WO2023176943A1 - 改変型プロテイングルタミナーゼ - Google Patents

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WO2023176943A1
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amino acid
residue
substitution
acid residue
protein glutaminase
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篤 大野
和典 吉田
龍太郎 有吉
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天野エンザイム株式会社
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a modified protein glutaminase. More specifically, the invention relates to protein glutaminases that have been modified to have improved oxidative stability.
  • Protein glutaminase is an enzyme that acts on proteins, which are macromolecules, and catalyzes a reaction that decomposes amide group-containing side chains (that is, deamidates) without cleavage of peptide bonds or crosslinking of proteins. Protein glutaminase generates negatively charged carboxyl groups by deamidating glutamine residues in proteins, thereby causing various changes in the properties of proteins. For example, an increase in hydration force and an increase in electrostatic repulsion due to a decrease in the isoelectric point of a protein reduce the interaction between proteins (i.e., decrease the associativity), thereby reducing the solubility of the protein and the increase in electrostatic repulsion. Increase dispersibility.
  • protein glutaminase can greatly change the properties of proteins in this way, it has dramatically increased the uses of proteins. For this reason, protein glutaminase is extremely useful and has attracted great interest in the technical field.
  • Non-Patent Document 1 The first protein glutaminase discovered was found in Chryseobacterium proteolyticum in 2000 (Non-Patent Document 1). After that, for a long time, C. Protein glutaminase derived from C. proteolyticum is the only one that is used industrially as an active ingredient in protein glutaminase enzyme preparations.
  • an object of the present invention is to provide protein glutaminase with improved oxidative stability.
  • the present inventors have found that the oxidative stability of protein glutaminase can be improved (specifically, the residual activity of protein glutaminase after hydrogen peroxide treatment can be improved compared to that of wild-type protein glutaminase). Discovered a new mutation.
  • the present invention was completed based on this knowledge. That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
  • Item 1 A modified protein glutaminase consisting of a polypeptide shown in any of the following (I) to (III): (I) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (A) substitution of the 121st amino acid residue with a valine residue or alanine residue, (B) substitution of the 142nd amino acid residue with a cysteine residue, or substitution with aspartic acid residue, (C) substitution of amino acid residue at position 22 with tyrosine residue, (D) substitution of amino acid residue at position 26 with tyrosine residue or cysteine residue, (E) Substitution of the 30th amino acid residue with a threonine residue, (F) Substitution of the 33rd amino acid residue with a valine residue, (G) Substitution of the 35th amino acid residue with a serine residue (H) Substitution of the 36th amino acid residue with an isoleucine residue, (I) Substitution of the 43rd amino acid residue with a phenylalanine residue, (
  • polypeptide In the amino acid sequence into which at least one of the substitutions shown in (A) to (Q) has been introduced, one or more amino acid residues other than the substituted amino acid residue are substituted, added, or inserted. or a polypeptide in which the residual activity of protein glutaminase after hydrogen peroxide treatment is higher than that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (III) the above ( In the amino acid sequence into which at least one of the substitutions shown in A) to (Q) has been introduced, the sequence identity of the portion excluding the substituted amino acid residue is 70% or more, and after hydrogen peroxide treatment.
  • Item 2. Item 1. DNA encoding the modified protein glutaminase according to item 1.
  • Item 3. Item 2.
  • An expression cassette or recombinant vector comprising the DNA according to item 2.
  • Item 4. A transformant obtained by transforming a host using the expression cassette or recombinant vector according to item 3.
  • a method for producing a modified protein glutaminase comprising the step of culturing the transformant according to item 4.
  • Item 6. Item 2.
  • An enzyme agent comprising the modified protein glutaminase according to item 1. Section 7.
  • a modifier for protein materials comprising the modified protein glutaminase according to item 1.
  • Section 8. Item 2. A method for producing a modified protein material, comprising a step of causing the modified protein glutaminase according to item 1 to act on the protein material.
  • a modified protein glutaminase with improved oxidative stability is provided.
  • glycine G
  • alanine A
  • valine Val
  • Leu L
  • isoleucine I
  • Phe phenylalanine
  • Tyr tyrosine
  • Trp tryptophan
  • S serine
  • Thr threonine
  • C cysteine
  • M methionine
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • Asparagine (Asn) is N
  • glutamine (Gln) is Q
  • lysine (Lys) is K
  • arginine (Arg) is R
  • histidine His
  • Pro proline
  • the left end of the amino acid sequences shown is the N-terminus, and the right end is the C-terminus.
  • nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • substitution refers not only to artificially introduced substitutions of amino acid residues, but also to cases where amino acid residue substitutions are naturally introduced, that is, when amino acid residues are originally different. This also includes cases where In this specification, substitution of amino acid residues may be artificial or natural substitutions, but artificial substitutions are preferred.
  • modified protein glutaminase The modified protein glutaminase of the present invention consists of a polypeptide shown in any one of (I) to (III) below.
  • polypeptide consisting of a sequence (II) In the amino acid sequence into which at least one of the substitutions shown in (A) to (Q) has been introduced, one or more amino acid residues other than the substituted amino acid residue are substituted, added, or inserted. or a polypeptide in which the protein glutaminase residual activity after hydrogen peroxide treatment is higher than the residual activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (III) the above ( In the amino acid sequence into which at least one of the substitutions shown in A) to (Q) has been introduced, the sequence identity of the portion excluding the substituted amino acid residue is 70% or more, and after treatment with hydrogen peroxide. A polypeptide having a protein glutaminase residual activity that is higher than that of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the mature sequence of the full-length sequence (sequence including a signal sequence and a pro sequence) of protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum shown in SEQ ID NO: 2.
  • polypeptides (I) to (III) above may be polypeptides containing only one of the substitutions (A) to (Q) (a single substitution product of protein glutaminase derived from C. proteolyticum), or may be a polypeptide containing two or more substitutions of C. proteolyticum-derived protein glutaminase. It may be a polypeptide (multiple substitution product of protein glutaminase derived from C. proteolyticum) containing a combination of the following.
  • preferred examples include (A), (B), (D), (F), (G) among the substitutions (A) to (Q) above.
  • substitutions examples include polypeptides containing (C) and (O) substitutions.
  • the specific amino acid sequence of a polypeptide having a valine residue substitution among the substitutions of (A) is shown in SEQ ID NO: 3
  • the specific amino acid sequence of a polypeptide having an alanine residue substitution The specific amino acid sequence of the polypeptide having cysteine residue substitution among the substitutions (B) is shown in SEQ ID NO: 5
  • the specific amino acid sequence of the polypeptide having aspartic acid residue substitution among the substitutions (B) is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:6.
  • the amino acid modification introduced may include only one type of modification (for example, only substitution) from among substitution, addition, insertion, and deletion, or two types of modification may be included.
  • the above modifications for example, substitutions and insertions
  • the number of amino acid differences at any difference site may be one or several, for example, 1 to 18, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 8. , 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, particularly preferably 1, 2, or 1.
  • sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be 70% or more, preferably 80% or more, or 85% or more, more preferably 90% or more. , or 93% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 98.5% or more, or 99% or more, particularly preferably 99.3% or more, or 99.5% or more can be mentioned.
  • sequence identity refers to BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI) ]'s bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol .Lett., Vol. 174, p247-250, 1999).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • polypeptides (II) and (III) above corresponding to position 42 (cysteine residue), position 83 (histidine residue) and position 103 (aspartic acid residue) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Since the amino acid residues that are present are considered to be active catalytic residues, it is desirable not to introduce substitutions or deletions at these sites.
  • substitutions in the polypeptides (II) and (III) above include, for example, if the amino acid before substitution is a non-polar amino acid, substitution with another non-polar amino acid, and even if the amino acid before substitution is a non-charged amino acid.
  • substitutions with another uncharged amino acid substitution with another acidic amino acid if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, and substitution with another basic amino acid if the amino acid before substitution is a basic amino acid. Can be mentioned.
  • polypeptides (II) and (III) above include C.
  • examples include polypeptides in which the above substitutions are introduced into protein glutaminase related to protein glutaminase derived from C. proteolyticum.
  • the related protein glutaminase to which the substitution is introduced includes, for example, Chryseobacterium sp. Protein glutaminase derived from Chryseobacterium sp.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, which is the mature sequence of derived protein glutaminase, or the amino acid residue at position 115 of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 is another amino acid residue (for example, a serine residue)
  • Examples include amino acid sequences substituted with.
  • SEQ ID NO: 7 has 86.9% sequence identity to SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 8 has 87.4% sequence identity to SEQ ID NO: 1.
  • the full-length sequence of SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the full-length sequence of SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the polypeptides shown in (I) to (III) above have protein glutaminase activity and improved oxidative stability.
