JP2001211880A - γ−グルタミルトランスペプチダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アスペルギルス・オリゼのγ−グルタミルト
ランスペプチダーゼを精製し、同定する。 【解決手段】 アスペルギルス・オリゼの培養物から、
下記性質を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
を精製する。 （１）作用：ペプチドまたはアミノ酸にγ−グルタミル
基を転移する反応、又は、γ−グルタミル化合物を加水
分解する反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：１８％ＮａＣｌ存在下でｐＨ８以上 （３）ＮａＣｌ耐性：約ｐＨ８．７において、ＮａＣｌ
非存在下での活性に対し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０
％以上の加水分解活性、又は１００％又はそれ以上のペ
プチド転移活性を示す。 （４）電気泳動により観察される性質： 非還元条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳
動でほぼ単一のバンドを形成する。 還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で、約４０ｋＤａ及び約２０ｋＤａの二本のバ
ンドを形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規γ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼに関し、詳しくはアスペルギル
ス・オリゼに由来する耐塩性を有するγ−グルタミルト
ランスペプチダーゼに関する。γ−グルタミルトランス
ペプチダーゼは、ペプチド又はアミノ酸のγ−グルタミ
ル化反応、及びγ−グルタミル化合物の加水分解反応に
用いることができる。これらの反応は、医薬又は食品分
野に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（以下、「ＧＧＴ」ともいう）は、γ−グルタミル基を
ペプチドまたはアミノ酸に転移する反応を触媒する酵素
である。また、ＧＧＴはグルタチオンなどのγ−グルタ
ミル化合物を加水分解する活性を有する。

【０００３】ＧＧＴは肝臓等の細胞の細胞質膜に存在
し、細胞外のアミノ酸の細胞内への取り込みに関与する
酵素であり、肝機能診断のマーカー（γ−ＧＴＰ）とし
て知られている。ＧＧＴは生物に広く存在し、エシェリ
ヒア・コリ（特開平２−２３１０８５号）、及びバチル
ス・ズブチリス（特開平３−２３２４８６号）では、同
酵素をコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を用いてＧ
ＧＴを製造する方法が開示されている。また、バチルス
・ズブチリス又はバチルス・リケニフォルミスを酵母エ
キスを含む培地中で好気的条件で培養することによって
ＧＧＴを製造する方法が提案されている（特開平４−２
８１７８７号）。

【０００４】一方、アスペルギルス・オリゼ（Aspergil
lus oryzae）が産生する細胞外グルタミナーゼ（γ−グ
ルタミンアミドヒドロラーゼ）の粗酵素調製物が、Ｌ−
グルタミン及びグリシルグリシンからγ−グルタミルグ
リシルグリシンを生成し、ＧＧＴ活性を保持することが
報告されている（J. Ferment. Technol., 66(3), 299-3
04 (1988)）。しかし、アスペルギルス・オリゼが産生
するＧＧＴは未だ精製されておらず、酵素学的性質も解
明されていなかった。

【０００５】尚、ペニシリウム・ロックフォルティの産
生するＧＧＴの部分精製酵素が、比較的耐塩性であるこ
とが知られている（Agric. Biol. Chem., 52(9), 2373-
2374, 1988）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、アス
ペルギルス・オリゼにおいてはＧＧＴ活性として確認さ
れているのみであり、酵素の同定はなされていなかっ
た。本発明は、アスペルギルス・オリゼのＧＧＴを精製
し、酵素学的性質を明らかにすることを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のア
スペルギルス・オリゼ菌株から高いＧＧＴ活性を示す菌
株を選択することに成功し、さらに、同菌株の培養物か
らＧＧＴを均質になるまで精製することに成功し、本発
明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明は、下記性質を有するＧＧ
Ｔである。 （１）作用：ペプチドまたはアミノ酸にγ−グルタミル
基を転移する反応、又は、γ−グルタミル化合物を加水
分解する反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：１８％ＮａＣｌ存在下でｐＨ８以上。 （３）耐塩性：約ｐＨ８．７において、ＮａＣｌ非存在
下での活性に対し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０％以上
の加水分解活性、又は１００％又はそれ以上のペプチド
転移活性を示す。 （４）電気泳動により観察される性質： 非還元条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳
動でほぼ単一のバンドを形成する。 還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で、約４０ｋＤａ及び約２０ｋＤａの二本のバ
ンドを形成する。

