JP6369052B2 - 熱安定性アシルCoAシンテターゼ及びその製造方法 - Google Patents
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Description
項1. 下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるアシルCoAシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号1に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるアシルCoAシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
項2. 次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換が導入されている、請求項1に記載のポリペプチド:
(1a)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目が、スレオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(3a)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目が、非電荷アミノ酸、又は酸性アミノ酸に置換、
(4a)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(5a)配列番号1に示すアミノ酸配列における420番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(6a)配列番号1に示すアミノ酸配列における360番目が、非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号1に示すアミノ酸配列における50番目が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(8a)配列番号1に示すアミノ酸配列における53番目が、塩基性アミノ酸、又は非電荷アミノ酸に置換、
(9a)配列番号1に示すアミノ酸配列における105番目が、非極性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換
(10a)配列番号1に示すアミノ酸配列における111番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号1に示すアミノ酸配列における118番目が、フェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号1に示すアミノ酸配列における222番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(13a)配列番号1に示すアミノ酸配列における240番目が、リジン以外の塩基性アミノ酸に置換、
(14a)配列番号1に示すアミノ酸配列における265番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(15a)配列番号1に示すアミノ酸配列における423番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号1に示すアミノ酸配列における424番目が、酸性アミノ酸に置換、
(17a)配列番号1に示すアミノ酸配列における460番目が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(18a)配列番号1に示すアミノ酸配列における462番目が、セリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(19a)配列番号1に示すアミノ酸配列における540番目が、塩基性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、及び
(20a)配列番号1に示すアミノ酸配列における542番目が、非極性アミノ酸に置換。
項3. 次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換が導入されている、項1又は2に記載のポリペプチド:
(1a)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目が、バリンに置換、
(2a)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目が、セリンに置換、
(3a)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目が、グルタミン酸に置換、
(4a)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目が、スレオニンに置換、
(5a)配列番号1に示すアミノ酸配列における420番目が、アスパラギンに置換、
(6a)配列番号1に示すアミノ酸配列における360番目が、ロイシンに置換、
(7a)配列番号1に示すアミノ酸配列における50番目が、ロイシンに置換、
(8a)配列番号1に示すアミノ酸配列における53番目が、アルギニンに置換、
(9a)配列番号1に示すアミノ酸配列における105番目が、バリンに置換
(10a)配列番号1に示すアミノ酸配列における111番目が、プロリンに置換、
(11a)配列番号1に示すアミノ酸配列における118番目が、ロイシンに置換、
(12a)配列番号1に示すアミノ酸配列における222番目が、セリンに置換、
(13a)配列番号1に示すアミノ酸配列における240番目が、アルギニンに置換、
(14a)配列番号1に示すアミノ酸配列における265番目が、グリシンに置換、
(15a)配列番号1に示すアミノ酸配列における423番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号1に示すアミノ酸配列における424番目が、グルタミン酸に置換、
(17a)配列番号1に示すアミノ酸配列における460番目が、イソロイシンに置換、
(18a)配列番号1に示すアミノ酸配列における462番目が、グリシンに置換、
(19a)配列番号1に示すアミノ酸配列における540番目が、リジンに置換、及び
(20a)配列番号1に示すアミノ酸配列における542番目が、アラニンに置換。
項4. 次の(1b)〜(28)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換が導入されている、項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド:
(1b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、118番目、228番目、及び460番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、228番目、460番目、及び462番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、228番目、460番目、及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、228番目、460番目、540番目、541番目、及び542番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、及び53番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、50番目、及び111番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、及び111番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、118番目、及び222番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、240番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(10b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、及び420番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、553番目及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、228番目、240番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(13b