电荷氨基酸”包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。“酸性氨基酸”包含天冬氨酸和谷氨酸。“碱性氨基酸”包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
在本说明书中，“替换”不仅包含人为导入氨基酸残基的替换的情况，还包含自然导入氨基酸残基的替换的情况，即，原本氨基酸残基不同的情况。在本说明书中，氨基酸残基的替换可以是人为替换，也可以是自然替换，优选为人为替换。
1.蛋白质谷氨酰胺酶
本发明的蛋白质谷氨酰胺酶包含以下(1)～(3)中任一项所示的多肽。
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽、
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽、以及
(3)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
上述(1)～(3)所示的多肽具有蛋白质谷氨酰胺酶活性且具有提高的耐热性。
上述(1)所示的多肽是源自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的蛋白质谷氨酰胺酶，上述(2)和(3)所示的多肽是上述(1)所示多肽的突变体。上述(1)～(3)的多肽不仅包含人为进行替换而得到的多肽，还包含原本具有这样的氨基酸序列的多肽。
在上述(2)的多肽中，导入的氨基酸的改变可以是包含仅从替换、添加、插入和缺失中的1种改变(例如仅替换)，也可以包含2种以上的改变(例如，替换和插入)。在上述(2)的多肽中，任意不同部位中的氨基酸的差异的数量只要为1个或多个即可，例如可举出1～80个，优选为1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、或1～30个，更优选为1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、或1～4个，进一步优选为1～3个，特别优选为1或2个或者1个。
另外，在上述(3)的多肽中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上即可，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上，特别优选为99％以上。
在此，在上述(3)的多肽中，相对于序列号1或2所示的各氨基酸序列的序列一致性是与序列号1或2所示的氨基酸序列进行比较而算出的序列一致性。另外，“序列一致性”表示通过BLASTPACKAGE[sgi32 bit edition，Version 2.0.12；available from NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(TatianaA.Tatsusova，Thomas L.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247-250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数只要设定为Gap insertion Cost value：11、Gapextension Cost value：1即可。
在上述(2)和(3)的多肽中，序列号1和2所示的氨基酸序列中的第176位(半胱氨酸)、第217位(组氨酸)和第237位(天冬氨酸)的氨基酸被认为是蛋白质谷氨酰胺酶活性催化残基，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。
在上述(2)和(3)的多肽中，在对序列号1或2导入氨基酸替换的情况下，作为导入的氨基酸替换的优选的一个方式，可举出保守性替换。即，作为上述(2)和(3)的多肽中的替换，例如可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其他的非极性氨基酸；如果替换前的氨基酸为非电荷性氨基酸，则替换为其他的非电荷性氨基酸；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其他的酸性氨基酸；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他的碱性氨基酸。
在上述(2)和(3)的多肽中，“显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性”是指，在测定耐热性，即65℃下的蛋白质谷氨酰胺酶相对活性的情况下，上述(1)的多肽与蛋白质谷氨酰胺酶活性相同，具体而言，在将上述(1)的多肽的蛋白质谷氨酰胺酶相对活性设为1的情况下，蛋白质谷氨酰胺酶相对活性显示为0.8～1.2左右。应予说明，65℃下的蛋白质谷氨酰胺酶相对活性是指将酶暴露于4℃或65℃的温度环境中10分钟，将暴露于4℃的温度条件下的酶的蛋白质谷氨酰胺酶活性设为100％时的、暴露于65℃的温度条件下的酶的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量(％)。
2.DNA
本发明的DNA是编码上述“1.蛋白质谷氨酰胺酶”中所述的蛋白质谷氨酰胺酶(以下，也记载为“上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶”)的DNA。本发明的DNA含有包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA。序列号3所示的碱基序列是编码包含上述序列号1所示的氨基酸序列的多肽的基因，序列号4所示的碱基序列是编码包含上述序列号2所示的氨基酸序列的多肽的基因。
本发明的DNA不限定于上述序列，具有与序列号3或4所示的碱基序列76％以上，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上、91％以上、92％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为99％以上的同源性的碱基序列的DNA，只要其编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽，就包含在本发明的DNA中。
在此，DNA的“同源性”使用具有将基准序列作为查询序列进行比较的算法的公开或市售的软件来计算。具体而言，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(GENETYX CORPORATION制造)等，将它们设定为默认参数使用即可。
另外，与上述氨基酸序列的替换、添加、插入或缺失对应，在序列号3或4中记载的碱基序列中，在多个碱基中发生了替换、附加、插入或缺失的突变的碱基序列，只要其编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽，就包含在本发明的DNA中。
此外，包含序列号3或4记载的碱基序列的DNA与包含互补的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交的DNA，只要其编码具有蛋白质谷氨酰胺酶活性的多肽，就包含在本发明的DNA中。
在此，严格条件是指，将固定有DNA的尼龙膜在包含6×SSC(1×SSC是将氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g溶解于1升的水中而得到的溶液)、1％SDS、100μg/mL鲑鱼精子DNA、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％ficoll的溶液(在本说明书中，“％”意指“w/v”)中在65℃下与探针一起保温20小时而进行杂交的条件。