【０００９】本発明はまた、前記ＧＧＴにおいて、大サ
ブユニットと小サブユニットからなり、大サブユニット
はＮ末端アミノ酸配列中に配列番号１のアミノ酸番号５
〜１７のアミノ酸配列を含み、小サブユニットはＮ末端
アミノ酸配列中に配列番号２のアミノ酸番号２〜１４の
アミノ酸配列を、それぞれ含むＧＧＴを提供する。以
下、上記性質を有する本発明のＧＧＴを、単に「ＧＧ
Ｔ」ということがある。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＧＧＴは、下記性質を有する。

【００１１】（１）作用：ペプチドまたはアミノ酸にγ
−グルタミル基を転移する反応、又は、γ−グルタミル
化合物を加水分解する反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：１８％ＮａＣｌ存在下でｐＨ８以上 （３）耐塩性：約ｐＨ８．７において、ＮａＣｌ非存在
下での活性に対し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０％以上
の加水分解活性、又は１００％又はそれ以上のペプチド
転移活性を示す。 （４）電気泳動により観察される性質： 非還元条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳
動でほぼ単一のバンドを形成する。 還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で、約４０ｋＤａ及び約
２０ｋＤａの二本のバンドを形成する。

【００１２】上記の性質を有するＧＧＴは、アスペルギ
ルス・オリゼの小麦ふすま培地を用いた培養物から単
離、精製されたものであり、本発明者により初めて同定
された。このアスペルギルス・オリゼ由来のＧＧＴは、
後記実施例に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量約４０ｋＤａの大サブユニットと分子量約２０ｋＤａ
の小サブユニットからなり、それぞれのポリペプチドの
Ｎ末端アミノ酸配列中に、配列表配列番号１、配列番号
２に示すアミノ酸配列を含んでいる。

【００１３】また、本発明のＧＧＴは、少なくともγ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドからγ−グルタミル基
をグリシルグリシンに転移する。また、γ−グルタミル
−ｐ−ニトロアニリドを加水分解する。

【００１４】次に、本発明のＧＧＴの製造法の例を説明
する。アスペルギルス属に属する糸状菌、好ましくはア
スペルギルス・オリゼを、ポテト・デキストロース寒天
培地で胞子が十分に形成されるまで２８℃で培養する。
アスペルギルス・オリゼとしては、アスペルギルス・オ
リゼIAM2706株が挙げられる。本発明者らは、アスペル
ギルス・オリゼの種々の菌株約６０株から、ＧＧＴを高
生産する菌株として、IAM2706株を選択した。同株は、
インスティチュート・オブ・モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオサイエンス（旧インスティチュート・オ
ブ・アプライド・マイクロバイオロジー）（Institute
of Molecular and Cellular Biosciences. (Formerly,
Institute of Applied Microbiology)、住所：日本国東
京都文京区弥生一丁目東京大学（The university of To
kyo, Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan）から
入手可能である。

【００１５】次に、前記培地に形成された胞子の懸濁液
を小麦ふすま培地接種し、２８℃で３日程度培養する。
培養途中に培地を攪拌し、通気を良くすることが好まし
い。このようにして得られた培地を、０．０５ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌｐＨ９に攪拌した後、濾過し、粗酵素液を濾
液として得る。以下の操作は、低温下で行うことが好ま
しい。

【００１６】上記粗酵素液を、硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組
み合わせて分画することにより、ＧＧＴを精製すること
ができる。具体的には、例えば以下のようにして行う。