  • the property of improved oxidative stability means that the residual activity of protein glutaminase after hydrogen peroxide treatment is higher than that of the polypeptide (wild-type protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a property that is improved over the residual activity specifically, the residual activity when 0.1 mg/mL of the polypeptide aqueous solution is treated with hydrogen peroxide at a final concentration of 0.001% at 37°C for 1 hour.
  • the activity (hereinafter also referred to as "residual activity A 0.001% after oxidation treatment”) is more than twice the residual activity A 0.001% after oxidation treatment of wild-type protein glutaminase.
  • Preferred examples of the oxidative stability of the polypeptides shown in (I) to (III) above include a residual activity A of 0.001% after oxidation treatment that is three times or more of the residual activity A of 0.001% after oxidation treatment of wild-type protein glutaminase; More preferably 4 times or more, still more preferably 5 times or more, even more preferably 5.5 times or more.
  • the upper limit of the residual activity A after oxidation treatment of 0.001% of the polypeptides shown in (I) to (III) above is not particularly limited, but for example, it is 20 times or less of the residual activity A after oxidation treatment of wild type protein glutaminase of 0.001%, Or 10 times or less.
  • the property of improved oxidative stability of the polypeptides shown in (I) to (III) above was evaluated by adding hydrogen peroxide at a final concentration of 0.0025% to 0.1 mg/mL of the polypeptide aqueous solution at 37°C.
  • residual activity B after oxidation treatment B 0.0025% When expressed as residual activity (hereinafter also referred to as "residual activity B after oxidation treatment B 0.0025% ") when treated for a period of time, the residual activity B 0.0025% after oxidation treatment of wild type protein glutaminase is, for example, 5 times or more, preferably 7 times or more. More preferably, it is 10 times or more, and still more preferably 20 times or more.
  • the upper limit of the residual activity B after oxidation treatment of polypeptides shown in (I) to (III) above 0.0025% is not particularly limited, but for example, it is 60 times or less of the residual activity B 0.0025% after oxidation treatment of wild-type protein glutaminase. , or 50 times or less.
  • the specific activities of the polypeptides shown in (I) to (III) above are not particularly limited, the specific activities of the polypeptides shown in (I) to (III) above at 37°C are If the specific activity at 37°C of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in number 1 (wild-type protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum) is 100%, for example, 20% or more, 40% or more, Or 60% or more.
  • the preferable specific activity of the polypeptide shown in (I) to (III) above is a ratio equivalent to that of the polypeptide (wild-type protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Activity is mentioned. Specifically, the equivalent specific activity is the specific activity at 37°C of the polypeptide shown in (I) to (III) above, and the specific activity at 37°C of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the relative activity is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 100% or more, and even more preferably 105% or more, when the specific activity is 100%.
  • protein glutaminase activity uses Z-Gln-Gly (benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine) as a substrate, and the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute is 1 unit (1 U).
  • the modified protein glutaminase of the present invention may be further used as an active ingredient of the enzyme agent described below, and may also be used as a peptide or protein consisting of other amino acid sequences (hereinafter also referred to as "other proteins, etc.”). It may also be used to form part of a larger protein that is integrated with the protein in the form of a fusion protein or the like. Examples of such other proteins include peptides used for protein purification, such as polyhistidine residues, and peptides derived from additional sequences to ensure stability of mRNA during recombinant production. can be mentioned.
  • DNA of the present invention is a DNA encoding the modified protein glutaminase described in "1. Modified protein glutaminase" above.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it has a base sequence encoding a modified protein glutaminase consisting of the polypeptides (I) to (III) described in "1. Modified protein glutaminase" above.
  • the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum
  • SEQ ID NO: 11 protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum
  • Examples of the DNA of the present invention include DNAs shown in any of [i] to [iii] below.
  • DNA consisting of a base sequence into which a substitution has been introduced [ii] A DNA encoding a polypeptide whose protein glutaminase residual activity after hydrogen peroxide treatment is higher than that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a complementary base sequence to the DNA shown in FIG. A DNA encoding a polypeptide having improved residual activity compared to the above-mentioned residual activity, and having 70% or more homology with the DNA shown in [i] above.
  • a specific base sequence of DNA having a substitution with a base sequence encoding a valine residue among the substitutions in [a] is shown in SEQ ID NO: 12, and a base sequence encoding an alanine residue.
  • the specific base sequence of the DNA having the substitution according to the sequence is shown in SEQ ID NO: 13
  • the specific base sequence of the DNA having the substitution with the base sequence encoding a cysteine residue among the substitutions [b] is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the specific base sequence of the DNA having the substitution with the base sequence encoding an aspartic acid residue is shown in SEQ ID NO: 15.
  • stringent conditions refers to 0.5% SDS, 5x Denhartz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400] and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA at 50°C to 65°C in 6x SSC (1x SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0). Conditions for keeping warm for 4 hours to overnight.
  • hybridization under stringent conditions is performed by the following method. That is, a nylon membrane on which a DNA library or cDNA library was immobilized was prepared, and the membrane was incubated at 65°C in a prehybridization solution containing 6x SSC, 0.5% SDS, 5x Denharz, and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA. Blocking nylon membrane. Thereafter, each probe labeled with 32 P is added and kept at 65°C overnight. The nylon membrane was coated in 6x SSC for 10 min at room temperature, in 2x SSC containing 0.1% SDS for 10 min at room temperature, and in 0.2x SSC containing 0.1% SDS for 30 min at 45°C. After washing, autoradiography can be performed to detect DNA specifically hybridized with the probe.
  • the homology may be 70% or more, preferably 80% or more, or 85% or more, more preferably 90% or more, or 93% or more, and even more preferably 95% or more. % or more, more preferably 98% or more, even more preferably 98.5% or more, or 99% or more, particularly preferably 99.3% or more, or 99.5% or more.
  • the "homology" of DNA is calculated using publicly available or commercially available software with an algorithm that compares a reference sequence with a query sequence.
  • BLAST, FASTA, GENETYX manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • GENETYX manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • the DNA of the present invention is, for example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (that is, protein glutaminase derived from C. proteolyticum) or a protein glutaminase related thereto (as mentioned above, specific examples include Chryseobacterium sp., and As a specific example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, or the amino acid residue at position 115 of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 is substituted with another amino acid residue (for example, a serine residue).
  • the DNA of the present invention can also be artificially synthesized by a total gene synthesis method.
  • the base sequence portion can be extracted from a nucleic acid construct such as a plasmid into which the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 has been incorporated by a conventional method using PCR. can be obtained.
  • the nucleic acid construct can incorporate, in addition to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, a sequence in which a signal sequence and a pro sequence are added to the 5' end of the base sequence. A sequence to which such a signal sequence and a pro sequence are added is C.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 which encodes the full-length sequence of protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum, and the Chryseobacterium sp.
  • Examples include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18, which respectively encode the full-length sequence of the derived protein glutaminase.
  • Methods for introducing mutations into genes and artificially modifying amino acid sequences include known methods such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, and mutation introduction kits using site-directed mutagenesis methods, such as QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio Inc.) etc. can be used. .
  • the DNA of the present invention includes various types of DNA derived from codon degeneracy. Artificial production of various types of DNA encoding the same amino acid sequence can be easily performed using known genetic engineering techniques. For example, in the production of a protein by genetic engineering, if the codons used in the original gene encoding the target protein are infrequently used in the host, the amount of protein expressed may be low. There is. In such cases, high expression of the target protein can be achieved by optimizing the codon usage frequency for the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • the total host optimal codon usage frequency for each codon may be adopted.
  • the optimal codon is defined as the most frequently used codon among the codons corresponding to the same amino acid.
  • the codon usage frequency is not particularly limited as long as it is optimized for the host, and examples of optimal codons for E. coli include the following.
  • F phenylalanine (ttt), L: leucine (ctg), I: isoleucine (att), M: methionine (atg), V: valine (gtg), Y: tyrosine (tat), stop codon (taa), H: histidine (cat), Q: glutamine (cag), N: asparagine (aat), K: lysine (aaa), D: aspartic acid (gat), E: glutamic acid (gaa), S: serine (agc), P: Proline (ccg), T: threonine (acc), A: alanine (gcg), C: cysteine (tgc), W: tryptophan (tgg), R: arginine (cgc), G: glycine (ggc).
  • Confirmation of the base sequence of DNA in which a mutation has been introduced can be performed by sequencing using a conventional method.
  • Specific sequencing methods include the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463), or the sequence analysis method using an appropriate DNA sequencer. It will be done.
  • methods for confirming whether the DNA encodes the polypeptide of interest include comparing the determined base sequence with an unsubstituted base sequence such as the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, or A method of comparing the amino acid sequence deduced from the base sequence obtained with the unsubstituted amino acid sequence such as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • Expression cassette or recombinant vector contains the DNA of the present invention described in "2. DNA" above.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention can be obtained by linking a promoter and terminator to the DNA of the present invention, or by inserting the expression cassette of the present invention or the DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention may contain transcription elements such as a promoter and a terminator, as well as enhancers, CCAAT boxes, TATA boxes, SPI sites, etc., as necessary. good. These control factors only need to be operably linked to the DNA of the present invention. Operably linked means that various control factors that regulate the DNA of the present invention and the DNA of the present invention are linked in a state in which they can operate in a host cell.