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、105番目、240番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、460番目、及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、360番目、及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、240番目、360番目、及び420番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、118番目、222番目、240番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(18b)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目、228番目、及び460番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(19b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、及び53番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(20b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(21b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、及び460番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(22b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、420番目、及び460番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(23b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(24b)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目、360番目、及び541番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(25b)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目、540番目、542番目、及び553番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(26b)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目、118番目、及び222番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(27b)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目、240番目、及び360番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、並びに
(28b)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目、423番目、及び424番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
項5. 次の(1c)〜(28c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換が導入されている、項1〜4のいずれかに記載のポリペプチド:
(1c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、118番目がロイシンに置換、228番目がスレオニンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換、
(2c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、460番目がイソロイシンに置換、及び462番目がグリシンに置換、
(3c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、460番目がイソロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換、
(4c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、460番目がイソロイシンに置換、540番目がリジンに置換、541番目がセリンに置換、及び542番目がアラニンに置換、
(5c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、及び53番目がアルギニンに置換、
(6c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、240番目がロイシンに置換、及び111番目がプロリンに置換、
(7c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、及び111番目がプロリンに置換、
(8c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、118番目がロイシンに置換、及び222番目がセリンに置換、
(9c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、240番目がアルギニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、
(10c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、及び420番目がアスパラギンに置換、
(11c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、553番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換及び541番目がセリンに置換、
(12c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、240番目がアルギニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、
(13c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、105番目がバリンに置換、240番目がアルギニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、
(14c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、460番目がイソロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換、
(15c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、360番目がロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換、
(16c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、240番目がアルギニンに置換、360番目がロイシンに置換、及び420番目がアスパラギンに置換、
(17c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、118番目がロイシンに置換、222番目がセリンに置換、240番目がアルギニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、
(18c)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換、
(19c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、及び53番目がアルギニンに置換、
(20c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、
(21c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換、