【００１７】まず、硫酸アンモニウムを用いて分画す
る。６０％飽和の硫安で沈殿せず、８０％飽和で沈殿す
る画分を採取する。次に、採取した画分をＤＥＡＥ−セ
ファデックスＡ−５０カラム（ファルマシア社）に供
し、ＮａＣｌ濃度勾配（０〜１．０Ｍ）で溶出する。次
に、活性画分をセルロファインＧＣ７００−ｍカラム
（生化学工業）でゲル濾過分画する。続いて、活性画分
をギガパイトカラム（生化学工業）に供し、ＮａＣｌ濃
度勾配（０．０１Ｍ〜０．７Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ８．０）で溶出し、活性画分を得る。最後に、フェニ
ルセファロースＣＬ−４Ｂカラムに供し、硫酸アンモニ
ウム濃度勾配（１．０〜０Ｍ）で溶出する。

【００１８】精製の各段階においては、分画された画分
中に含まれるＧＧＴ活性を測定し、活性の高い画分を集
めて次の段階に供試することが好ましい。ＧＧＴ活性
は、例えば、実施例に示すようにJ. Bacteriol., 168,
1325-1331 (1986)に記載の方法に準じて測定することが
できる。分画された活性画分は、硫安沈殿（８０％飽
和）により濃縮し、適当な緩衝液に溶解した後、緩衝液
に対して透析することにより、緩衝液交換を行う。

【００１９】精製されたＧＧＴの精製度の確認や分子量
の測定は、ゲル電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー
等によって行うことができる。また、酵素学的性質は、
反応温度あるいは反応ｐＨを変化させて酵素活性を測定
し、あるいは種々の酵素阻害剤や金属イオン等を反応液
に添加し、残存酵素活性を測定することによって、検討
すればよい。さらに、ＧＧＴを種々の濃度のＮａＣｌ等
の塩の存在下で測定することにより、耐塩性を調べるこ
とができる。また、ＧＧＴを種々のｐＨ条件下又は温度
条件下に一定時間さらした後に酵素活性を測定すること
により、安定ｐＨ範囲及び安定温度範囲を調べることが
できる。

【００２０】前記したＧＧＴの性質は、このようにして
決定されたものであるが、測定条件によって異なる結果
が得られる場合があることに留意すべきである。例え
ば、ゲル電気泳動による分子量の測定は、用いるゲルの
濃度や分子量マーカーによって影響される。また、酵素
活性は、ｐＨや緩衝液の種類又は塩濃度によって異なる
ことが多い。したがって、ＧＧＴの同定に際しては、個
々の性質のみではなく、総合的な検討を行うことが好ま
しい。尚、前記（２）、（３）に示した性質は、実施例
に示したJ. Bacteriol., 168, 1325-1331 (1986)に記載
の方法に準じた方法により測定される活性に基づくもの
である。

【００２１】ＧＧＴは、アミノ酸を又はペプチドをγ−
グルタミル化することができるので、溶解度の低いアミ
ノ酸又はペプチドをγ−グルタミル化して溶解度を高め
ることができる。また、アミノ酸又はペプチドをγ−グ
ルタミル化することによって、アミノ酸分解酵素又はペ
プチド分解酵素から保護することができる。

【００２２】また、味噌や醤油等の食品中のアミノ酸又
はペプチドをγ−グルタミル化することによって、ある
いはγ−グルタミル化合物を加水分解することによっ
て、呈味を改善することができる。本発明のＧＧＴは、
約ｐＨ８．７において、ＮａＣｌ非存在下での活性に対
し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０％以上の活性を示す。
特に、ペプチド転移活性は、ＮａＣｌ非存在下に比べ
て、少なくとも１８％濃度まではＮａＣｌ濃度が増加す
るにつれて活性も高くなる。したがって、ＮａＣｌ濃度
が高い味噌や醤油中での酵素反応には、本発明のＧＧＴ
は好適である。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００２４】＜１＞ＧＧＴ活性及びタンパク質濃度の測
定 以下の実施例において、特記しない限り、ＧＧＴ活性の
測定は、J. Bacteriol., 168, 1325-1331 (1986)に記載
の方法に準じて行った。具体的には、γ−グルタミル基
供与体としてγ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（γ
−ＧｐＮＡ）（和光純薬工業）を、受容体としてグリシ
ルグリシンを用いた。γ−ＧｐＮＡ以外の成分を含む溶
液にγ−ＧｐＮＡ溶液を加えることで反応を開始し、３
７℃でインキュベートした後、反応液に３．５Ｎ酢酸１
ｍｌを加えて、経時的に反応を停止した。反応液の組成
を表１に示す。

