KR101378690B1

KR101378690B1 - 내열성 디형젖산탈수소효소를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 그를 사용한 디형젖산 제조방법

Info

Publication number: KR101378690B1
Application number: KR1020120025601A
Authority: KR
Inventors: 전찬하; 사영승; 주정찬; 김세일; 김용환
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2012-03-13
Publication date: 2014-03-27
Also published as: KR20130104244A

Abstract

본 발명은 내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 그를 사용한 디형젖산 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 40℃ 내지 60℃에서 최적활성을 갖는 내열성 디형젖산탈수소효소를 포함하는 디형젖산 제조용 조성물, 상기 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환한 형질전환체를 배양하여 디형젖산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 내열성 디형젖산탈수소효소를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 상기 내열성 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환체를 배양하여 효율적으로 디형젖산을 제조할 수 있다.

Description

내열성 디형젖산탈수소효소를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 그를 사용한 디형젖산 제조방법{Composition for producing D-Lactate having thermostable D-lactate dehydrogenase, and preparation method of D-Lactate thereby}

본 발명은 내열성 디형젖산탈수소효소를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 그를 사용한 디형젖산 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 40℃ 내지 60℃에서 최적활성을 갖는 내열성 디형젖산탈수소효소를 포함하는 디형젖산 제조용 조성물 및 상기 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환한 형질전환체를 배양하여 디형젖산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

젖산(Lactic acid, Lactate) 및 그 유도체는 식품, 의약, 화장품, 가죽 및 섬유 등의 산업분야에 널리 이용되며, 최근에는 전문 의약품 및 친환경 생분해 물질 등의 원료로 중요한 의미를 가지고 있어, 젖산 및 그 유도체의 산업적으로 이용 가능한 제조방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Jong-sun Yun et al., Enzyme and Microbial Technology, 33, 416-423, 2003).

젖산은 그의 광학적 성질에 따라 디형(D형 또는 R형)과 엘형(L형 또는 S형)으로 나뉘는데, 특히 디형젖산 폴리머는 의료분야에서 생체적 합성 재료용으로 사용될 뿐 아니라 에스테르화 및 염소화하여 광학활성 제초제로서도 사용된다. 특히, 제초제가 광학활성을 갖는다면 약효가 훨씬 향상되고 적은 살포량으로도 동일한 효과를 나타낸다는 것이 확인되어 디형젖산의 수요가 증가하고 있다. 이렇듯 디형젖산 유도체는 여러 산업분야에서 엘형젖산 유도체들로 치환할 수 없는 제제를 만들기 위한 출발물질로서 그 수요가 증가하고 있어 높은 수율 및 광학적 순도를 지닌 디형젖산 유도체를 제조하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

젖산의 생산방법으로는 화학 합성법과 직접발효법이 있다. 화학합성법으로는 디형과 엘형이 혼합된 형태로 생산되고, 직접 발효법 중 일반적으로 이용되는 젖산균을 이용한 발효법은 젖산균의 성질에 따라 디형, 엘형 또는 혼합형이 생산되고, 대부분이 엘형이거나, 디형 및 엘형 혼합형이 많아 순수한 디형젖산의 생산은 어려운 실정이다. 이를 극복하기 위하여 곰팡이(Rhizopus 등)를 이용하거나 고초균(Bacillus laevolacticus 등)을 이용하기도 하지만 그 결과는 산업적으로 성공하지 못했다.

기존에 보고된 디형젖산 유도체의 다양한 제조방법들을 살펴보면, 젖산을 생산하는 균주의 돌연변이체(mutants) 중에서 디형젖산을 생산하는 균주를 스크리닝(screening)하는 방법(Demirci, J. Indus, Microbial, 11, 23-28, 1992), 라세믹 젖산을 화학적으로 분해하여 디형젖산을 분리하는 방법 및 세균의 할리도하이드롤레이즈(halidohydrolase)를 이용하여 L-2-클로로프로피온산(L-2-chloropropionic acid)을 디형젖산으로 치환하는 방법(Goldman, J. Biol. Chem.,243, 428-434, 1968) 등이 보고 되었으나, 이들은 디형젖산의 수율이 낮고 절차가 복잡하거나 생산 균주의 성장속도가 느리다는 단점이 있다.

또한, 디형젖산탈수소효소(D-lactate dehydrogenase)로 피루브산(pyruvic acid)을 환원시켜 디형젖산을 제조하거나(Simon, Appl. Biochem. Biotech., 22, 169-179, 1989)(도 1 참조), 엘형젖산탈수소효소(L-lactate dehydrogenase)를 이용하여 엘형젖산을 디형젖산으로 치환하는 방법(Biade, J.Am. Chem. Chem., 114, 893-897, 1992)들 역시 수율이 낮거나 사용된 효소 및 조효소(coenzyme) NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)의 가격이 높아 산업적 활용도가 낮은 문제점이 있다.