  • expression vectors constructed for genetic recombination from phages, plasmids, or viruses that can autonomously propagate within the host are suitable.
  • Such expression vectors are known.
  • commercially available expression vectors include pQE-based vectors (Qiagen Corporation), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Biosciences Inc.), and pET-based vectors (Merck Co., Ltd.), etc.
  • the expression vector may be used in an appropriate combination with the host cell.
  • E. coli when using E. coli as the host cell, a combination of a pET vector and a DH5 ⁇ E. coli strain, a pET vector and a BL21(DE3) E. coli strain, Examples include a combination of strains, or a combination of pDR540 vector and JM109 E. coli strain.
  • Transformant of the present invention is obtained by transforming a host with the expression cassette or recombinant vector of the present invention described in "3. Expression cassette or recombinant vector" above.
  • the host used for the production of the transformant of the present invention is one in which the gene can be introduced, the expression cassette or recombinant vector is stable, and the host is capable of autonomous reproduction and expresses the characteristics of the gene containing the DNA of the present invention.
  • Escherichia genus such as Escherichia coli
  • Bacillus genus such as Bacillus subtilis
  • Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida
  • Chryseobacterium proteolytica etc.
  • bacteria belonging to the genus Chryseobacterium such as Chryseobacterium proteolyticum, yeast, etc., but animal cells, insect cells, plant cells, etc. may also be used.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention into a host.
  • the location where the DNA of the present invention is introduced is not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention include, for example, the recombinant vector method and the genome editing method.
  • Conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector into the host may be appropriately set depending on the type of host and the like. If the host is a bacterium, examples include a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, and the like.
  • examples include electroporation, spheroplast method, and lithium acetate method.
  • examples include electroporation method, calcium phosphate method, and lipofection method.
  • examples include the calcium phosphate method, lipofection method, and electroporation method.
  • examples include electroporation method, Agrobacterium method, particle gun method, and PEG method.
  • Confirmation of whether the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention has been integrated into a host can be performed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like.
  • the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention may be isolated and purified from the transformant. .
  • the expression cassette or recombinant vector is isolated and purified based on a lysate obtained by lysing the bacterium.
  • a method for bacteriolysis for example, treatment is performed with a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, protease, other enzymes, and a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) are used in combination.
  • Isolation and purification of DNA from a lysate can be carried out, for example, by appropriately combining protein removal treatment using phenol treatment and protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation treatment, and commercially available kits.
  • DNA cleavage can be performed according to conventional methods, for example, using restriction enzyme treatment.
  • restriction enzyme for example, a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence is used.
  • the DNA and the expression cassette or expression vector are joined using, for example, DNA ligase.
  • primers specific to the DNA of the present invention are designed and PCR is performed.
  • the amplification product obtained by PCR is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., and stained with ethidium bromide and SYBR Green solution, etc., and the amplification product is detected as a band. You can confirm that it has been converted.
  • amplification products can also be detected by performing PCR using primers that have been labeled in advance with a fluorescent dye or the like. Furthermore, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and confirming the amplification product by fluorescence, enzyme reaction, etc. may also be adopted.
  • the method for producing modified protein glutaminase of the present invention is a method for producing the enzyme described in "1. Modified protein glutaminase" above, which comprises the step of culturing the transformant of the present invention. including.
  • the method includes a step of culturing a microorganism that produces the modified protein glutaminase. Modified protein glutaminase can be obtained by the production method.
  • the above culture conditions may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the transformant or the microorganism, but liquid culture is preferably used. Furthermore, in the case of industrial production, aerated agitation culture is preferred.
  • the nutrient source for the medium those required for the growth of the transformant or the microorganism can be used.
  • the carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid.
  • the nitrogen source may be any assimilable nitrogen compound, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, and specific vitamins may be used as necessary. You may.
  • the culture temperature can be appropriately set within a range in which the transformant or the microorganism of the present invention can grow and the transformant or the microorganism produces modified protein glutaminase, but is preferably 15 to 37°C. That's about it. Culturing may be completed at an appropriate time, taking into consideration the time when the modified protein glutaminase reaches its maximum yield, and usually the culturing time is about 12 to 48 hours.
  • the culture solution is subjected to a method such as centrifugation, and the culture supernatant and/or bacterial cells are collected.
  • the bacterial cells are treated with mechanical methods such as ultrasound or French press, or with lytic enzymes such as lysozyme, and if necessary, by using enzymes such as protease or surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS).
  • a water-soluble fraction containing a predetermined modified protein glutaminase can be obtained.
  • the expressed modified protein glutaminase can be secreted into the culture medium.
  • the water-soluble fraction containing modified protein glutaminase obtained as described above may be subjected to purification treatment as it is, but it may be subjected to purification treatment after concentrating the modified protein glutaminase in the water-soluble fraction. Good too. Concentration can be performed, for example, by vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment, fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent (eg, methanol, ethanol, and acetone), and the like.
  • a hydrophilic organic solvent eg, methanol, ethanol, and acetone
  • the purification treatment of the modified protein glutaminase can be carried out, for example, by appropriately combining methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the purified modified protein glutaminase may be powdered by freeze-drying, vacuum drying, spray drying, etc., if necessary.
  • the enzyme agent -modified protein glutaminase can be provided in the form of an enzyme agent. Therefore, the present invention also provides an enzyme preparation containing the modified protein glutaminase described in "1. Modified protein glutaminase" above as an active ingredient.
  • the content of modified protein glutaminase in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but the lower limit of the content is, for example, 1 U/g or more, preferably 10 U/g or more, more preferably 50 U/g or more, and even more preferably is 100 U/g or more, particularly preferably 200 U/g or more.
  • the upper limit of the content is, for example, 10000 U/g or less, preferably 5000 U/g or less, more preferably 2000 U/g or less, still more preferably 1000 U/g or less, particularly preferably 800 U/g or less.
  • the enzyme preparation of the present invention may or may not contain other components other than the modified protein glutaminase to the extent that the effects of the present invention are not affected.
  • other components include enzymes other than the modified protein glutaminase, additives, culture residues produced by the above production method, and the like.
  • enzymes include, for example, amylase ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidase ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase), galactosidase ( ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase), protease (acidic protease, (protease, alkaline protease), peptidase (leucine peptidase, aminopeptidase), lipase, esterase, cellulase, phosphatase (acid phosphatase, alkaline phosphatase), nuclease, deaminase, oxidase, dehydrogenase, glutaminase, pectinase, catalase, dextranase, trans Examples include glutaminase, protein deamidase (other than the above-mentioned modified protein glutaminas
  • additives include excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, and the like.
  • Excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, white sugar, glycerol, and the like.
  • Buffers include phosphates, citrates, acetates, and the like.
  • Stabilizers include propylene glycol, ascorbic acid, and the like.
  • Preservatives include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • preservatives include ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like. These additives may be contained singly or in combination.
  • Examples of the culture residue include components derived from the medium, contaminant proteins, bacterial body components, and the like.
  • the form of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples include liquid form and solid form (powder, granules, etc.).
  • the enzyme agent in the form described above can be prepared by a generally known method.
  • modified protein glutaminase described above can be used for known uses of protein glutaminase.
  • modified protein glutaminase can be used for the purpose of modifying protein materials.
  • the present invention also provides modifiers for protein materials containing modified protein glutaminase.
  • the specific mode of modification of protein materials is not particularly limited, and proteins produced by deamidation of ⁇ -amide and ⁇ -amide groups of glutamine and asparagine residues of proteins to generate carboxyl groups. It suffices if the characteristic change is as follows. Specifically, modifications of protein materials include increasing protein solubility, increasing water dispersibility, improving emulsifying power, and emulsifying stability. A specific method for using the modifier for protein materials is as described in "8. Method for producing modified protein materials" below.
  • modified protein glutaminase can be used for the purpose of modifying protein materials. Therefore, the present invention also provides a method for producing a modified protein material, which includes a step of causing the modified protein glutaminase to act on the protein material.
  • a mixture containing a protein material and a modified protein glutaminase is subjected to the action conditions of the modified protein glutaminase, thereby allowing a reaction to modify the protein to proceed.
  • the protein material is not particularly limited as long as it contains protein, and may be either edible or non-edible.
  • Edible protein materials can be used as food and drink products or as materials for producing food and drink products.
  • Inedible protein materials can be used as materials for protein experiments, medical materials, fiber materials, cosmetic materials, and the like.
  • protein materials include the protein source itself and preparations obtained by processing the protein source to increase the protein content by known methods, and these are appropriately selected by those skilled in the art.