关于杂交法的详细步骤，可以参照Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nded.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等。
以下，示出通过杂交得到本发明的DNA的方法的示例，但得到本发明的DNA的方法不限于以下方法。
首先，按照常规方法将从适当的基因源得到的DNA连接到质粒、噬菌体载体上，制作DNA文库。将该文库导入适当的宿主而得到的转化体在平板上培养，将生长的菌落或斑块转移到硝化纤维素或尼龙的膜上，在改性处理后将DNA固定在膜上。在包含预先利用32P等标记该膜的探针的上述组成的溶液中，在上述严格条件下保温，进行杂交。作为探针，可以使用编码序列号1或2记载的氨基酸序列的全部或一部分的多核苷酸。
杂交结束后，冲洗非特异性吸附的探针，通过放射自显影术等鉴定与探针形成杂交体的克隆。重复该操作直到杂交体形成克隆能够分离。最后，从得到的克隆中，选择编码具有目标酶活性的蛋白质的基因。基因的分离可以通过碱法等公知的多核苷酸提取法来实施。
本发明的DNA也可以从产生上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的微生物中分离。例如，可以以来自金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的基因组DNA为模板，通过使用从已知的氨基酸序列信息中考虑基因的简并而设计的引物或探针或基于已知的碱基序列信息而设计的引物或探针的PCR或杂交法，从上述微生物的基因组中分离目标DNA。
在本发明的DNA中，包含源自密码子的简并的多种DNA。人为制作编码相同氨基酸序列的多种DNA，可以使用公知的基因工程学方法容易地进行。例如，在基因工程学的蛋白质的生产中，在编码目标蛋白质的本来的基因上使用的密码子在宿主中使用频率低的情况下，有时蛋白质的表达量低。在这样的情况下，可以通过不改变编码的氨基酸序列并在宿主中将密码子利用频率最优化，实现目标蛋白质的高表达。
作为表示密码子利用频率的指标，可以选择各密码子的宿主最适密码子利用频率的总计。最适密码子可定义为对应于同一氨基酸的密码子中利用频率最高的密码子。密码子利用频率只要是在宿主中最适化的密码子就没有特别限定，例如，作为大肠杆菌的最适密码子的示例，可举出以下密码子。F：苯丙氨酸(ttt)、L：亮氨酸(ctg)、I：异亮氨酸(att)、M：蛋氨酸(atg)、V：缬氨酸(gtg)、Y：酪氨酸(tat)、终止密码子(taa)、H：组氨酸(cat)、Q：谷氨酰胺(cag)、N：天冬酰胺(aat)、K：赖氨酸(aaa)、D：天冬氨酸(gat)、E：谷氨酸(gaa)、S：丝氨酸(agc)、P：脯氨酸(ccg)、T：苏氨酸(acc)、A：丙氨酸(gcg)、C：半胱氨酸(tgc)、W：色氨酸(tgg)、R：精氨酸(cgc)、G：甘氨酸(ggc)。
作为在基因中导入突变并人为改变氨基酸序列的方法，可以使用Kunkel法、Gapped duplex法等公知的方法、以及利用了位点特异性突变诱发法的突变导入试剂盒，例如QuikChangeTM定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)(Stratagene公司)、GeneArtTM定点突变PLUS系统(Invitrogen公司)、TaKaRa定点突变系统(Mutan-K，Mutan-Super Express Km、PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit等：Takara Bio公司)等。
DNA的碱基序列的确定可以通过利用惯用的方法进行序列确定来进行。例如，可以通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463)等进行。另外，可以利用适当的DNA测序仪来分析序列。
对于得到的DNA是否是编码目标蛋白质谷氨酰胺酶的DNA的确认，可以将确定的碱基序列与序列号3或4记载的碱基序列进行比较来进行。或者，可以将由确定的碱基序列推定的氨基酸序列与序列号1或2记载的氨基酸序列进行比较来进行。
3.表达盒或重组载体
包含编码上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的DNA的表达盒或重组载体(以下也表述为“本发明的表达盒”或“本发明的重组载体”)可以通过在本发明的DNA上连接启动子和终止子，或者，通过在表达载体中插入本发明的表达盒或本发明的DNA而得到。
在本发明的表达盒或本发明的重组载体中，作为控制因子，除了启动子和终止子以外，还可以根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。这些控制因子只要可工作地连接于本发明的DNA即可。可工作地连接是指，调节本发明的DNA的各种控制因子和本发明的DNA以能够在宿主细胞中工作的状态连接。
关于本发明的重组载体，作为表达载体，优选由在宿主内能够自主增殖的噬菌体、质粒、或病毒构建的用于基因重组的表达载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为能够在商业上获得的表达载体，可举出pQE系载体(QIAGEN株式会社)、pDR540、pRIT2T(GEHealthcare Bio-Science株式会社)、pET系载体(Merck株式会社)等。表达载体只要选择使用与宿主细胞的适当组合即可，例如，在将大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可举出pET系载体与DH5α大肠菌株的组合、pET系载体与BL21(DE3)大肠菌株的组合、或pDR540载体与JM109大肠菌株的组合等。
4.转化体
通过使用本发明的表达盒或重组载体转化宿主，得到转化体(以下也表述为“本发明的转化体”)。
作为在转化体的制造中使用的宿主，只要能够导入基因，表达盒或重组载体稳定，且能够自主增殖并且能够表达包含本发明的DNA的基因的性状，就没有特别限制，例如，作为优选例，可举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等的芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等的假单胞菌属等的细菌；酵母等，除此之外，也可以是动物细胞、昆虫细胞、植物等。
本发明的转化体可以通过在宿主细胞中导入本发明的表达盒或本发明的重组载体而得到。导入本发明的DNA的位置只要能够表达目标基因就没有特别限定，可以在质粒上，也可以在基因组上。作为导入本发明的表达盒或本发明的重组载体的具体方法，例如可举出重组载体法、基因组编辑法。向宿主导入表达盒或重组载体的条件根据宿主的种类等适当设定即可。如果宿主是细菌的情况下，则例如可举出使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法以及电穿孔法等。如果宿主是酵母的情况下，则例如可举出电穿孔法(Electroporation method)、原生质球法和醋酸锂法等。如果宿主是动物细胞的情况下，则例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等。如果宿主是昆虫细胞的情况下，则例如可举出磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法等。如果宿主是植物的情况下，则例如可举出电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、以及PEG法等。