1. 한국공개특허 10-2005-0103691 2. 한국공개특허 10-1995-0026978

1. Isobe K, Koide Y, Yokoe M, Wakao N (2002) Crystallization and some properties of D-lactate dehydrogenase from Staphylococcus sp. LDH-1. J Biosci Bioeng 94:330-335. doi: 10.1016/S1389-1723(02)80173-6. 2. Mazzei F, Botre F, Favero G (2007) Peroxidase based biosensors for the selective determination of D,L-lactic acid and L-malic acid in wines. Microchem J 87:81-86. doi: 10.1016/j.microc.2007.05.009. 3. Okino S, Suda M, Fujikura K, Inui M, Yukawa H (2008) Production of D-lactic acid by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation. Appl Microbiol Biotechnol 78:449-454. doi: 10.1007/s00253-007-1336-7. 4. Kevin P, Andres HP(2011), The combined use of thermofluor assay and thermoQ analytical software for the determination of protein and buffer optimization as an aid in protein crystallization, Curr Protoc Mol Biol. Doi: 10.1002/0471142727.mb1028s94. 5. Gasser F, Doudoroff M, Rebecca C (1970) Purification and Properties of NAD-dependent Lactic Dehydrogenases of Different Species of Lactobacillus. Soc General Microbiol 62:241-250. 6. Dartois V, Phalip V, Schmitt P, Divies C (1995) Purification, properties and DNA sequence of the D-lactate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Res Microbiol 146:291-302. doi: 10.1016/0923-2508(96)81052-7. 7. Nina R, Anke Z, Werner H (2011) A single-point mutation enables lactate dehydrogenase from Bacillus subtilis to utilize NAD+ and NADP+ as cofactor. Eng Life Sci 11:26-36. doi: 10.1002/elsc.201000151.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물, 상기 내열성 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 도입한 형질전환체를 제공하여 효율적으로 디형젖산을 제조하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 형질전환체를 이용한 디형젖산을 제조하는 방법을 제공하여 효율적으로 디형젖산을 제조하는 데 목적이 있다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 제조용 조성물에 함유되는 내열성 디형젖산탈수소효소의 최적활성온도는 40℃ 내지 60℃ 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 제조용 조성물에 함유되는 내열성 디형젖산탈수소효소는 40℃ 내지 50℃ 온도조건에서 최대효소활성의 80 내지 100%를 유지하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 제조용 조성물에 함유되는 내열성 디형젖산탈수소효소는 a) 서열목록 제1서열에 기재된 디형젖산탈수소효소 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및 c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 제조용 조성물에 함유되는 내열성 디형젖산탈수소효소는 a) 서열목록 제2서열에 기재된 디형젖산탈수소효소의 염기 서열; b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및 c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 상술한 핵산분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 상술한 형질전환체는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, (a) 상기 상술한 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 형질전환된 숙주세포를 배양하여 내열성 디형젖산탈수소효소를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 수득한 내열성 디형젖산탈수소효소를 피루브산과 반응시키는 단계를 포함하는 디형젖산 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 생산방법의 피루브산과 반응시키는 단계는 40℃ 내지 60℃에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 생산방법의 피루브산과 반응시키는 단계는 pH 8 내지 10에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 생산방법에 사용되는 핵산분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 디형젖산 생산방법에 사용되는 형질전환된 숙주세포는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물 및 상기 내열성 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환체를 배양하는 방법을 통하여 효율적으로 디형젖산을 제조할 수 있다.