  • edible protein materials include preparations obtained from foods containing vegetable proteins as vegetable protein materials; preparations prepared from foods containing animal proteins as animal protein materials.
  • Edible vegetable proteins include bean proteins such as soybean protein, fava bean protein, pea protein, chickpea protein, mung bean protein, and lupine bean protein; grain proteins such as wheat protein, rye protein, oat protein, and corn protein; and canary protein.
  • Seed proteins include seeds, flaxseed, almonds, cashews, hazelnuts, pecans, macadamia nuts, pistachios, walnuts, Brazil nuts, peanuts, coconuts, hemp seeds (industrial hemp), pili nuts, chestnuts, sesame seeds, pine nuts, etc. It will be done.
  • Edible animal proteins include meat, fish, eggs, and milk proteins.
  • inedible protein materials include albumin, globulin, etc. derived from biological samples such as egg white and serum; silk, wool, etc.
  • the protein content in these protein materials is not particularly limited, but for example, 30% by weight or more, 40% by weight or more, or 50% by weight or more, preferably 60% by weight or more, more preferably 70% by weight or more, and Preferably it is 80% by weight or more.
  • the upper limit of the protein content in the protein material is not particularly limited, but examples include 95% by weight or less, 90% by weight or less, 85% by weight or less, 80% by weight or less, 70% by weight or less, or 60% by weight or less. It will be done.
  • the content of the protein material in the mixture is such that the concentration of protein contained in the protein material in the mixture is, for example, 0.1% by weight or more, or 0.3% by weight or more, preferably 0.7% by weight or more, or more. Preferably, the amount is 1.4% by weight or more.
  • the upper limit of the concentration in the mixture of proteins contained in the protein material is not particularly limited, but for example, 80% by weight or less, 60% by weight or less, 40% by weight or less, 30% by weight or less, 20% by weight or less, 15% by weight or less. % or less, 10% by weight or less, 8% by weight or less, 5% by weight or less, 3% by weight or less, or 2% by weight or less.
  • the amount of modified protein glutaminase used is not particularly limited, but the amount of modified protein glutaminase used per 1 g of protein contained in the protein material is, for example, 0.1 U or more, preferably 0.5 U or more, more preferably 1 U or more. , more preferably 2U or more, even more preferably 3.5U or more, even more preferably 4.5U or more.
  • the upper limit of the amount of modified protein glutaminase used per gram of protein contained in the protein material is not particularly limited, but examples include 45 U or less, 35 U or less, 20 U or less, 10 U or less, 8 U or less, or 5.5 U or less. .
  • the amount of modified protein glutaminase used per 1 g of protein material is, for example, 0.01 U or more, 0.05 U or more, or 0.1 U or more, preferably 0.5 U or more, more preferably 1 U or more, and still more preferably Examples include 2U or more, more preferably 3U or more, even more preferably 4U or more.
  • the upper limit of the amount of modified protein glutaminase used per 1 g of protein material is not particularly limited, and examples thereof include 40 U or less, 30 U or less, 20 U or less, 10 U or less, 7 U or less, or 5 U or less.
  • the operating conditions of the modified protein glutaminase are appropriately determined based on the optimal temperature and pH of the modified protein glutaminase used.
  • the temperature conditions can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the optimum temperature of the modified protein glutaminase.
  • Specific temperature conditions include, for example, 40 to 70°C, preferably 48 to 67°C, more preferably 53 to 65°C, even more preferably 57 to 63°C.
  • the pH condition can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the optimum pH of the modified protein glutaminase.
  • Specific pH conditions include, for example, 2 to 12, preferably 3 to 10, and more preferably 4 to 9.
  • the time for which the modified protein glutaminase is allowed to act is not particularly limited and may be determined as appropriate depending on the preparation scale, etc., but for example, 1 hour or more, preferably 8 hours or more, more preferably 16 hours or more, still more preferably 20 hours or more. More than time can be mentioned.
  • the upper limit of the time range is not particularly limited, but may be, for example, 40 hours or less, 30 hours or less, or 25 hours or less.
  • a modified protein material can be obtained by performing enzyme deactivation treatment, cooling, and performing post-treatment as necessary.
  • Test example 1 (1) Preparation of modified protein glutaminase C. Using the sequence (SEQ ID NO: 11) encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of protein glutaminase derived from C. proteolyticum as a template, various mutations were introduced to produce the following modified protein glutaminase.
  • PCR was performed in a conventional manner using the following primers and PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara) to introduce mutations.
  • (Primer for C121A mutation) Rv:5'- ATCTGTTACAGGACCGCTTGAAATAGTGAAGGATC -3' (SEQ ID NO: 21)
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed by a conventional method to obtain a gene expression vector.
  • the protein glutaminase sequence introduced into the gene expression vector was confirmed.
  • the transformant was cultured with shaking in LB medium at 37°C for 16 hours. Thereafter, the cells were subcultured into Terrific Broth and cultured at 37°C for 4 hours, then IPTG (final concentration 0.5mM) was added and cultured with shaking at 33°C for 20 hours.
  • Bacterial cells were collected from the culture solution, lysed using B-PER TM Bacterial Cell Lysis Reagent (manufactured by Thermo Scientific) according to a standard method, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes.
  • the collected centrifuged supernatant was used as a crude enzyme solution, and trypsin was added to give a final concentration of 50 ug/mL.
  • purification was performed using a standard method using TALON (R) Spin Columns (manufactured by Takara Bio). and used as an enzyme sample.
  • This solution was allowed to stand for 10 minutes to perform an enzyme reaction, and then 1 mL of a 0.4 mol/L trichloroacetic acid solution was added to stop the enzyme reaction.
  • a measurement blank was prepared by adding 0.1 mL of enzyme solution to a test tube, followed by adding 1 mL of 0.4 mol/L trichloroacetic acid solution and 1 mL of substrate solution in this order.
  • a color reaction was performed using Ammonia Test Wako (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and ammonia liberated by the enzymatic reaction for 10 minutes was quantified based on the absorbance value at a wavelength of 630 nm.
  • the ammonia concentration in the reaction solution was determined from a calibration curve representing the relationship between ammonia concentration and absorbance (630 nm) prepared using an ammonia standard solution (ammonium chloride).
  • the enzyme activity of protein glutaminase was calculated from the following formula, where 1 unit (1 U) is the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute.
  • the reaction liquid volume is 2.1
  • the enzyme solution volume is 0.1
  • Df is the dilution ratio of the enzyme solution.
  • 17.03 is the molecular weight of ammonia.
  • Test example 2 Using a random mutagenesis kit (Gene Morph II Random Mutagenesis kit, Diversify PCR Random Mutagenesis Kit, manufactured by Agilent), C. Random mutations were introduced into the sequence (SEQ ID NO: 11) encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of protein glutaminase derived from C. proteolyticum.
  • Gene Morph II Random Mutagenesis kit Diversify PCR Random Mutagenesis Kit, manufactured by Agilent
  • the mutated gene was inserted into the pET21a vector using In-Fusion (R) HD Cloning Kit (manufactured by Clontech). E. by conventional method. E. coli BL21 (DE3) was transformed, and the resulting transformant was cultured with shaking in LB medium at 37° C. for 16 hours. Thereafter, the cells were subcultured into Terrific Broth and cultured at 37°C for 4 hours, then IPTG (final concentration 0.5mM) was added and cultured with shaking at 33°C for 20 hours.
  • R In-Fusion
  • Bacterial cells were collected from the culture solution, lysed using B-PER TM Bacterial Cell Lysis Reagent (manufactured by Thermo Scientific) according to a standard method, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes. The collected centrifuged supernatant was used as a crude enzyme solution, and trypsin was added to give a final concentration of 50 ug/mL. After treatment at 37°C for 1 hour, purification was performed by a standard method using TALON (R) Spin Columns (manufactured by Takara Bio). and used as an enzyme sample.
  • B-PER TM Bacterial Cell Lysis Reagent manufactured by Thermo Scientific
  • SEQ ID NOS: 19-26 are primers.