【００２５】ＧＧＴ活性は、上記反応により生成するｐ
−ニトロアニリン（ｐ−ＮＡ）の４１０ｎｍにおける吸
光度（Ａ410nm）を測定することにより算出した。ペプ
チド転移（transpeptidation）活性は、グリシルグリシ
ンを添加した反応液の４１０ｎｍにおける吸光度から、
グリシルグリシン無添加の反応液の４１０ｎｍにおける
吸光度を差し引いた値から算出した。また、加水分解活
性は、グリシルグリシン無添加の反応液の４１０ｎｍに
おける吸光度変化を測定し、この値から算出した。

【００２６】

【表１】 表１反応液組成 ─────────────────────────────────── ペプチド転移活性（ml）加水分解活性（ml） ─────────────────────────────────── 1mM γ−ＧｐＮＡ 0.25 0.25 0.3Mグリシルグリシン pH 8.73 0.1 0 0.5M Tris-HCl pH 8.73 0.05 0.05 水 0 0.1 酵素液 0.1 0.1 ───────────────────────────────────

【００２７】酵素活性の単位は、１分間に１μｍｏｌの
ｐ−ＮＡを生成する活性を１ユニットとした。酵素活性
の計算には、下記式を用いた。

【００２８】

【数１】酵素活性（mU/ml）＝（ΔＡ410nm×1000×ｖ）
／（Ｅ×Ｔ×Ｖ） Ｅ：1mM p-NAの410nmにおける分子吸光係数、8.8 ｖ：反応液量（ml）、1.5 Ｔ：反応時間（分） Ｖ：添加酵素液量（ml）

【００２９】タンパク質濃度は、標準タンパク質として
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて、ローリー（Lo
wry）法（J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)）によ
り測定した。

【００３０】＜２＞ＧＧＴ活性を有する菌株のスクリー
ニング 味噌や醤油の醸造用麹由来のアスペルギルス・オリゼの
種々の菌株約６０株から、粗酵素溶液を調製し、ＧＧＴ
活性及びタンパク質濃度を測定した。具体的な手順は以
下に示すとおりである。

【００３１】（１）前培養 ポテト・デキストロース寒天培地（Potato dextrose: D
ifco社）で斜面培地を作製し、同培地に各菌株を接種
し、胞子が十分に形成されるまで２８℃で培養した。

【００３２】（２）本培養 直径１５ｃｍ、深さ３．８ｃｍのシャーレに市販の小麦
ふすま（井澤製粉株式会社製、京都市南区久世中久町７
３６）３０ｇを入れ、リン酸カリウム緩衝液（0.1M, pH
7.2）を３０ｍｌ加えてふすまを湿らせ、３０分間オー
トクレーブした。前培養した前記の斜面培地に５ｍｌの
滅菌水を加えて十分に攪拌し、胞子懸濁液を得、小麦ふ
すま培地に流し込み、滅菌した薬さじで十分にかき混ぜ
た。培養は、２８℃で７２時間行った。培養開始から２
４時間後に、通気をよくするために、滅菌した薬さじで
培地を攪拌した。

【００３３】（３）粗酵素溶液の調製 本培養後の培地に純水１２０ｍｌを加えて十分に攪拌
し、４℃で１２時間放置した後、さらし木綿の布で濾過
した。濾液を8000r.p.m.で１０分間、冷却下で遠心し
た。得られた上清を粗酵素溶液とした。