本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的确认可以通过PCR法、Southern杂交法、以及Northern杂交法等进行。
在通过PCR法确认本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的情况下，例如，从转化体中分离、纯化基因组DNA或表达盒或重组载体即可。
表达盒或重组载体的分离、纯化例如在宿主为细菌的情况下，基于将细菌裂解而得到的溶菌物进行。作为裂解的方法，例如可利用溶菌酶等溶菌酶来实施处理，可根据需要并用蛋白酶及其它酶、以及十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。
进而还可以组合冻融及弗氏压碎处理这样的物理破碎方法。从溶菌物中分离、纯化DNA例如可以通过将利用苯酚处理以及蛋白酶处理等的除蛋白处理、核酸酶处理、醇沉淀处理以及适宜组合市售的试剂盒来进行。
DNA的切断可以按照常规方法，例如可以使用限制酶处理来进行。作为限制酶，例如使用作用于特定的核酸序列的II型限制酶。DNA与表达盒或表达载体的结合，例如使用DNA连接酶进行。
然后，将分离、纯化的DNA作为模板，在本发明的DNA上设计特异性引物进行PCR。对通过PCR得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，利用溴化乙锭和SYBR Green液等进行染色，然后将扩增产物作为条带(band)进行检测，由此能够确认转化。
另外，也可以使用预先利用荧光色素等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。进而，也可以采用使扩增产物结合于微孔板等固相并通过荧光和酶反应等确认扩增产物的方法。
5.蛋白质谷氨酰胺酶的制备方法
上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以通过包含培养本发明的转化体的工序的制造方法、或者包含培养产生上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的微生物的工序的制造方法得到。
上述培养条件只要考虑上述转化体或上述微生物的营养生理性质适当设定即可，可优选举出液体培养。另外，如果是进行工业制造的情况，则优选通气搅拌培养。
作为培养基的营养源，可以使用上述转化体或上述微生物的生长所需要的营养源。作为碳源，只要是能够同化的碳化合物即可，例如可举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。
作为氮源，只要是能够同化的氮化合物即可，例如可举出蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物。
除了碳源和氮源以外，可根据需要使用例如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰以及锌等盐类、特定的氨基酸以及特定的维生素等。
培养温度可以在本发明的上述转化体或上述微生物能够生长且上述转化体或上述微生物产生上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的范围内适当设定，例如为10～40℃左右，优选为15～37℃左右。培养只要预估上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶达到最高产量的时期而在适当时期完成即可，通常可举出培养时间为6～96小时左右、12～48小时左右。
在上述转化体或上述微生物的培养后，将培养液通过离心分离等方法回收培养上清液或菌体，菌体通过超声波和弗氏压碎这样的机械方法或溶菌酶等的溶菌酶实施处理，根据需要，可以通过使用蛋白酶等酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂而可溶化，得到包含上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的水溶性组分。
另外，通过选择适当的表达盒或表达载体和宿主，也可以使表达的上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶分泌到培养液中。
如上所述得到的包含上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的水溶性组分，可以直接供于纯化处理，也可以在将该水溶性组分中的上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶浓缩后供于纯化处理。
浓缩例如可通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、基于亲水性有机溶剂(例如，甲醇、乙醇和丙酮)的分别沉淀法等而进行。
上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的纯化处理例如可以通过适当组合凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等方法来进行。
这样纯化得到的上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以根据需要通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等粉末化并在市场上流通。
6.酶制剂
上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以以酶制剂的形态提供。因此，本发明还提供包含以上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶为有效成分的酶制剂。
作为本发明的酶制剂中的上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的含量，没有特别限定，例如可举出0.1U/g以上、1U/g以上，优选为10U/g以上，更优选为100U/g以上，进一步优选为250U/g以上，特别优选为500U/g以上、1000U/g以上、1500U/g以上、2000U/g以上、5000U/g以上。
本发明的酶制剂，除了上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶以外，在不影响本发明的发明效果的程度，也可以包含其他成分。作为其他成分，可举出上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶以外的其他酶、添加剂、在上述制造方法中产生的培养残渣等。
作为其他酶，例如可举出淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质脱酰胺酶(上述有效成分以外)、支链淀粉酶等。这些其他酶可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。
作为添加剂，可举出赋形剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可举出淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可举出磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可举出丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可举出苯甲酸盐(钾盐、钠盐等碱金属盐)、山梨酸盐(钾盐、钠盐等碱金属盐)、苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可举出乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。这些添加剂可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。