Abstract

本発明は、酸化安定性が向上したプロテイングルタミナーゼを提供することを目的とする。配列番号１に示すアミノ酸配列において、（Ａ）第１２１位アミノ酸残基のバリン残基、又はアラニン残基への置換、及び（Ｂ）第１４２位アミノ酸残基のシステイン残基、又はアスパラギン酸残基への置換のうちの、少なくともいずれかの置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるプロテイングルタミナーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドより酸化安定性が向上している。

Description

改変型プロテイングルタミナーゼ
　本発明は、改変型プロテイングルタミナーゼに関する。より具体的には、本発明は、酸化安定性が向上するように改変されたプロテイングルタミナーゼに関する。
　プロテイングルタミナーゼは、高分子であるタンパク質に作用し、ペプチド結合の切断及びタンパク質の架橋を伴わずアミド基含有側鎖を分解する（つまり脱アミド化する）反応を触媒する酵素である。プロテイングルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化することで負電荷のカルボキシル基を生じるため、タンパク質に対し様々な特性変化をもたらす。例えば、タンパク質の等電点が低下することによる水和力の増加及び静電反撥力の上昇は、タンパク質間の相互作用を低下させ（すなわち会合性を低下させ）るため、タンパク質の可溶性及び水分散性を増大させる。また、タンパク質の高次構造が変化することによる内部疎水性領域の表出は、タンパク質に界面活性を付与するため、タンパク質の乳化力、乳化安定性、起泡性、泡沫安定性を向上させる。プロテイングルタミナーゼは、このようにタンパク質の特性を大きく変化させることができるため、タンパク質の用途を飛躍的に増大させてきた。このため、プロテイングルタミナーゼは非常に有用性が高く、当該技術分野で高い関心が寄せられてきた。
　最初に発見されたプロテイングルタミナーゼは、２０００年にＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍから見出されたものある（非特許文献１）。その後長きにわたり、Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼ酵素製剤の有効成分として唯一産業利用されている。
A novel protein-deamidating enzyme from Chryseobacterium proteolyticum sp. nov., a newly isolated bacterium from soil. Applied and Environmental Microbiology 2000; 66(8): 3337-43
　Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼは酸化安定性に乏しく、長期の保存が難しい。従って、Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼを取り扱う場合には、酸化されにくい環境における使用又は保管が必要となるのが現状である。
　一方で、プロテイングルタミナーゼの高い有用性から期待される用途の更なる拡大可能性等に鑑みると、長期保存できることが望ましく、そのためには、プロテイングルタミナーゼの酸化安定性を向上させることが望まれる。
　そこで、本発明は、酸化安定性が向上したプロテイングルタミナーゼを提供することを目的とする。
　本発明者は、鋭意検討の結果、プロテイングルタミナーゼにおいて、酸化安定性を向上できる（具体的には、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性を、野生型プロテイングルタミナーゼの当該残存活性より向上できる）新たな変異を見出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　以下の（I）から（III）のいずれかに示すポリペプチドからなる改変型プロテイングルタミナーゼ：
（I）配列番号１に示すアミノ酸配列において、（Ａ）第１２１位アミノ酸残基の、バリン残基、又はアラニン残基への置換、（Ｂ）第１４２位アミノ酸残基の、システイン残基、又はアスパラギン酸残基への置換、（Ｃ）第２２位アミノ酸残基の、チロシン残基への置換、（Ｄ）第２６位アミノ酸残基の、チロシン残基、又はシステイン残基への置換、（Ｅ）第３０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、（Ｆ）第３３位アミノ酸残基の、バリン残基への置換、（Ｇ）第３５位アミノ酸残基の、セリン残基への置換、（Ｈ）第３６位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、（Ｉ）第４３位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、（Ｊ）第７３位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、（Ｋ）第１１３位アミノ酸残基の、リジン残基への置換、（Ｌ）第１５６位アミノ酸残基の、プロリン残基への置換、（Ｍ）第１５７位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、（Ｎ）第１６９位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、（Ｏ）第１７０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、（Ｐ）第１８２位アミノ酸残基の、アルギニン残基への置換、及び（Ｑ）第１８３位アミノ酸残基の、グリシン残基への置換のうちの、少なくともいずれかの置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ＩＩ）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド、並びに
（ＩＩＩ）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド。
項２．　項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼをコードしているＤＮＡ。
項３．　項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
項４．　項３に記載の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項５．　項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、改変型プロテイングルタミナーゼの製造方法。
項６．　項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼを含む酵素剤。
項７．　項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼを含む、タンパク質材料の改質剤。
項８．　項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法。
　本発明によれば、酸化安定性が向上した改変型プロテイングルタミナーゼが提供される。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷性アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
　本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
１．改変型プロテイングルタミナーゼ
　本発明の改変型プロテイングルタミナーゼは、以下の（I）から（III）のいずれかに示すポリペプチドからなる。
（I）配列番号１に示すアミノ酸配列において、
　　（Ａ）第１２１位アミノ酸残基の、バリン残基、又はアラニン残基への置換、
　　（Ｂ）第１４２位アミノ酸残基の、システイン残基、又はアスパラギン酸残基への置換、
　　（Ｃ）第２２位アミノ酸残基の、チロシン残基への置換、
　　（Ｄ）第２６位アミノ酸残基の、チロシン残基、又はシステイン残基への置換、
　　（Ｅ）第３０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、
　　（Ｆ）第３３位アミノ酸残基の、バリン残基への置換、
　　（Ｇ）第３５位アミノ酸残基の、セリン残基への置換、
　　（Ｈ）第３６位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、
　　（Ｉ）第４３位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
　　（Ｊ）第７３位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、
　　（Ｋ）第１１３位アミノ酸残基の、リジン残基への置換、
　　（Ｌ）第１５６位アミノ酸残基の、プロリン残基への置換、
　　（Ｍ）第１５７位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
　　（Ｎ）第１６９位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
　　（Ｏ）第１７０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、
　　（Ｐ）第１８２位アミノ酸残基の、アルギニン残基への置換、及び
　　（Ｑ）第１８３位アミノ酸残基の、グリシン残基への置換
のうちの、少なくともいずれかの置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（II）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド、並びに
（III）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド。
　配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号２に示されるＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム）由来プロテイングルタミナーゼの全長配列（シグナル配列及びプロ配列を含む配列）の、成熟配列である。
　前記（I）～（III）のポリペプチドは、上記（Ａ）～（Ｑ）の置換を単独で含むポリペプチド（Ｃ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼの単独置換体）であってもよいし、２以上の組み合わせで含むポリペプチド（Ｃ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼの多重置換体）であってもよい。前記（I）～（III）のポリペプチドの中でも、好ましい例として、上記（Ａ）～（Ｑ）の置換のうち、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｊ）、（Ｌ）、（Ｍ）、（Ｎ）、（Ｐ）の少なくともいずれかの置換を含むポリペプチド；上記（Ａ）～（Ｑ）の置換のうち（Ｅ）及び（Ｋ）の置換を含むポリペプチド；上記（Ａ）～（Ｑ）の置換のうち、（Ｄ）、（Ｉ）及び（Ｑ）の置換を含むポリペプチド；上記（Ａ）～（Ｑ）の置換のうち（Ｃ）及び（Ｏ）の置換を含むポリペプチドが挙げられる。
　前記（I）のポリペプチドの具体例として、（Ａ）の置換のうちバリン残基置換を有するポリペプチドの具体的なアミノ酸配列は配列番号３に、アラニン残基置換を有するポリペプチドの具体的なアミノ酸配列は配列番号４に示され、（Ｂ）の置換のうちシステイン残基置換を有するポリペプチドの具体的なアミノ酸配列は配列番号５に、アスパラギン酸残基置換を有するポリペプチドの具体的なアミノ酸配列は配列番号６に示される。
　前記（II）のポリペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（II）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～１８個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個若しくは１個が挙げられる。
　また、前記（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、又は８５％以上、より好ましくは９０％以上、又は９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、一層好ましくは９８％以上、より一層好ましくは９８．５％以上、又は９９％以上、特に好ましくは９９．３％以上、又は９９．５％以上が挙げられる。
　ここで、前記（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示す各アミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７-２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の第４２位（システイン残基）、第８３位（ヒスチジン残基）及び第１０３位（アスパラギン酸残基）に相当するアミノ酸残基は、活性触媒残基と考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に対してアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。即ち前記（II）及び（III）のポリペプチドにおける置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドの具体例としては、Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼの類縁プロテイングルタミナーゼに前記置換が導入されたポリペプチドが挙げられる。前記置換が導入される当該類縁プロテイングルタミナーゼとしては、例えば、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来プロテイングルタミナーゼが挙げられ、より具体的には、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来プロテイングルタミナーゼの成熟配列である配列番号７又は配列番号８に示されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号７又は配列番号８の第１１５位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えばセリン残基）に置換されたアミノ酸配列が挙げられる。配列番号７は、配列番号１に対して８６．９％の配列同一性を有し、配列番号８は、配列番号１に対して８７．４％の配列同一性を有している。なお、配列番号７の全長配列は配列番号９に示されるアミノ酸配列であり、配列番号８の全長配列は配列番号１０に示されるアミノ酸配列である。