(22c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、420番目がアスパラギンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換、
(23c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、及び541番目がセリンに置換、
(24c)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、360番目がロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換、
(25c)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目がセリンに置換、540番目がリジンに置換、542番目がアラニンに置換、及び553番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、
(26c)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目がセリンに置換、118番目がロイシンに置換、及び222番目がセリンに置換、
(27c)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、240番目がアルギニンに置換、及び360番目がロイシンに置換、並びに
(28c)配列番号1に示すアミノ酸配列における553番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、423番目がグルタミン酸に置換、及び424番目がグルタミン酸に置換。
項6. 項1〜5のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているDNA。
項7. 下記(i)又は(ii)に示すDNAである、項6に記載のDNA。
(i) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA、
(ii) アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるアシルCoAシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号4に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
項8. 項6又は7に記載のDNAを含む組換えベクター。
項9. 項8に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項10. 項9に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
本発明のポリペプチドは、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドシュードモナス・フラジ由来のACS、野生型ACS)の変異体であって、ACS活性を有し、野生型ACSよりも熱安定性が向上しているポリペプチドである。
(A) 配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(1a)528番目(アラニン)が、アラニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸;好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニン;更に好ましくはバリンへの置換、
(2a)541番目(スレオニン)が、スレオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸;好ましくはセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン;更に好ましくはセリン、チロシン、又はトリプトファン;特に好ましくはセリンへの置換、
(3a)553番目(アスパラギン酸)が、非電荷アミノ酸又は酸性アミノ酸;好ましくはグルタミン酸又はグルタミン;更に好ましくはグルタミン酸への置換、
(4a)228番目(セリン)が、非電荷アミノ酸;好ましくはアスパラギン、スレオニン又はグルタミン;更に好ましくはスレオニンへの置換、
(5a)420番目(グルタミン酸)が、非電荷アミノ酸;好ましくはアスパラギン、グルタミン、セリン又はスレオニン;更に好ましくはアスパラギンへの置換、
(6a)360番目(メチオニン)が、非極性アミノ酸;好ましくはロイシン、アラニン、又はイソロイシン;更に好ましくはロイシンへの置換、
(7a)50番目(イソロイシン)が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸;好ましくはロイシン、リジン、又はメチオニン;更に好ましくはロイシンへの置換、
(8a)53番目(グリシン)が、塩基性アミノ酸、又は非電荷アミノ酸;好ましくはアルギニン、リジン又はヒスチジン;更に好ましくはアルギニンへの置換、
(9a)105番目(スレオニン)が、非極性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸;好ましくはバリン、グリシン、又はアラニン;更に好ましくはバリンへの置換
(10a)111番目(アラニン)が、アラニン以外の非極性アミノ酸;好ましくはプロリンへの置換、
(11a)118番目(フェニルアラニン)が、フェニルアラニン以外の非極性アミノ酸;好ましくはロイシン、アラニン、又はイソロイシン;更に好ましくはロイシンへの置換、
(12a)222番目(アラニン)が、非電荷アミノ酸;好ましくはセリンへの置換、
(13a)240番目(リジン)が、リジン以外の塩基性アミノ酸;好ましくはアルギニンへの置換、
(14a)265番目(アラニン)が、非電荷アミノ酸;好ましくはグリシンへの置換、
(15a)423番目(アスパラギン酸)が、グルタミン酸への置換、
(16a)424番目(アラニン)が、酸性アミノ酸;好ましくはグルタミン酸への置換、
(17a)460番目(ロイシン)が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸;好ましくはイソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン;更に好ましくはイソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン;特に好ましくはイソロイシンへの置換、
(18a)462番目(セリン)が、セリン以外の非電荷アミノ酸;好ましくはグリシンへの置換、
(19a)540番目(スレオニン)が、塩基性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸;好ましくはリジン、グルタミン、又はアルギニン;更に好ましくはリジンへの置換、
(20a)542番目(アスパラギン)が、非極性アミノ酸;好ましくはアラニン、ロイシン又はイソロイシン;更に好ましくはアラニンへの置換。
(1b)528番目(アラニン)、118番目(フェニルアラニン)、228番目(セリン)、及び460番目(ロイシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)528番目(アラニン)、228番目(セリン)、460番目(ロイシン)、及び462番目(セリン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)528番目(アラニン)、228番目(セリン)、460番目(ロイシン)、及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)528番目(アラニン)、228番目(セリン)、460番目(ロイシン)、540番目(スレオニン)、541番目(スレオニン)、及び542番目(アスパラギン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)528番目(アラニン)、及び53番目(グリシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)528番目(アラニン)、50番目(イソロイシン)、及び111番目(アラニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)528番目(アラニン)、及び111番目(アラニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)528番目(アラニン)、118番目(フェニルアラニン)、及び222番目(アラニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)528番目(アラニン)、240番目(リジン