【００３４】（４）高ＧＧＴ活性株の選択 上記のようにして得られた粗酵素溶液を用いて、＜１＞
に示した方法によりＧＧＴ活性及びタンパク質濃度を測
定し、最も比活性の高い株としてIAM2706株を選択し
た。

【００３５】＜３＞ＧＧＴの精製 （３）において純水の代わりに０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣｌｐＨ９を用いた以外は＜２＞と同様にして、アスペ
ルギルス・オリゼIAM2706株を小麦ふすま培地を入れた
シャーレ３０枚を用いて培養し、粗酵素液を調製した。
この粗酵素液から、以下に示す手順によってＧＧＴを精
製した。すべての操作は、４℃で行った。

【００３６】（１）ステップ１：硫安分画 上記粗酵素液に、硫酸アンモニウムを６０％飽和となる
ように加え、アンモニアを用いてｐＨを９．０に調整し
た。8000r.p.m.で１０分間遠心して上清を取得し、硫酸
アンモニウムを８０％飽和となるように加えた。遠心に
より沈殿を採取し、必要最少量の緩衝液Ａ（0.05M Tris
-HCl, pH9.0）に溶解し、緩衝液Ａに対して透析した。

【００３７】（２）ステップ２：ＤＥＡＥ−セファデッ
クスＡ−５０カラムクロマトグラフィー ステップ１の透析液を、緩衝液Ａで平衡化されたＤＥＡ
Ｅ−セファデックスＡ−５０（ファルマシア社）（３．
０×１８ｃｍ）に供し、緩衝液Ａ中の０〜１．０ＭＮａ
Ｃｌの直線グラジエントで溶出した。活性画分は、硫安
沈殿（８０％飽和）により濃縮した。遠心により沈殿を
採取し、必要最少量の緩衝液Ａに溶解し、緩衝液Ａに対
して透析した。

【００３８】（３）ステップ３：セルロファインＧＣ７
００−ｍカラムクロマトグラフィー ステップ２の透析液を、緩衝液Ａで平衡化されたセルロ
ファインＧＣ７００−ｍカラム（生化学工業）（１．４
×１４３ｃｍ）に供し、緩衝液Ａで溶出した。活性画分
は、硫安沈殿（８０％飽和）により濃縮した。遠心によ
り沈殿を採取し、必要最少量の緩衝液Ｂ（0.01Mリン酸
カリウム緩衝液、pH8.0）に溶解し、緩衝液Ｂに対して
透析した。

【００３９】（４）ステップ４：ギガパイトカラムクロ
マトグラフィー ステップ３の透析液を、緩衝液Ｂで平衡化されたギガパ
イト（Gigapite）カラム（生化学工業）（２．７×２５
ｃｍ）に供し、０．０１Ｍ〜０．７Ｍのリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）の直線グラジエントで溶出した。
活性画分は、硫安沈殿（８０％飽和）により濃縮した。
遠心により沈殿を採取し、必要最少量の１．０Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む緩衝液Ａに溶解し、１．０Ｍ硫酸アン
モニウムを含む緩衝液Ａに対して透析した。

【００４０】（５）ステップ５：フェニルセファロース
ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィー ステップ４の透析液を、１．０Ｍ硫酸アンモニウムを含
む緩衝液Ａで平衡化されたフェニルセファロースＣＬ−
４Ｂカラム（ファルマシア社）（２．３×１３ｃｍ）に
供し、緩衝液Ａ中の１．０〜０Ｍ硫酸アンモニウムの直
線グラジエントで溶出した。活性画分は、硫安沈殿（８
０％飽和）により濃縮した。遠心により沈殿を採取し、
必要最少量の緩衝液Ａに溶解し、緩衝液Ａに対して透析
した。