作为培养残渣，可举出来自培养基的成分、夹杂蛋白质、菌体成分等。
作为本发明的酶制剂的形态，没有特别限定，例如可举出液状、固体状(粉末、颗粒等)等。上述组合物可以通过通常公知的方法来制备。
7.用途
上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以用于蛋白质谷氨酰胺酶的公知用途。例如，上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以以蛋白质的改性为目的而使用。因此，本发明还提供包含上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的蛋白质的改性剂。
作为蛋白质的改性的具体方式，没有特别限定，只要是通过蛋白质的谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基的γ-酰胺基和β-酰胺基的脱酰胺化而产生羧基带来的蛋白质的特性变化即可。具体而言，作为蛋白质的改性，可举出蛋白质的可溶性的增大、水分散性的增大、乳化能力的提高、以及乳化稳定性等。
上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶的耐热性提高，因此本发明的酶制剂在以比较高的温度处理应改性的蛋白质的情况、和/或在加热条件下长时间处理的情况下特别有用。具体而言，上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶优选用于在40～80℃，优选46～77℃，进一步优选53～74℃，特别优选60～70℃的加热条件下处理应改性蛋白质。
8.一种改性的蛋白质材料的制造方法
如上所述，特定的蛋白质谷氨酰胺酶可以以蛋白质的改性为目的而使用。因此，本发明还提供包含使上述特定的蛋白质谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序的改性的蛋白质材料的制造方法。
在本发明的制造方法中，通过将包含蛋白质材料与特定的蛋白质谷氨酰胺酶的混合物供于特定的蛋白质谷氨酰胺酶的作用条件下，进行使蛋白质改性的反应。
作为蛋白质材料，只要是包含蛋白质的材料就没有特别限定，可以是食用和非食用中的任一种。食用蛋白质材料可以作为饮食品、或者、作为用于制造饮食品的原材料使用。非食用蛋白质材料可以作为蛋白质实验用材料、医疗材料、香料化妆品材料使用。
作为蛋白质材料的具体例，是从蛋白质源通过公知的方法进行提高蛋白质含量的处理而得到的物质，由本领域技术人员适当选择。例如，作为食用蛋白质材料，可举出由含有植物性蛋白质的食品得到的植物性蛋白质材料和动物性蛋白质等。作为植物性蛋白质，可举出大豆蛋白、蚕豆蛋白、豌豆蛋白、鹰嘴豆蛋白、绿豆蛋白、羽扇豆蛋白等豆蛋白；小麦蛋白、黑麦蛋白、燕麦蛋白、玉米蛋白等谷物蛋白质；金丝雀草籽(Canary seed)、亚麻仁、扁桃仁、腰果、榛子、山核桃、澳洲坚果、开心果、核桃、巴西坚果、花生、椰子、霹雳果、栗子、芝麻、松仁等的种实蛋白质等。作为动物性蛋白质，可举出畜肉、鱼肉、蛋的蛋白质等。作为非食用蛋白质材料，作为它们的来源，可举出来源于蛋清、血清等生物体试样的白蛋白、球蛋白等。
作为这些蛋白质材料中包含的蛋白质的含量，没有特别限定，例如可举出30重量％以上、40重量％以上、50重量％以上，优选为60重量％以上，更优选为70重量％以上，进一步优选为80重量％以上。作为蛋白质材料中包含的蛋白质的含量的上限，没有特别限定，例如可举出95重量％以下、90重量％以下、85重量％以下、80重量％以下、70重量％以下、或60重量％以下。
作为混合物中的蛋白质材料的含量，可举出蛋白质材料中包含的蛋白质的混合物中的浓度，例如可举出0.1重量％以上、0.3重量％以上，优选为0.7重量％以上，更优选为1.4重量％以上的量。作为蛋白质材料中包含的蛋白质的混合物中的该浓度的上限，没有特别限定，例如可举出80重量％以下、60重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、15重量％以下、10重量％以下、8重量％以下、5重量％以下、3重量％以下、或2重量％以下。
作为特定的蛋白质谷氨酰胺酶的使用量，没有特别限定，作为蛋白质中包含的每1g蛋白质的特定的蛋白质谷氨酰胺酶的使用量，例如可举出0.1U以上，优选为0.5U以上，更优选为1U以上，进一步优选为2U以上，进一步优选为3.5U以上，更进一步优选为4.5U以上。作为蛋白质材料中包含的每1g蛋白质的特定的蛋白质谷氨酰胺酶的使用量上限，没有特别限定，例如可举出45U以下、35U以下、20U以下、10U以下、8U以下或5.5U以下。
另外，作为每1g蛋白质材料的特定的蛋白质谷氨酰胺酶的使用量，例如可举出0.1U以上，优选为0.5U以上，更优选为1U以上，进一步优选为2U以上，进一步优选为3U以上，更进一步优选为4U以上。作为每1g蛋白质材料的特定的蛋白质谷氨酰胺酶的使用量的上限，没有特别限定，例如可举出40U以下、30U以下、20U以下、10U以下、7U以下或5U以下。
关于蛋白质脱酰胺酶(蛋白质谷氨酰胺酶)的活性，以苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸(Z-Gln-Gly)为底物，将在1分钟内游离1μmol的氨的酶量作为1个单位(1U)。
作为特定的蛋白质谷氨酰胺酶的作用条件，可根据使用的蛋白质谷氨酰胺酶的最适温度和最适pH而适当决定。
作为特定的蛋白质谷氨酰胺酶的作用条件中的温度条件，例如可举出50～80℃，优选为60～80℃，更优选为63～80℃。特定的蛋白质谷氨酰胺酶的耐热性优异，因此在65℃以上的条件下使用时特别有用。从这样的观点出发，作为该温度条件，可举出进一步优选为65～80℃，更优选为65～75℃，进一步优选为65～70℃，进一步优选为65～67℃。另一方面，该特定的蛋白质谷氨酰胺酶在低于65℃的条件下，温度越低，则相对于最适温度下的活性的相对值有变低的趋势，但自身具有的蛋白质脱酰胺化能力高，因此在低于65℃的条件下也发挥优异的蛋白质脱酰胺化能力。从这样的观点出发，作为该温度条件的优选例，可举出50℃以上且小于65℃、55℃以上且小于65℃、60℃以上且小于65℃、或63℃以上且小于65℃。
作为特定的蛋白质谷氨酰胺酶的作用条件中的pH条件，例如可举出2～12，优选为3～10，更优选为4～9。
作为使特定的蛋白质谷氨酰胺酶作用的时间，没有特别限定，可以根据投料规模等适当确定，例如可举出1小时以上，优选为8小时以上，更优选为16小时以上，进一步优选为20小时以上。作为该时间范围的上限，没有特别限定，例如可举出40小时以下、30小时以下、或25小时以下。
反应结束后，通过进行酶失活处理后进行冷却，根据需要进行后处理，由此得到改性蛋白质材料。
实施例
以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明不被解释为限定于以下实施例。
[试验例1]
(1)耐热性蛋白质谷氨酰胺酶产生株的选出
从申请人拥有的非公知的菌株文库中，以蛋白质谷氨酰胺酶活性和温度稳定性为指标，选出金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)的57594株和61798株，储存于包含甘油的培养液中。
(2)选出株的培养