　前記（I）～（III）に示すポリペプチドは、プロテイングルタミナーゼ活性を有し、且つ、酸化安定性が向上した特性を有する。酸化安定性が向上した特性とは、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ）の当該残存活性より向上している特性をいい、具体的には、当該ポリペプチド水溶液０．１ｍｇ／ｍＬに対し、３７℃において終濃度０．００１％の過酸化水素で１時間処理した場合の残存活性（以下において「酸化処理後残存活性Ａ0.001%」とも記載する）が、野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ａ0.001%の２倍以上であることが挙げられる。前記（I）～（III）に示すポリペプチドの酸化安定性の好ましい例としては、酸化処理後残存活性Ａ0.001%が、野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ａ0.001%の３倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上、一層好ましくは５．５倍以上が挙げられる。前記（I）～（III）に示すポリペプチドの酸化処理後残存活性Ａ0.001%の上限としては特に限定されないが、例えば、野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ａ0.001%の２０倍以下、又は１０倍以下が挙げられる。前記（I）～（III）に示すポリペプチドの、酸化安定性が向上した特性を、当該ポリペプチド水溶液０．１ｍｇ／ｍＬに対し、３７℃において終濃度０．００２５％の過酸化水素で１時間処理した場合の残存活性（以下において「酸化処理後残存活性Ｂ0.0025%」とも記載する）で示すと、野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ｂ0.0025%の例えば５倍以上、好ましくは７倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、一層好ましくは２０倍以上が挙げられる。前記（I）～（III）に示すポリペプチドの酸化処理後残存活性Ｂ0.0025%の上限としては特に限定されないが、例えば、野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ｂ0.0025%の例えば６０倍以下、又は５０倍以下が挙げられる。
　また、前記（I）～（III）に示すポリペプチドの比活性としては特に限定されるものではないが、前記（I）～（III）に示すポリペプチドの３７℃での比活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ）の３７℃での比活性を１００％とした場合、例えば、２０％以上、４０％以上、又は６０％以上が挙げられる。前記（I）～（III）に示すポリペプチドの好ましい比活性としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ）と同等の比活性が挙げられる。当該同等の比活性としては、具体的には、前記（I）～（III）に示すポリペプチドの３７℃での比活性として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの３７℃での比活性を１００％とした場合の相対活性で、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％以上、一層好ましくは１０５％以上が挙げられる。
　なお、プロテイングルタミナーゼ活性は、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ（ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン）を基質とし、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
　本発明の改変型プロテイングルタミナーゼは、さらに、後述の酵素剤の有効成分として用いられてもよいし、他のアミノ酸配列からなるペプチド又はタンパク質（以下において、「他のタンパク質等」とも記載する。）と共に融合タンパク質などの形態で一体化した、より大きいタンパク質の一部を構成するために用いられてもよい。当該他のタンパク質等の例としては、ポリヒスチジン残基等の、タンパク質の精製のために用いられるペプチドであって、組み換え生産時のｍＲＮＡの安定性を確保するための付加配列に由来するペプチド等が挙げられる。
２．ＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、上記「１．改変型プロテイングルタミナーゼ」で述べた改変型プロテイングルタミナーゼをコードするＤＮＡである。
　本発明のＤＮＡは、上記「１．改変型プロテイングルタミナーゼ」で述べた（I）～（III）に示すポリペプチドからなる改変型プロテイングルタミナーゼをコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば特に限定されない。（I）～（III）に示すポリペプチドの基準配列である配列番号１に示すアミノ酸配列（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来プロテイングルタミナーゼ）をコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号１１が挙げられる。従って、本発明のＤＮＡは、配列番号１１を基準配列として当業者が適宜設計することができる。
　本発明のＤＮＡの例として、以下の［i］～［iii］のいずれかに示すＤＮＡが挙げられる。
［i］配列番号１１に示す塩基配列において、
　　（ａ）第３６１～３６３位の、バリン残基、又はアラニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｂ）第４２４～４２６位の、システイン残基、又はアスパラギン酸残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｃ）第６４～６６位の、チロシン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｄ）第７６～７８位の、チロシン残基、又はシステイン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｅ）第８８～９０位の、スレオニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｆ）第９７～９９位の、バリン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｇ）第１０３～１０５位の、セリン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｈ）第１０６～１０８位の、イソロイシン残基をコードする塩基配列への置換、

　　（ｉ）第１２７～１２９位の、フェニルアラニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｊ）第２１７～２１９位の、イソロイシン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｋ）第３３７～３３９位の、リジン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｌ）第４６６～４６８位の、プロリン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｍ）第４６９～４７１位の、フェニルアラニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｎ）第５０５～５０７位の、フェニルアラニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｏ）第５０８～５１０位の、スレオニン残基をコードする塩基配列への置換、
　　（ｐ）第５４４～５４６位の、アルギニン残基をコードする塩基配列への置換、及び
　　（ｑ）第５４７～５４９位の、グリシン残基をコードする塩基配列への置換
のうちの、少なくともいずれかの置換が導入された塩基配列からなるＤＮＡ、
［ii］過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチドをコードするＤＮＡであって、上記［i］に示すＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び
［iii］過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチドをコードするＤＮＡであって、上記［i］に示すＤＮＡと７０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
　前記［i］のＤＮＡの具体例として、［ａ］の置換のうちバリン残基をコードする塩基配列による置換を有するＤＮＡの具体的な塩基配列は配列番号１２に、アラニン残基をコードする塩基配列による置換を有するＤＮＡの具体的な塩基配列は配列番号１３に示され、［ｂ］の置換のうちシステイン残基をコードする塩基配列による置換を有するＤＮＡの具体的な塩基配列は配列番号１４に、アスパラギン酸残基をコードする塩基配列による置換を有するＤＮＡの具体的な塩基配列は配列番号１５に示される。
　前記［ii］のＤＮＡについて、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　前記［iii］のＤＮＡについて、当該相同性としては、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、又は８５％以上、より好ましくは９０％以上、又は９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、一層好ましくは９８％以上、より一層好ましくは９８．５％以上、又は９９％以上、特に好ましくは９９．３％以上、又は９９．５％以上が挙げられる。
　ここで、ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
　本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（つまり、Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼ）又はその類縁プロテイングルタミナーゼ（上述の通り、具体例としてＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．が挙げられ、より具体的な例として、配列番号７又は配列番号８に示すアミノ酸配列、若しくは、配列番号７又は配列番号８の第１１５位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えばセリン残基）に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。）をコードしているＤＮＡに、上記（ａ）～（ｑ）の少なくともいずれかの置換を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡについては、配列番号１１に示される塩基配列が組み込まれたプラスミド等の核酸構築物からＰＣＲを用いた常法により当該塩基配列部分を取得することができる。なお、当該核酸構築物には、配列番号１１に示される塩基配列と共に、当該塩基配列の５′末端側にシグナル配列及びプロ配列を付加した配列を組み込むことができる。このようなシグナル配列及びプロ配列が付加した配列としては、配列番号２で示されるＣ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼの全長配列をコードする、配列番号１６に示される塩基配列、及び類縁プロテイングルタミナーゼである配列番号９又は配列番号１０のＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来プロテイングルタミナーゼの全長配列をそれぞれコードする配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列等が挙げられる。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM Ｓｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒTM Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