도 1은 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)에 의하여 반응되는 피루브산과 디형젖산 사이의 상호전환을 나타낸 화학식이다.
도 2는 디형젖산탈수소효소를 최우도방법(maximum-likelihood method)에 따라 분류하여 도시한 계통도이다. 교점에 기재한 퍼센트 숫자는 1000개의 리샘플된 데이터집합을 최우도방법으로 분석한 부트스트랩 서포트(bootstrap support) 값이다. 50% 이상의 값을 가지는 경우만 도시하였으며, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) V52로부터 유래한 디형젖산탈수소효소 유전자를 외집단(outgroup)으로 사용하였다.
도 3은 디형젖산탈수소효소에 대한 다중서열얼라인먼트 실험결과이다. 일치하는 부분은 별표로 표시하고, 유사한 부분은 점으로 표시하였다. 보존촉매영역(아르기닌, 글루타민, 히스티딘)은 실선화살표로 표시하고, NAD 결합영역(아스파르트산)은 점선화살표로 표시하였다. D-LDH1은 비교예 1이고, D-LDH2는 비교예 2이고, D-LDH3은 실시예 1이다.
도 4는 디형젖산탈수소효소의 발현 및 정제를 분석하기 위한 전기영동실험(SDS-PAGE 분석) 결과이다. M 레인: 마커, 1레인: 비교예 1을 발현하는 대장균 세포추출물, 2레인: 정제된 비교예 1, 3레인: 비교예 2를 발현하는 대장균 세포추출물, 4레인: 정제된 비교예 2, 5레인: 실시예 1을 발현하는 대장균 세포추출물, 6레인: 정제된 실시예 1.
도 5는 디형젖산탈수소효소의 발현 및 정제를 분석하기 위한 전기영동실험(native-PAGE 분석) 결과이다. M 레인: 마커, 2레인: 정제된 비교예 1, 4레인: 정제된 비교예 2, 6레인: 정제된 실시예 1.
도 6은 디형젖산탈수소효소의 온도 변화에 따른 접힘풀림현상 실험결과를 나타낸 그래프이다. 비교예 1은 청색선, 비교예 2는 적색선, 실시예 1은 흑색선으로 도시하였다.
도 7은 LightCycler 480를 사용하여 비교예 1의 T_m을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 LightCycler 480를 사용하여 비교예 2의 T_m을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 LightCycler 480를 사용하여 실시예 1의 T_m을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10는 디형젖산탈수소효소의 pH 변화에 따른 안정성 실험결과를 나타낸 그래프이다. 비교예 1은 ●, 비교예 2는 ▽, 실시예 1은 ■로 도시하였다.
도 11은 디형젖산탈수소효소의 온도 변화에 따른 안정성 실험결과를 나타낸 그래프이다. 각각의 온도에서 1시간 동안 배양한 후, 10분 동안 얼음위에서 냉각시킨 후 효소활성을 측정하였다. 대조군은 ○, 비교예 1은 ●, 비교예 2는 ▽, 실시예 1은 ■로 도시하였다.
도 12는 디형젖산탈수소효소의 최적활성온도를 나타낸 그래프이다. 각각의 온도에서 1시간 동안 배양한 후, 10분 동안 얼음위에서 냉각시킨 후 효소활성을 측정하였다(pH 8.0). 대조군은 ○, 비교예 1은 ●, 비교예 2는 ▽, 실시예 1은 ■으로 도시하였다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 디형젖산 제조용 조성물은 내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase, D-LDHs)를 함유하는 것을 특징으로 한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.

구체적으로 상기 내열성 디형젖산탈수소효소의 최적활성온도는 40℃ 내지 60℃ 인 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로는, 상기 내열성 디형젖산탈수소효소는 40℃ 내지 50℃ 온도조건에서 최대효소활성의 80 내지 100%를 유지하는 것이 가장 바람직하다. 상기보다 더 높은 온도에서 배양하는 경우 효소 활성이 저하되므로, 본 발명의 효과를 충분히 발휘하기 위해서는 상기 온도 범위에서 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 내열성 디형젖산탈수소효소는 a) 서열목록 제1서열에 기재된 디형젖산탈수소효소 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및 c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 한다.

본 발명의 내열성 디형젖산탈수소효소는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 디형젖산탈수소효소 활성을 갖는다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을 수록 더 바람직하다.

본 명세서에서 용어 '핵산 분자'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알로리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 디형젖산탈수소효소를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 디형젖산탈수소효소 활성을 포함하며, 동일성이 높을수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산 분자를 형성하는 능력을 언급하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자 중 하나의 길이 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 언급한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는 싱글 스트랜드 핵산 분자가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 언급한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열목록 제1서열과 엄격한 조건에서 혼성화 되는 염기 서열을 포함하는 핵산분자"는 서열목록 제1서열에 기재된 염기 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된 DNA 와 같은 핵산 분자를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "엄격"은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 사용될 수 있다.이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 핵산 분자를 검출한다.

한편, 혼성화될 수 있는 기타 핵산 분자는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트 웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 핵산 분자를 포함한다.

아미노산 서열 또는 염기 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 염기 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고, 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

본 발명에 있어서 벡터(vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.　벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다.　적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.　플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.　그러나 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다.

상기 내열성 디형젖산탈수소효소는 a) 서열목록 제2서열에 기재된 디형젖산탈수소효소의 염기 서열; b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및 c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 한다.

상기 상술한 핵산 분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것이 바람직하다.

상기 형질전환체는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 내열성 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 염기 서열을 BAC, 플라스미드, 포스미드 등의 적절한 벡터에 클로닝할 수 있으며, 상기 벡터는 적당한 숙주세포에 도입될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 상술한 재조합 벡터로 형질전환된 효모, 고초균, 대장균, 락토바실러스 중 어느 하나의 숙주세포를 특징으로 하며, 그 중에서도 락토바실러스가 가장 바람직하다. 재조합 벡터의 도입 방법 역시 공지의 기술, 즉열 충격법, 전기충격법 등을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

본 발명은 (a) 상기 상술한 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 형질전환된 숙주세포를 배양하여 내열성 디형젖산탈수소효소를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 수득한 내열성 디형젖산탈수소효소를 피루브산과 반응시키는 단계를 포함하는 디형젖산 생산방법을 제공한다. 상기 숙주세포의 배양은 선택된 숙주세포에 따라 당업자들에게 통상적으로 알려져 있는 배지, 배양온도, 배양시간 등을 사용한다.