【００４１】（６）精製の結果 前記の各ステップによる精製の結果を、表２に示す。

【００４２】

【表２】 表２ ＧＧＴの精製 ──────────────────────────────────── 全タンパク質（mg） 全活性（Ｕ） 比活性（U/mg） ──────────────────────────────────── Ｔ Ｈ Ｔ Ｈ ──────────────────────────────────── 粗酵素液 27,200 1,140 537 0.0420 0.0197 硫安沈殿^* 2,340 17,700 291 9.73 0.124 DEAE-セファテ゛ックスA-50 240 600 76.8 2.50 0.320 セルロファインGC700-m 144 369 43.3 2.56 0.300 ギガパイト 19.8 240 28.0 12.0 1.4 フェニルセファロースCL-4B 0.92 8.10 0.700 9.00 0.760 ──────────────────────────────────── *：60〜80％飽和 Ｔ:ペプチド転移活性 Ｈ：加水分解活性

【００４３】最終的に、ＧＧＴはペプチド転移活性で２
１４倍上昇し、収率は０．７１％であった。最終精製品
を非還元条件下での３０〜４％グラジエント ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（native-PAGE）で観察したと
ころ、単一のバンドが認められ、ほぼ単一にまで精製さ
れたことが確認された（図１）。また、還元条件下での
１１．６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS-PAGE）で観察したところ、二本のバンドが認めら
れた（図２）。これらの結果から、アスペルギルス・オ
リゼIAM2706株が産生するＧＧＴは、分子量約40,000の
大サブユニットと、分子量約20,000の小サブユニットか
らなるオリゴマーであることが示された。

【００４４】＜４＞ＧＧＴの性質の解析 上記のようにして得られたＧＧＴの酵素学的性質を調べ
た。

【００４５】（１）耐塩性 表１に示す反応液に、ＮａＣｌを０〜１８％となるよう
に加え、精製ＧＧＴの酵素活性を測定した。結果を図３
に示す。この結果から明らかなように、アスペルギルス
・オリゼIAM2706株が産生するＧＧＴは、高塩濃度下で
も高い残存活性を示し、ＮａＣｌ非存在下での活性に対
し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０％以上の加水分解活
性、又は１００％又はそれ以上のペプチド転移活性を示
した。特に、ペプチド転移活性は、食塩濃度の増加に伴
って活性が上昇した（図３三角印）。

【００４６】（２）耐塩性へのｐＨの影響 表１に示す反応液において、グリシルグリシン溶液及び
Tris-HCl緩衝液のｐＨを７．２、７．４、８．０、８．
５及び８．７に調整し、ＮａＣｌを１８％となるように
加え、酵素活性を測定した。結果を図４に示す。その結
果、ペプチド転移活性及び加水分解活性のいずれも、前
記範囲においてはｐＨが高くなるにつれて概ね上昇し
た。

【００４７】（３）Ｎ末端アミノ酸配列 精製ＧＧＴから、 上記の条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって大サブユニット及び小サブユニットに分離した。
得られた大サブユニット及び小サブユニットについて、
通常の方法にてＰＶＤＦ膜にうつしとり、そのＮ末端ア
ミノ酸配列を、ペプチドシークエンサーを用いて決定し
た。大サブユニットのＮ末端アミノ酸配列を配列表の配
列番号１に、小サブユニットのＮ末端アミノ酸配列を配
列番号２に示す。尚、大サブユニットのＮ末端第一アミ
ノ酸残基は判読できなかった。

【００４８】上記アミノ酸配列を、公知のＧＧＴのＮ末
端アミノ酸配列を比較した結果を、図５に示す。アスペ
ルギルス・オリゼのＧＧＴは、バチルス属細菌のＧＧＴ
と、少なくともＮ末端において高い相同性を示した。

【００４９】

【発明の効果】本発明により、アスペルギルス・オリゼ
由来の新規なγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｇ
ＧＴ）が提供される。本発明のＧＧＴは耐塩性が高く、
味噌や醤油等の食品中でも酵素活性を示すことができる
ので、これらの食品の呈味の改善に利用することが期待
される。