　本発明のＤＮＡには、コドンの縮重に由来する多種のＤＮＡが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のＤＮＡを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。具体的な配列決定法としては、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）、又は適当なＤＮＡシークエンサーを利用した配列解析法等が挙げられる。また、ＤＮＡが目的のポリペプチドをコードするＤＮＡであるかどうかの確認方法としては、決定された塩基配列を配列番号１１に示す塩基配列等の無置換塩基配列と比較する方法、又は、決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示すアミノ酸配列等の無置換アミノ酸配列と比較する方法が挙げられる。
３．発現カセット又は組換えベクター
　本発明の発現カセット又は組換えベクターは、上記「２．ＤＮＡ」に記載の本発明のＤＮＡを含む。本発明の発現カセット又は組換えベクターは、本発明のＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本発明の発現カセット又は本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本発明の組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が挙げられる。
４．形質転換体
　本発明の形質転換体は、上記「３．発現カセット又は組換えベクター」に記載の本発明の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られるものである。
　本発明の形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で本発明のＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ）等のクリセオバクテリウム属等に属する細菌、；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等であってもよい。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
　本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　ＰＣＲ法によって本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ又は発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。
　発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
　更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除タンパク質処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
　その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
　また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
５．改変型プロテイングルタミナーゼの製造方法
　本発明の改変型プロテイングルタミナーゼの製造方法は、上記「１．改変型プロテイングルタミナーゼ」に記載の酵素を製造する方法であって、本発明の形質転換体を培養する工程を含む。なお、改変型プロテイングルタミナーゼに含まれる（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が自然に導入されているものである場合は、改変型プロテイングルタミナーゼを産生する微生物を培養する工程を含む製造方法によって、改変型プロテイングルタミナーゼを得ることができる。
　上記の培養条件は、上記形質転換体又は上記微生物の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。培地の栄養源としては、上記形質転換体又は上記微生物の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
　培養温度は、本発明の上記形質転換体又は上記微生物が生育可能であり、且つ上記形質転換体又は上記微生物が改変型プロテイングルタミナーゼを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５～３７℃程度である。培養は、改変型プロテイングルタミナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２～４８時間程度が挙げられる。
　上記形質転換体又は上記微生物の培養後は、培養液を遠心分離などの方法に供し、培養上清及び／又は菌体を回収する。菌体には、超音波やフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、所定の改変型プロテイングルタミナーゼを含む水溶性画分を得ることができる。また、適当な発現カセット又は発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した改変型プロテイングルタミナーゼを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られた改変型プロテイングルタミナーゼを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の改変型プロテイングルタミナーゼを濃縮した後に精製処理に供してもよい。濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール及びアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　改変型プロテイングルタミナーゼの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。精製された改変型プロテイングルタミナーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．酵素剤
　改変型プロテイングルタミナーゼは、酵素剤の形態で提供されることができる。したがって、本発明は、上記「１．改変型プロテイングルタミナーゼ」に記載の改変型プロテイングルタミナーゼを有効成分として含む酵素剤も提供する。
　本発明の酵素剤における改変型プロテイングルタミナーゼの含有量としては特に限定されないが、含有量の下限としては、例えば１Ｕ／ｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｇ以上、より好ましくは５０Ｕ／ｇ以上、更に好ましくは１００Ｕ／ｇ以上、特に好ましくは２００Ｕ／ｇ以上が挙げられる。含有量の上限としては、例えば１００００Ｕ／ｇ以下、好ましくは５０００Ｕ／ｇ以下、より好ましくは２０００Ｕ／ｇ以下、更に好ましくは１０００Ｕ／ｇ以下、特に好ましくは８００Ｕ／ｇ以下が挙げられる。
　本発明の酵素剤は、改変型プロテイングルタミナーゼ以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。他の成分としては、改変型プロテイングルタミナーゼ以外の他の酵素、添加剤、上記製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
　他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、タンパク質脱アミド酵素（上記改変型プロテイングルタミナーゼ以外）、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　添加剤としては、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ-グルコース、ソルビトール、Ｄ-マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分等が挙げられる。
　本発明の酵素剤の形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。前記形態の酵素剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
７．タンパク質材料の改質剤
　上記改変型プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼの公知の用途に用いることができる。例えば、改変型プロテイングルタミナーゼは、タンパク質材料の改質を目的として用いることができる。従って、本発明は、改変型プロテイングルタミナーゼを含むタンパク質材料の改質剤も提供する。
　タンパク質材料の改質の具体的な態様としては特に限定されず、タンパク質のグルタミン残基及びアスパラギン残基のγ－アミド基及びβ－アミド基の脱アミド化によりカルボキシル基が生じることでもたらされるタンパク質の特性変化であればよい。具体的には、タンパク質材料の改質としては、タンパク質の可溶性の増大、水分散性の増大、乳化力の向上、及び乳化安定性等が挙げられる。タンパク質材料の改質剤の具体的な使用方法については、後述「８．改質されたタンパク質材料の製造方法」に述べる通りである。
８．改質されたタンパク質材料の製造方法
　上述のとおり、改変型プロテイングルタミナーゼは、タンパク質材料の改質を目的として用いることができる。従って、本発明は、上記改変型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法も提供する。
　本発明の製造方法においては、タンパク質材料と改変型プロテイングルタミナーゼとを含む混合物を、改変型プロテイングルタミナーゼの作用条件下に供することで、タンパク質を改質する反応を進行させる。
　タンパク質材料としては、タンパク質を含んでいる材料であれば特に限定されず、食用及び非食用のいずれであってもよい。食用のタンパク質材料は、飲食品として、又は、飲食品を製造するための素材として用いることができるものである。非食用のタンパク質材料は、タンパク質実験用の材料、医療材料、繊維材料、香粧品材料等として用いることができるものである。
　タンパク質材料の具体例としては、タンパク質源そのもの、及びタンパク質源から公知の方法でタンパク質含量を高める処理を行って得られる調製物が挙げられ、これらは当業者によって適宜選択される。例えば、食用のタンパク質材料としては、植物性タンパク質材料として、植物性タンパク質を含有する食品から得られる調製物；動物性タンパク質材料として、動物性タンパク質を含有する食品から調製される調製物が挙げられる。食用の植物性タンパク質としては、大豆タンパク質、空豆タンパク質、エンドウタンパク質、ひよこ豆タンパク質、緑豆タンパク質、ルパン豆タンパク質等の豆タンパク質；小麦タンパク質、ライ麦タンパク質、オート麦タンパク質、トウモロコシタンパク質等の穀物タンパク質；カナリーシード、亜麻仁、アーモンド、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピーナッツ、ココナッツ、ヘンプシード（産業用ヘンプ）、ピリナッツ、栗、ゴマ、松の実等の種実タンパク質等が挙げられる。食用の動物性タンパク質としては、畜肉、魚肉、卵、乳のタンパク質が挙げられる。非食用のタンパク質材料としては、卵白、血清等の生体試料に由来する、アルブミン、グロブリン等；及びシルク、ウール等が挙げられる。
　これらのタンパク質材料中におけるタンパク質の含有量としては特に限定されないが、例えば３０重量％以上、４０重量％以上、又は５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは８０重量％以上が挙げられる。タンパク質材料中におけるタンパク質の含有量の上限としては特に限定されないが、例えば９５重量％以下、９０重量％以下、８５重量％以下、８０重量％以下、７０重量％以下、又は６０重量％以下が挙げられる。
　混合物中におけるタンパク質材料の含有量としては、タンパク質材料に含まれるタンパク質の混合物中の濃度が、例えば０．１重量％以上、又は０．３重量％以上、好ましくは０．７重量％以上、より好ましくは１．４重量％以上となる量が挙げられる。タンパク質材料に含まれるタンパク質の混合物中の当該濃度の上限としては特に限定されないが、例えば、８０重量％以下、６０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、８重量％以下、５重量％以下、３重量％以下、又は２重量％以下が挙げられる。
　改変型プロテイングルタミナーゼの使用量としては特に限定されないが、タンパク質材料に含まれるタンパク質１ｇ当たりの改変型プロテイングルタミナーゼの使用量として、例えば０．１Ｕ以上、好ましくは０．５Ｕ以上、より好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは２Ｕ以上、一層好ましくは３．５Ｕ以上、より一層好ましくは４．５Ｕ以上が挙げられる。タンパク質材料に含まれるタンパク質１ｇ当たりの改変型プロテイングルタミナーゼの使用量の上限としては特に限定されないが、例えば、４５Ｕ以下、３５Ｕ以下、２０Ｕ以下、１０Ｕ以下、８Ｕ以下、又は５．５Ｕ以下が挙げられる。
　また、タンパク質材料１ｇ当たりの改変型プロテイングルタミナーゼの使用量としては、例えば０．０１Ｕ以上、０．０５Ｕ以上、又は０．１Ｕ以上、好ましくは０．５Ｕ以上、より好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは２Ｕ以上、一層好ましくは３Ｕ以上、より一層好ましくは４Ｕ以上が挙げられる。タンパク質材料１ｇ当たりの改変型プロテイングルタミナーゼの使用量の上限としては特に限定されないが、例えば、４０Ｕ以下、３０Ｕ以下、２０Ｕ以下、１０Ｕ以下、７Ｕ以下、又は５Ｕ以下が挙げられる。
　改変型プロテイングルタミナーゼの作用条件としては、使用する改変型プロテイングルタミナーゼの至適温度及び至適ｐＨに基づいて適宜決定される。
　改変型プロテイングルタミナーゼの作用条件のうち温度条件としては、改変型プロテイングルタミナーゼの至適温度等に応じて当業者が適宜決定することができる。具体的な温度条件としては、例えば４０～７０℃、好ましくは４８～６７℃、より好ましくは５３～６５℃、一層好ましくは５７～６３℃が挙げられる。