以成为表示的浓度的方式在水中溶解表1的成分，在121℃高压灭菌器(autoclave)30分钟，制备培养基。将选出的菌株接种于培养基，在120rpm、30℃下进行40-48小时的培养。培养后，离心分离培养基，回收菌体，仅采集上清液。在上清液中添加硅藻土进行过滤，进而，使用超滤膜进行培养滤液的浓缩。
(3)酶的纯化
利用盐析、Phenyl-sepharose以及Sephacryl S-100处理浓缩液，纯化酶。关于57594株和61798株各自的培养液的纯化后的浓缩级分，将SDS-PAGE图像分别示于图1和图2。图1的泳道7表示纯化前级分，泳道8～10表示来自57594株培养物的纯化级分，泳道11表示分子标记。图2的泳道1表示分子标记，泳道2～4表示来自61798株培养物的纯化级分。如图1和图2所示，在纯化级分中确认到18kDa(用箭头表示的条带)作为纯化物。
[表1]
(4)酶学性质评价试验
对由57594株和61798株各自的培养液得到的18kDa纯化级分(来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶)评价以下酶学性质。对来自现有的解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(比较用PG)，也同样评价以下酶学性质。
[表2]
| 实施例1 | 来自金黄杆菌-57594株的蛋白质谷氨酰胺酶 |
| 实施例2 | 来自金黄杆菌-61798株的蛋白质谷氨酰胺酶 |
| 比较例1 | 来自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶 |
(4-1)蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定
·利用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解N-苄氧基羰基-L-谷氨酰胺基甘氨酸(Z-Gln-Gly；肽研究所)，将制成30mmol/L的溶液作为底物溶液。
·将应该测定活性的酶溶液0.1mL放入试管中，在37±0.5℃的恒温水槽中放置1分钟后，加入预先在37±0.5℃放置10分钟的底物溶液1mL，立即混合。
·通过将该液体放置10分钟进行酶反应之后，加入0.4mol/L三氯乙酸溶液1mL，停止酶反应。
·测定空白通过在试管中加入酶溶液0.1mL，按照0.4mol/L三氯乙酸溶液1mL、底物溶液1mL的顺序添加而制备。
·进行利用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)的显色反应，基于波长630nm处的吸光度的值，对通过10分钟的酶反应而游离得到的氨进行定量。
·将1分钟内生成1μmol的氨的酶量定义为1个单位(1U)，由通过酶反应游离得到的氨量算出活性值。
(4-2)温度稳定性试验
利用0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)置换纯化级分，进行10分钟4℃下的静置或进行10分钟40℃、50℃、60℃、65℃、70℃或75℃下的加热后，利用(4-1)的方法进行酶反应，进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将暴露于4℃条件的纯化级分的蛋白质谷氨酰胺酶活性设为100％时的、暴露于各温度下的加热条件的纯化级分的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图3。如图3所示，65℃下的比较用PG的相对活性为11％，与之相对，来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的相对活性为65％，来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的相对活性为66％，耐热性显著提高。
(4-3)最适温度试验
将酶反应温度变更为37℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，除此以外，利用与(4-1)同样的方法进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将表示各纯化级分的最大活性的温度条件(对于比较用PG为60℃，对于来自57594株的PG和来自61798株的PG为65℃)下的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、暴露于各温度条件下的纯化级分中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图4。如图4所示，比较用PG的最适温度为60℃，与之相对，来自57594株和61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的最适温度提高到65℃。
(4-4)pH稳定性试验
利用伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液将纯化级分调节至pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，在各pH下、在37℃下放置过夜(18小时)后，利用(4-1)的方法进行酶反应，进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将pH6时的蛋白质谷氨酰胺酶活性作为100％时的、暴露于各pH条件下的纯化级分中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图5。
(4-5)最适pH试验
利用伯瑞坦-罗宾森缓冲液将底物溶液的pH调节至pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，在各pH下进行酶反应，除此以外，利用与(4-1)相同的方法进行蛋白质谷氨酰胺酶活性测定，算出将pH6时的蛋白质谷氨酰胺酶作为100％时，暴露于各pH条件下的纯化级分中的蛋白质谷氨酰胺酶活性的相对量，作为蛋白质谷氨酰胺酶相对活性(％)。将结果示于图6。
(5)序列
基于推定为与57594株和61798株为近缘的金黄杆菌属细菌的序列信息设计了简并引物。使用简并引物，以57594株和61798株的基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR(R)GXLDNA聚合酶(Polymerase)(Takara Bio公司制造)通过PCR扩增DNA片段。通过NucleoSpin(R)Gel and PCR Clean-up(Takara Bio公司制造)，回收扩增片段，进行基于简并引物的序列分析。其结果，确定来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列(序列号1)；包含编码序列号1的结构基因(序列号3)的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶周边碱基序列(序列号5)；来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列(序列号2)；以及包含编码序列号2的结构基因(序列号4)的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶基因周边碱基序列(序列号6)。
[试验例2]
在本试验例中，使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶进行各种蛋白质材料的改性(脱酰胺化)反应。对于现有的比较例1的来自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(比较用PG)，也同样进行以下的各种蛋白质的改性(脱酰胺化)反应。