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(10b)528番目(アラニン)、及び420番目(グルタミン酸)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)528番目(アラニン)、553番目(アスパラギン酸)及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)528番目(アラニン)、228番目(セリン)、240番目(リジン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(13b)528番目(アラニン)、105番目(スレオニン)、240番目(リジン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)528番目(アラニン)、460番目(ロイシン)、及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)528番目(アラニン)、360番目(メチオニン)、及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)528番目(アラニン)、240番目(リジン)、360番目(メチオニン)、及び420番目(グルタミン酸)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)528番目(アラニン)、118番目(フェニルアラニン)、222番目(アラニン)、240番目(リジン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(18b)528番目(アラニン)、228番目(セリン)、及び460番目(ロイシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(19b)228番目(セリン)、及び53番目(グリシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(20b)228番目(セリン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(21b)228番目(セリン)、及び460番目(ロイシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(22b)228番目(セリン)、420番目(グルタミン酸)、及び460番目(ロイシン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(23b)228番目(セリン)、及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(24b)228番目(セリン)、360番目(メチオニン)、及び541番目(スレオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(25b)541番目(スレオニン)、540番目(スレオニン)、542番目(アスパラギン)、及び553番目(アスパラギン酸)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(26b)541番目(スレオニン)、118番目(フェニルアラニン)、及び222番目(アラニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(27b)553番目(アスパラギン酸)、240番目(リジン)、及び360番目(メチオニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(28b)553番目(アスパラギン酸)、423番目(アスパラギン酸)、及び424番目(アラニン)が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
(B) 配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、ACS活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるACSと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
(C) 配列番号1に示すアミノ酸配列における、528番目、541番目、553番目、228番目、420番目、360番目、50番目、53番目、105番目、111番目、118番目、222番目、240番目、265番目、423番目、424番目、460番目、462番目、540番目、及び542番目よりなる群から選択される少なくとも1つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号1に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、ACS活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるACSと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
測定対象となるポリペプチドを10mMリン酸緩衝液(pH7.5)に添加して、60℃に設定したウォーターバスで5分間インキュベートすることにより加熱処理を行った後に、急冷する。
本発明において、ACS活性の測定は、ATP及びCoAの存在下、ACSの作用により生成するアシルCoAを酵素的に測定することにより求められる。即ち、200mMリン酸緩衝液(pH7.5)30μl、10mM ATP(pH7.5に調製)15μl、10mM MgCl2・6H2O 15μl、10mM CoA(pH6.5) 7.5μl、1mMパルミチン酸〔5%(重量%,以下全て同様)トリトンX−100溶液に溶解。〕30μl、及び水52.5μlよりなる反応液(I)に、測定対象となるポリペプチドを所定濃度に希釈した溶液10μlを加えて37℃で10分間反応させる。次に、200mMリン酸緩衝液(pH7.5) 75μl、20mM N−エチルマレイミド15μl、15mM 4アミノアンチピリン45μl、6mM N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン45μl、100U/mlペルオキシダーゼ15μl、120U/mlアシルCoAオキシダーゼ15μl、0.5%NaN3 15μl、及び水75μlよりなる反応液(II)を加えて37℃で更に10分間反応させ、0.5%SDS150μlにより反応を停止させた後、555nmの吸光度を測定する。上記条件で、1分間に1μmoleのパルミトイルCoAを生成する酵素量を1Uとする。
1/2: 2モルのH2O2が1モルのキノンジイミンダイを生じることによる係数
本発明のポリペプチドをコードしているDNA(以下、「本発明のDNA」と表記することもある)は、例えば、変異前の野生型ACS(配列番号1)をコードしているDNAに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。 また、本発明のDNAは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。その際、該DNAの塩基配列におけるコドン利用頻度を、使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したDNAを人工合成することもできる。
F:フェニルアラニン(ttt)、L:ロイシン(ctg)、I:イソロイシン(att)、M:メチオニン(atg)、V:バリン(gtg)、Y:チロシン(tat)、終止コドン(taa)、H:ヒスチジン(cat)、Q:グルタミン(cag)、N:アスパラギン(aat)、K:リジン(aaa)、D:アスパラギン酸(gat)、E:グルタミン酸(gaa)、S:セリン(agc)、P:プロリン(ccg)、T:スレオニン(acc)、A:アラニン(gcg)、C:システイン(tgc)、W:トリプトファン(tgg)、R:アルギニン(cgc)、G:グリシン(ggc)。
本発明のペプチドをコードするDNAを含む組換えベクター(以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある)は、発現ベクターに本発明のDNAを挿入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体(以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある)が得られる。
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