　改変型プロテイングルタミナーゼの作用条件のうちｐＨ条件としては、改変型プロテイングルタミナーゼの至適ｐＨ等に応じて当業者が適宜決定することができる。具体的なｐＨ条件としては、例えば、２～１２、好ましくは３～１０、より好ましくは４～９が挙げられる。
　改変型プロテイングルタミナーゼを作用させる時間としては特に限定されず、仕込みスケール等に応じて適宜決定すればよいが、例えば１時間以上、好ましくは８時間以上、より好ましくは１６時間以上、さらに好ましくは２０時間以上が挙げられる。当該時間の範囲の上限としては特に限定されないが、例えば４０時間以下、３０時間以下、又は２５時間以下が挙げられる。
　反応終了後は、酵素失活処理を行った後に冷却を行い、必要に応じて後処理を行うことで、改質されたタンパク質材料が得られる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１
（１）改変型プロテイングルタミナーゼの作製
　ｐＥＴ２１ベクターに導入した、Ｃ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする配列（配列番号１１）を鋳型に、各種変異を導入し、以下の改変型プロテイングルタミナーゼを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的には、以下のプライマーとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ　（Ｔａｋａｒａ）とを用いて、常法にてＰＣＲを行い、変異を導入した。
（C121V変異用プライマー）
Rv:5'- ATCTGTTACAGGACCGCTTGAAAATAGTGAAGGATC -3'（配列番号１９）
Fw:5'- ACAGCATGGAGAAACGCTgttGTTAACACCTCTTGCGGATCTGCATCC -3'（配列番号２０）
（C121A変異用プライマー）
Rv:5'- ATCTGTTACAGGACCGCTTGAAAATAGTGAAGGATC -3'（配列番号２１）
Fw:5'- ACAGCATGGAGAAACGCTgcgGTTAACACCTCTTGCGGATCTGCATCC -3'（配列番号２２）
（Y142C変異用プライマー）
Rv:5'- CTCTTGCGGATCTGCATCCGTTTCCTCTTATGCT -3'（配列番号２３）
Fw:5'- AATACTGCAGGAAATGTTtgtTACAGAAGTCCTAGTAATTCTTACCTGTATGACAACAATC -3'（配列番号２４）
（Y142D変異用プライマー）
Rv:5'- CTCTTGCGGATCTGCATCCGTTTCCTCTTATGCT -3'（配列番号２５）
Fw:5'- AATACTGCAGGAAATGTTgatTACAGAAGTCCTAGTAATTCTTACCTGTATGACAACAATC -3'（配列番号２６）
　それぞれ、得られた変異遺伝子産物を用いて、常法によりE.coli BL21（DE3）を形質転換し、遺伝子発現ベクターを取得した。遺伝子発現ベクターに導入したプロテイングルタミナーゼ配列を確認した。形質転換体をＬＢ培地で37℃、16時間振とう培養した。その後、Terrific Brothに植継し、37℃で4時間培養した後、IPTG（終濃度0.5mM）を添加し、33℃で20時間振とう培養した。培養液から菌体を回収し、B-PERTM Bacterial Cell Lysis Reagent（Thermo Scientific製）で菌体を定法に従って溶菌させ、15000rpmで10分間遠心分離した。回収した遠心上清を粗酵素液とし、終濃度50ug/mLとなるようにトリプシンを添加し37℃で1時間処理後、TALON(R)Spin Columns(タカラバイオ製)を用いて定法によって精製を行い、酵素サンプルとした。
（２）プロテイングルタミナーゼ活性測定方法
　Ｎ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ；ペプチド研究所）を０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸塩バッファー（ｐＨ６．５）で溶解し、３０ｍｍｏｌ／Ｌに調製した溶液を基質溶液とした。活性を測定すべき酵素溶液０．１ｍＬを試験管に入れ、３７±０．５℃の恒温水槽中にて１分間放置後、あらかじめ３７±０．５℃で１０分間放置した基質溶液１ｍＬを加え、直ちに混ぜた。この液を１０分間放置することで酵素反応を行った後、０．４ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸溶液１ｍＬを加えて酵素反応を停止した。測定ブランクは、試験管に酵素溶液０．１ｍＬを加え、０．４ｍｏｌ／Ｌトリクロロ酢酸溶液１ｍＬ、基質溶液１ｍＬの順に添加することで調製した。アンモニア－テストワコー（富士フィルム和光純薬）による発色反応を行い、波長６３０ｎｍにおける吸光度の値をもとに、１０分間の酵素反応によって遊離したアンモニアの定量を行った。アンモニア標準液（塩化アンモニウム）を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（６３０ｎｍ）との関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求めた。プロテイングルタミナーゼの酵素活性を、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とし、以下の式から算出した。式中、反応液量は２．１、酵素溶液量は０．１、Ｄｆは酵素溶液の希釈倍率である。また、１７．０３はアンモニアの分子量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（３）比活性の確認
　得られた実施例１～４の改変型プロテイングルタミナーゼの酵素サンプルを用い、３７℃での比活性を測定した。その結果、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来プロテイングルタミナーゼ（野生型）の比活性を１００％とした場合の比活性は、実施例１の改変型プロテイングルタミナーゼの酵素サンプルで８４％、実施例２の改変型プロテイングルタミナーゼの酵素サンプルで９３％、実施例３の改変型プロテイングルタミナーゼの酵素サンプルで１３７％、実施例４の改変型プロテイングルタミナーゼの酵素サンプルで９０％であり、いずれも野生型と同等以上の活性を有していることが確認できた。
（４）酸化安定性の確認
　精製した酵素溶液のタンパク質量を０．１ｍｇ／ｍＬに揃えた溶液に対し、終濃度０．００１ｗ/ｗ％過酸化水素を添加した。３７℃、１時間処理後のプロテイングルタミナーゼ活性を測定し、過酸化水素未処理のプロテイングルタミナーゼ活性に対する過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ活性の比率から残存活性（酸化処理後残存活性Ａ0.001%）を算出した。野生型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ａ0.001%に対する改変型プロテイングルタミナーゼの酸化処理後残存活性Ａ0.001%の倍率（対野生型倍率）を算出した。さらに、過酸化水素の添加量を終濃度０．００２５ｗ/ｗ％に変更したことを除いて同様にして、酸化処理後残存活性Ｂ0.0025%及び対野生型倍率を算出した。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記表に示すように、実施例１～４の改変型プロテイングルタミナーゼにおいて、過酸化水素処理後の残存活性が顕著に向上していることが示された。
試験例２
　ランダム変異導入キット　（Ｇｅｎｅ　Ｍｏｒｐｈ　ＩＩ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）　を用い、キットの説明書通りにＣ．　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ由来プロテイングルタミナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする配列（配列番号１１）にランダム変異を導入した。
　変異導入後の遺伝子は、ｐＥＴ２１ａベクターに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて挿入した。常法によりＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体をＬＢ培地で３７℃、１６時間振とう培養した。その後、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈに植継し、３７℃で４時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加し、３３℃で２０時間振とう培養した。培養液から菌体を回収し、Ｂ－ＰＥＲTM　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）で菌体を定法に従って溶菌させ、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収した遠心上清を粗酵素液とし、終濃度５０ｕｇ／ｍＬとなるようにトリプシンを添加し３７℃で１時間処理後、ＴＡＬＯＮ(R)Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（タカラバイオ製）を用いて定法によって精製を行い、酵素サンプルとした。
　得られた酵素サンプルに関して、試験例１の方法で比活性及び酸化安定性を評価した。酸化安定性の向上が認められた酵素サンプルに関して、遺伝子配列を確認し、変異を同定した。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表に示すように、実施例５～１６の改変型プロテイングルタミナーゼにおいて、過酸化水素処理後の残存活性が顕著に向上していることが示された。
配列番号１９～２６は、プライマーである。

Claims (8)

  1. 　以下の（I）から（III）のいずれかに示すポリペプチドからなる改変型プロテイングルタミナーゼ：
    （Ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、
    　　（Ａ）第１２１位アミノ酸残基の、バリン残基、又はアラニン残基への置換、
    　　（Ｂ）第１４２位アミノ酸残基の、システイン残基、又はアスパラギン酸残基への置換、
    　　（Ｃ）第２２位アミノ酸残基の、チロシン残基への置換、
    　　（Ｄ）第２６位アミノ酸残基の、チロシン残基、又はシステイン残基への置換、
    　　（Ｅ）第３０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、
    　　（Ｆ）第３３位アミノ酸残基の、バリン残基への置換、
    　　（Ｇ）第３５位アミノ酸残基の、セリン残基への置換、
    　　（Ｈ）第３６位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、
    　　（Ｉ）第４３位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
    　　（Ｊ）第７３位アミノ酸残基の、イソロイシン残基への置換、
    　　（Ｋ）第１１３位アミノ酸残基の、リジン残基への置換、
    　　（Ｌ）第１５６位アミノ酸残基の、プロリン残基への置換、
    　　（Ｍ）第１５７位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
    　　（Ｎ）第１６９位アミノ酸残基の、フェニルアラニン残基への置換、
    　　（Ｏ）第１７０位アミノ酸残基の、スレオニン残基への置換、
    　　（Ｐ）第１８２位アミノ酸残基の、アルギニン残基への置換、及び
    　　（Ｑ）第１８３位アミノ酸残基の、グリシン残基への置換
    のうちの、少なくともいずれかの置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （ＩＩ）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド、並びに
    （ＩＩＩ）前記（Ａ）～（Ｑ）の少なくともいずれかに示す置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換されたアミノ酸残基を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、過酸化水素処理後のプロテイングルタミナーゼ残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの前記残存活性より向上しているポリペプチド。
  2. 　請求項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼをコードしているＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  4. 　請求項３に記載の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 　請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、改変型プロテイングルタミナーゼの製造方法。
  6. 　請求項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼを含む酵素剤。
  7. 　請求項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼを含む、タンパク質材料の改質剤。
  8. 　請求項１に記載の改変型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法。
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