具体而言，在50mM磷酸缓冲液(pH7.0)1mL中加入蛋白质材料20mg进行混悬，以成为0.23mg/g-蛋白质的方式添加蛋白质谷氨酰胺酶(关于各成分的更详细的添加量，如表3所示)，在55℃、60℃、65℃或70℃的条件下反应24小时。然后，加入1mL的0.4M三氯乙酸溶液，使其反应停止。使用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)，对游离氨量进行定量。将得到的游离氨量除以关于蛋白质谷氨酰胺酶添加前的蛋白质材料混悬液的游离氨量，由此导出蛋白质脱酰胺化率，应予说明，蛋白质谷氨酰胺酶添加前的蛋白质材料混悬液的游离氨量按照以下方式测定。在酶添加前的蛋白质材料混悬液中加入3N浓硫酸进行混合，在110℃、3小时的处理后，进行冷却，利用6N氢氧化钠中和，通过离心分离得到上清。对于得到的上清，使用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)对游离氨量进行定量。进而，在将使用比较例1的PG时的蛋白质脱酰胺化率设为1的情况下的各实施例中的蛋白质脱酰胺化率的倍数作为脱酰胺化促进率而导出。将结果示于表3。
[表3]
由表3可知，对于任一食品材料，无论反应温度如何，与使用比较例1的蛋白质谷氨酰胺酶的情况(比较例2-4)相比，在使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的情况下，均能够确认到优异的蛋白质脱酰胺化率(实施例3～8)。其中，在豌豆和大豆这样的食品材料的情况下，在反应温度为60℃的情况下能够确认到特别高的蛋白质脱酰胺化促进率(实施例3～6)，在白蛋白的情况下，在反应温度为60℃、65℃、70℃，特别是60℃的情况下能够确认到高的蛋白质脱酰胺化促进率(实施例7～8)。
[试验例3]
在本试验例中，使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶，对豌豆蛋白的可溶性能力进行试验。对于现有的比较例1的来自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(比较用PG)，也同样进行以下的可溶性能力的试验。
具体而言，在50mM磷酸缓冲液(pH7.0)10mL中加入豌豆蛋白质材料(蛋白质含量：82重量％)100mg进行混悬，以成为0.23mg/g-蛋白质的方式添加蛋白质谷氨酰胺酶(关于各成分的更详细的添加量，如表4所示)，在65℃的条件下反应24小时。
取出1mL样品，加入1mL的0.4M三氯乙酸溶液，使反应停止。使用Ammonia-testWako(富士胶片和光纯药)，定量游离氨量。将得到的游离氨量除以关于蛋白质谷氨酰胺酶添加前的蛋白质材料混悬液的游离氨量，由此导出蛋白质脱酰胺化率，将结果示于表4。
对于剩余的样品，在沸水中浸渍装有反应组合物的容器，通过实施加热处理使反应停止。利用纯化水进行脱盐，通过冷冻干燥得到脱酰胺化蛋白(改性蛋白质)粉末。将得到的冷冻干燥脱酰胺化蛋白(改性蛋白质)粉末2mg溶解于pH2～12的伯瑞坦-罗宾森缓冲液1mL中，在室温下振荡30分钟。以15000×g离心分离5分钟，通过Lowry法测定上清的溶解蛋白浓度。另外，将使用比较例1的PG时的溶解蛋白浓度设为1时的各实施例中的溶解蛋白浓度的倍数作为蛋白质溶解促进率而导出。将结果示于表4(表4中，与斜线对应的部分无数据)。
[表4]
由表4可知，与使用比较例1的蛋白质谷氨酰胺酶的情况(比较例5)相比，在使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶以及实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的情况下，确认到优异的蛋白质脱酰胺化率(实施例9～10)。另外，得到的改性蛋白质的溶解性，在任一pH下与比较例1的使用蛋白质谷氨酰胺酶的情况(比较例5)相均提高(实施例9～10)，确认到与蛋白质脱酰胺化率的提高的相关性。
[试验例4]
在本试验例中，使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶和实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶对蛋清蛋白在碱条件下的脱酰胺化能力进行试验。对于现有的比较例1的来自解朊金黄杆菌9670株的蛋白质谷氨酰胺酶(比较用PG)，也同样进行以下的脱酰胺化能力的试验。
具体而言，在伯瑞坦-罗宾森缓冲液(pH7.0或pH10.0)1mL中加入蛋清蛋白(蛋白质含量：81重量％)20mg进行混悬，以成为0.23mg/g-蛋白质的方式添加蛋白质谷氨酰胺酶(关于各成分的更详细的添加量，如表5所示)，在37℃反应24小时。然后，加入0.4M三氯乙酸溶液1mL，使反应停止。使用Ammonia-test Wako(富士胶片和光纯药)，定量游离氨量。将得到的游离氨量除以关于蛋白质谷氨酰胺酶添加前的蛋白质混悬液的游离氨量，由此导出蛋白质脱酰胺化率。另外，将在pH7进行处理时的蛋白质脱酰胺化率设为1时的、pH10的蛋白质脱酰胺化率的倍数作为碱条件下的脱酰胺化促进率导出。将结果示于表5。
[表5]
由表5可知，与使用比较例1的蛋白质谷氨酰胺酶的情况(比较例6)相比，在使用实施例1的来自57594株的蛋白质谷氨酰胺酶以及实施例2的来自61798株的蛋白质谷氨酰胺酶的情况下，能够确认到碱条件下的蛋白质脱酰胺化促进率的提高(实施例11～12)。
序列表
<110> 天野酶制品株式会社
<120> 耐热性蛋白质谷氨酰胺酶
<130> 21082WO
<150> JP2020-193671
<151> 2020-11-20
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄杆菌
<400> 1
Met Lys Lys Phe Leu Leu Ser Met Met Val Phe Val Thr Met Leu Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ala Cys Ser Asp Ser Ala Ala Asn Gln Asp Pro Asn Leu Val
20 25 30
Ala Lys Glu Ser Asn Glu Ile Ala Met Lys Asp Phe Gly Lys Thr Val
35 40 45
Pro Val Gly Ile Glu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Lys Val Ser Phe Met
50 55 60
Val Ser Ala Gln Pro Tyr His Ile Lys Asp Ser Lys Glu Asn Ala Gly
65 70 75 80
Tyr Ile Ser Met Ile Arg Gln Ala Val Glu Asn Glu Thr Pro Val His
85 90 95
Ile Phe Leu Lys Thr Asn Thr Thr Glu Ile Ala Lys Val Asp Lys Pro
100 105 110
Thr Asp Asp Asp Ile Arg Tyr Phe Lys Ser Val Phe Asn Lys Glu Glu
115 120 125
Arg Gly Asp Ser Lys Lys Ala Val Ser Val Ile Pro Asn Leu Ala Thr
130 135 140
Leu Asn Ser Leu Phe Thr Gln Ile Lys Asn Gln Ala Cys Gly Thr Ser