公知のシュウドモナス・フラジ(Pseudomonas fragi)由来ACS遺伝子配列(特許第3400809号)をもとに、大腸菌での発現に最適化された塩基配列(配列番号3;配列番号1に示すアミノ酸配列からなる野生型ACSをコード)からなるACS遺伝子を合成した(オペロンバイオテクノロジー社)。ACS合成遺伝子は、設計配列の5'側にEcoRI認識配列が、3'側にSalI認識配列が付加されており、pBluescriptIISK(+)のSmaIサイトに挿入された状態であった。このACS合成遺伝子を制限酵素EcoRI(宝酒造社製)及び制限酵素SalI(宝酒造社製)にて切断した。同様に、プラスミドベクターpTrc99aも同じ制限酵素にて切断した。両者をアガロースゲル電気泳動により分離し、目的のDNA断片をGenElute Gel Extraction Kit(SIGMA−ALDRICH社製)を用いて回収した。次いでこれらのDNA断片をLigationhighキット(東洋紡績製)にて16℃で15分間反応させて連結し、シュードモナス・フラジ由来のACS遺伝子を含む組換えベクターを得た。
野生型ACSをコードするDNAを含む組換えプラスミドpTrc−ACS、表1に示す合成オリゴヌクレオチド(変位導入プライマー)、当該合成オリゴヌクレオチドと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChange T M Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行った。以上の操作を繰り返し、複数の変異を有する変異型ACS酵素をコードする組換えプラスミド(pTrc−ACS1〜44)を取得した。表2−1及び2−2に作成した変異体ACS−1〜44と変異部位の詳細を示す。
(3−1)ACS変異体の耐熱性の評価1
実施例2で得られた上清(野生型ACS又はACS変異体含有)を1.5mLのプラスチックチューブに50μLずつ分注し、該プラスチックチューブを60℃に調節したウォーターバスに投入し、5分間、熱処理した。熱処理終了後、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を100としたときの熱処理後の残存活性(%)を算出し、安定性の指標とした。
(3−1)で安定化に大きく寄与したS228T、A528V、T541S、及びD553Eに変異をかけ合わせることでさらに安定化するかを調べた。実施例2で得られた上清(野生型ACS又はACS変異体含有)を1.5mLのプラスチックチューブに50μLずつ分注し、該プラスチックチューブを60℃に調節したウォーターバスに投入し、10分間、熱処理した。熱処理終了後、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を100としたときの熱処理後の残存活性(%)を算出し、安定性の指標とした。
実施例2で得られた上清(野生型ACS又はACS変異体含有)を1.5mLのプラスチックチューブに50μLずつ分注し、該プラスチックチューブを60℃に調節したウォーターバスに投入し、15分間、熱処理した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を100としたときの熱処理後の残存活性(%)を算出し、安定性の指標とした。
実施例2で得られた上清(野生型ACS又はACS変異体含有)を1.5mLのプラスチックチューブに50μLずつ分注し、該プラスチックチューブを60℃に調節したウォーターバスに投入し、18分間、熱処理した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を100としたときの熱処理後の残存活性(%)を算出し、安定性の指標とした。
Claims (12)
- 次の(1)のアミノ酸置換と、次の(2)から(5)から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換と、が導入されており、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上しているポリペプチド:
(1)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、360番目がロイシンに置換、及び240番目がアルギニンに置換、
(2)配列番号1に示すアミノ酸配列における228番目がスレオニンに置換、
(3)配列番号1に示すアミノ酸配列における105番目がバリンに置換、
(4)配列番号1に示すアミノ酸配列における420番目がアスパラギンに置換、
(5)配列番号1に示すアミノ酸配列における118番目がロイシンに置換、及び222番目がセリンに置換。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、460番目がイソロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換されており、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上しているポリペプチド。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、360番目がロイシンに置換、及び541番目がセリンに置換されており、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上しているポリペプチド。
- 配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換されており、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上しているポリペプチド。
- 次の(6)のアミノ酸置換と、次の(7)から(10)から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換と、が導入されており、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上しているポリペプチド:
(6)配列番号1に示すアミノ酸配列における528番目がバリンに置換、228番目がスレオニンに置換、及び460番目がイソロイシンに置換、
(7)配列番号1に示すアミノ酸配列における118番目がロイシンに置換、
(8)配列番号1に示すアミノ酸配列における462番目がグリシンに置換、
(9)配列番号1に示すアミノ酸配列における541番目がセリンに置換、
(10)配列番号1に示すアミノ酸配列における540番目がリシンに置換、541番目がセリンに置換、及び542番目がアラニンに置換。 - 上記アミノ酸置換がされたアミノ酸配列において、上記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上している請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 上記アミノ酸置換がされたアミノ酸配列において、配列番号1に示すアミノ酸配列に対する上記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1の示すアシルCoAシンテターゼ活性酵素と比較して熱安定性が向上している請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1から7のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているDNA。
- 下記(i)又は(ii)に示すDNAである、請求項8に記載のDNA 。
(i) 配列番号4に示す塩基配列からなるDNA 、
(ii) アシルCoAシンテターゼ活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるアシルCoAシンテターゼと比較して熱安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号4に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列を含むDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA 。 - 請求項8又は9に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項10に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項11に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1から7のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
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