【００５０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（AJINOMOTO CO., INC.） <120> γ−グルタミルトランスペプチダーゼ <130> P-7157 <140> <141> 2000-01-31 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５１】 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <220> <221> UNSURE <222> (18) <223> indistinct <400> 1 Asn Lys Val Ala Val Gly Lys Asp Gly Met Val Ala Thr Ala His Pro 1 5 10 15 Leu Ala

【００５２】 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <220> <221> UNSURE <222> (1) <223> Xaa=Thr or Lys <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> indistinct <220> <221> UNSURE <222> (23) <223> Xaa=Leu or Asn <220> <221> UNSURE <222> (24) <223> Xaa=Phe or Leu <400> 2 Xaa Thr His Phe Thr Val Ala Asp Gln Trp Gly Asn Val Val Ser Phe 1 5 10 15 Thr Thr Thr Ile Glu Gln Xaa Xaa Gly 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のＧＧＴの非還元条件下でのポリアク
リルアミドゲル電気泳動写真。

【図２】 本発明のＧＧＴの還元条件下でのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動写真。右のレーンは分子
量マーカー（ＬＭＷ泳動マーカー（ファルマシア
製））。

【図３】 本発明のＧＧＴの耐塩性を示す図。縦軸はＮ
ａＣｌを含まないときの活性に対する相対活性を、横軸
はＮａＣｌ濃度を示す。三角印はペプチド転移活性を、
●は加水分解活性を表す。

【図４】 本発明のＧＧＴの耐塩性に与えるｐＨの影響
を示す図。左縦軸はペプチド転移活性を、右縦軸は加水
分解活性を、横軸はｐＨをそれぞれ表す。△は食塩無添
加でのペプチド転移活性を、黒三角印は１８％ NaCl添
加でのペプチド転移活性を、○は食塩無添加での加水分
解活性を、●は１８％ NaCl添加でのペプチド転移活性
を、それぞれ表す。

【図５】 各種ＧＧＴのＮ末端アミノ酸配列の比較を示
す図。Ａは大サブユニットを、Ｂは小サブユニットを示
す。(・)は不明確であることを、(・/・)はいずれのアミノ
酸残基か不明であることを示す。反転文字は、共通する
アミノ酸残基を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有するγ−グルタミルトラン
   スペプチダーゼ。 （１）作用：ペプチドまたはアミノ酸にγ−グルタミル
   基を転移する反応、又は、γ−グルタミル化合物を加水
   分解する反応を触媒する。 （２）至適ｐＨ：１８％ＮａＣｌ存在下でｐＨ８以上。 （３）耐塩性：約ｐＨ８．７において、ＮａＣｌ非存在
   下での活性に対し、１８％ＮａＣｌ存在下で５０％以上
   の加水分解活性、又は１００％又はそれ以上のペプチド
   転移活性を示す。 （４）電気泳動により観察される性質： 非還元条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳
   動でほぼ単一のバンドを形成する。 還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
   電気泳動で、約４０ｋＤａ及び約２０ｋＤａの二本のバ
   ンドを形成する。
2. 【請求項２】 前記γ−グルタミルトランスペプチダー
   ゼは大サブユニットと小サブユニットからなり、大サブ
   ユニットはＮ末端アミノ酸配列中に配列番号１のアミノ
   酸番号５〜１７のアミノ酸配列を含み、小サブユニット
   はＮ末端アミノ酸配列中に配列番号２のアミノ酸番号２
   〜１４のアミノ酸配列を、それぞれ含むことを特徴とす
   る請求項１記載のγ−グルタミルトランスペプチダー
   ゼ。
3. 【請求項３】 アスペルギルス属由来である請求項１又
   は２記載のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ。
4. 【請求項４】 アスペルギルス・オリゼ由来である請求
   項３記載のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ。
5. 【請求項５】 アスペルギルス・オリゼＩＡＭ２７０６
   株由来である請求項４記載のγ−グルタミルトランスペ
   プチダーゼ。