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Pro Cys Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys
165 170 175
Tyr Ala Arg Ala His Lys Met Arg Gln Ile Leu Leu Asn Ala Gly Tyr
180 185 190
Asp Cys Glu Lys Gln Phe Val Tyr Gly Asn Leu Arg Ala Ser Thr Gly
195 200 205
Thr Cys Cys Val Ser Trp Val Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Phe
210 215 220
Lys Asn Ala Ser Gly Ile Val Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu
225 230 235 240
Phe Ser Ser Gly Pro Val Thr Asp Ala Ala Trp Arg Ala Ala Cys Thr
245 250 255
Asn Thr Ser Cys Gly Ser Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala
260 265 270
Gly Asn Val Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Gly Ser Leu Leu Tyr Asp Asn
275 280 285
Asn Tyr Val Asn Thr Asn Cys Val Leu Asn Ile Phe Ser Ser Leu Ser
290 295 300
Gly Cys Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser Val Ala Ser Cys Gly Phe
305 310 315
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 金黄杆菌
<400> 2
Met Lys Lys Phe Leu Leu Ser Met Met Val Phe Val Thr Val Leu Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ser Cys Ser Asp Ser Ser Ala Asn Gln Asp Pro Asn Leu Val
20 25 30
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35 40 45
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305 310 315
<210> 3
<211> 960
<212> DNA
<213> 金黄杆菌
<400> 3
atgaaaaaat ttctgttatc catgatggta ttcgtgacga tgctgtcatt caatgcctgt 60
tcagattcag ctgccaatca ggatcccaat cttgttgcta aagagtctaa tgaaatcgcc 120
atgaaagatt tcggtaaaac tgttccggta gggattgaaa aagaagaggg aaaatttaaa 180
gtctctttta tggtgagtgc tcagccatac cacattaaag acagtaagga aaatgcaggt 240
tatatttcta tgatcagaca agccgttgaa aacgaaactc ctgttcatat tttcctgaaa 300
accaacacca ctgaaattgc aaaagtagat aaacctactg atgatgatat ccgttatttc 360
aaatctgttt tcaataaaga agagagagga gacagcaaaa aagcagtgag tgttattcct 420
aacctggcaa cactgaacag cttatttacg cagattaaaa accaggcttg cggtacttct 480
acagcatctt ctccatgtat cactttcaga tatccggtgg atggatgtta tgcaagagct 540
cacaaaatga gacagatcct ccttaatgca ggctacgact gtgaaaagca gttcgtttac 600
ggaaacctga gagcttctac aggaacttgc tgcgtatcat gggtatatca cgtagccata 660
ttggtaagct tcaaaaatgc ttccggaatt gttgagaaaa gaatcatcga tccttcacta 720
ttctccagcg gacccgtaac tgacgcagca tggagagccg cttgtaccaa cacaagctgt 780
ggatctgctt ctgtatcttc ttatgccaat acagcaggaa acgtgtacta cagaagtcca 840
tcaggatctt tactgtatga taacaattat gtaaatacca attgtgtatt gaatatattc 900
tcatcccttt caggatgttc tccttctcct gcaccaagtg tagcgagctg cggattttaa 960
<210> 4
<211> 960
<212> DNA
<213> 金黄杆菌
<400> 4
atgaaaaaat ttcttttatc catgatggta ttcgtgacgg tactttcatt taactcctgt 60
tcggattcaa gtgccaatca ggatccgaat cttgttgcta aagagtctaa tgaaattgct 120
atgaaagact ttggtaaaac tgttccggta gggatagaaa aagaggatgg aaagtttaaa 180
gtttccttta tagtttcagc gcagccgtat caaattaaag atacaaaaga aaatgcggga 240
tatatctcca tgatcaaaga ggctgtagaa aatgaaactc ctgttcaggt tttcctgaaa 300
gccaattcta acgaaatcgc aaaggtagac aaagcaacag cggatgacat ccgttatttc 360
aaatctgttt tcaacaaaga agagagaggc gacagcagaa aagctgtgag cgttattcct 420
aatcttgcaa cgctgaacag cttattcact cagatcaaaa accaggcttg cggaacttct 480
acagcatctt caccgtgtat cacattcaga tatcctgtgg atggatgcta tgcgagagct 540
cacaaaatga gacaaatcct tttgaatgca ggctacgact gtgaaaaaca gttcgtttac 600
gggaacctaa gagcatctac aggaacatgc tgtgtgtctt gggtatatca cgtagccatt 660
ttggtaagct tcaaaaatgc ttccggaatt gttgagaaaa gaattattga tccgtcacta 720
ttctccagcg gacctgtaac agatactgca tggagagccg catgtaccaa cacaagctgt 780
ggatctgctt ctgtttcttc ttatgccaat acagcaggaa atgtatacta cagaagccca 840
tccggttctt tattatatga taacaattat gtaaatacca actgtgtatt gaacatattc 900
tcatcccttt caggatgttc tccttcccct gcacctagtg tagcaagctg tggattttaa 960
<210> 5
<211> 1028
<212> DNA
<213> 金黄杆菌
<400> 5
caaaatagtg aactattata gttaaaaagt tcactgaaaa ttaaccacca aaatataaaa 60
actatgaaaa aatttctgtt atccatgatg gtattcgtga cgatgctgtc attcaatgcc 120
tgttcagatt cagctgccaa tcaggatccc aatcttgttg ctaaagagtc taatgaaatc 180
gccatgaaag atttcggtaa aactgttccg gtagggattg aaaaagaaga gggaaaattt 240
aaagtctctt ttatggtgag tgctcagcca taccacatta aagacagtaa ggaaaatgca 300
ggttatattt ctatgatcag acaagccgtt gaaaacgaaa ctcctgttca tattttcctg 360
aaaaccaaca ccactgaaat tgcaaaagta gataaaccta ctgatgatga tatccgttat 420
ttcaaatctg ttttcaataa agaagagaga ggagacagca aaaaagcagt gagtgttatt 480
cctaacctgg caacactgaa cagcttattt acgcagatta aaaaccaggc ttgcggtact 540
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gctcacaaaa tgagacagat cctccttaat gcaggctacg actgtgaaaa gcagttcgtt 660
tacggaaacc tgagagcttc tacaggaact tgctgcgtat catgggtata tcacgtagcc 720
atattggtaa gcttcaaaaa tgcttccgga attgttgaga aaagaatcat cgatccttca 780
ctattctcca gcggacccgt aactgacgca gcatggagag ccgcttgtac caacacaagc 840
tgtggatctg cttctgtatc ttcttatgcc aatacagcag gaaacgtgta ctacagaagt 900
ccatcaggat ctttactgta tgataacaat tatgtaaata ccaattgtgt attgaatata 960
ttctcatccc tttcaggatg ttctccttct cctgcaccaa gtgtagcgag ctgcggattt 1020
taactaat 1028
<210> 6
<211> 1029
<212> DNA
<213> 金黄杆菌
<400> 6
tagtgaacta taaaaactaa aagttcacta aaaattaacc accaaaatat aaaaactatg 60
aaaaaatttc ttttatccat gatggtattc gtgacggtac tttcatttaa ctcctgttcg 120
gattcaagtg ccaatcagga tccgaatctt gttgctaaag agtctaatga aattgctatg 180
aaagactttg gtaaaactgt tccggtaggg atagaaaaag aggatggaaa gtttaaagtt 240
tcctttatag tttcagcgca gccgtatcaa attaaagata caaaagaaaa tgcgggatat 300
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aattctaacg aaatcgcaaa ggtagacaaa gcaacagcgg atgacatccg ttatttcaaa 420
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cttgcaacgc tgaacagctt attcactcag atcaaaaacc aggcttgcgg aacttctaca 540
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tccagcggac ctgtaacaga tactgcatgg agagccgcat gtaccaacac aagctgtgga 840
tctgcttctg tttcttctta tgccaataca gcaggaaatg tatactacag aagcccatcc 900
ggttctttat tatatgataa caattatgta aataccaact gtgtattgaa catattctca 960
tccctttcag gatgttctcc ttcccctgca cctagtgtag caagctgtgg attttaatta 1020
atttataga 1029
Claims (9)
1.一种蛋白质谷氨酰胺酶，其特征在于，包含以下(1)～(3)中任一项所示的多肽：
(1)包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽；
(2)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽；以及
(3)在序列号1或2所示的氨基酸序列中，相对于序列号1或2所示的氨基酸序列的序列一致性为76％以上、且显示与包含序列号1或2所示的氨基酸序列的多肽同等的耐热性的多肽。
2.一种DNA，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
3.一种表达盒或重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA。
4.一种转化体，其特征在于，通过权利要求3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。
5.根据权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶的制造方法，其包含培养权利要求4所述的转化体的工序。
6.一种酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
7.一种蛋白质改性剂，其特征在于，包含权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶。
8.一种改性的蛋白质材料的制造方法，其特征在于，包含使权利要求1所述的蛋白质谷氨酰胺酶作用于蛋白质材料的工序。
9.根据权利要求8所述的改性的蛋白质材料的制造方法，其中，所述蛋白质材料为食用蛋白质材料。
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