본 발명의 디형젖산 생산방법의 피루브산과 반응시키는 단계는 40℃ 내지 60℃에서 이루어지는 것을 특징으로 한다. 상기보다 더 높은 온도에서 배양하는 경우 효소 활성이 저하되므로, 본 발명의 내열성을 충분히 활용하기 위해서는 상기 온도 범위에서 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 디형젖산 생산방법의 피루브산과 반응시키는 단계는 pH 8 내지 10에서 이루어지는 것을 특징으로 한다. 상기보다 더 낮거나 더 높은 산도에서 배양하는 경우 효소 활성이 저하되므로, 본 발명의 효과를 충분히 발휘하기 위해서는 상기 산도 범위에서 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 디형젖산 생산방법의 핵산분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것을 특징으로 한다.

상기 형질전환된 숙주세포는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 한다. 상술한 것처럼 숙주세포로는 효모, 고초균, 대장균, 락토바실러스 등이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 선호되는 숙주세포는 락토바실러스가 바람직하다.　

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

1. 계통 연구( Phylogenic analysis )

본 발명에서는 락토바실러스 젠센이 1153(Lactobacillus jensenii 1153, ABWG00000000), 락토바실러스 젠센이 JV-V16(Lactobacillus jensenii JV-V16, ACGQ00000000), 락토바실러스 젠센이 27-2-CHN(Lactobacillus jensenii 27-2-CHN, ACOF00000000), 락토바실러스 젠센이 269-3(Lactobacillus jensenii 269-3, ACOY00000000), 락토바실러스 젠센이 SJ-7A-US(Lactobacillus jensenii SJ-7A-US, ACQD00000000). 락토바실러스 젠센이 115-3-CHN(Lactobacillus jensenii 115-3-CHN, ACQN00000000). 락토바실러스 젠센이 208-1(Lactobacillus jensenii 208-1, ADEX00000000) 및 그 유사군집의 유전자 정보로부터(GenBank database) 디형젖산탈수소효소(Dextrorotary Lactate Dehydrogenases, D-LDHs)를 암호화하는 유전자를 분리하였다.

상기에서 분리된 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자를 계통수에 따라 두 개의 단일계통군으로 그룹지었다(도 2 참조). L. gasseri, L. johnsonii 및 L. acidophilus로부터 유래된 유전자를 클러스터Ⅰ으로 그룹화하고, 45℃에서 성장할 수 있는 L. delbruekii으로부터 유래된 유전자를 클러스터Ⅱ로 그룹화하였다.

이를 통해 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자 3개, D-LDH1(Lactobacillus jensenii SJ-7A-US), D-LDH2(Lactobacillus jensenii 115-3-CHN) 및 D-LDH3(Lactobacillus jensenii 269-3)를 선별하였다. 상기 유전자를 각각 순서대로 비교예 1, 비교예 2 및 실시예 1로 명명하였다.

상기 실시예 1의 아미노산 서열에 대해서는 제1서열에 첨부하였고, 실시예 1의 염기서열에 대해서는 제2서열에 첨부하였다.

상기 3개 유전자의 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 SignalP 4.0 서버를 통하여 분석하고, 다중 서열 얼라인먼트로 디형젖산탈수소효소 유전자의 동일성을 분석하였다. 상기 다중서열 얼라인먼트 결과는 도 3에 나타내었다.

상기 효소는 보존촉매(conserved catalytic) 및 NAD 결합 잔기를 보유하였다. 상기 동일성 분석 결과는 비교예 1과 비교예 2는 98%의 유사성을 나타낸 반면, 비교예 2와 실시예 1은 33%의 아미노산만이 동일하여 아미노산 조성이 유의적으로 상이한 것을 알 수 있었고, 구체적인 아미노산 성분 대비 결과는 다음 표 1과 같다.

아미노산	비교예1	비교예2	실시예1
알라닌(Alanine)	30 ( 8.50 %)	30 ( 9.01 %)	38 (11.52 %)
시스테인(Cysteine)	2 ( 0.57 %)	0 ( 0.00 %)	2 ( 0.61 %)
아스팔산(Aspartic acid)	32 ( 9.07 %)	31 ( 9.31 %)	23 ( 6.97 %)
글루탐산(Glutamic acid)	22 ( 6.23 %)	24 ( 7.21 %)	22 ( 6.67 %)
페닐알라닌(Phenylalanine)	13 ( 3.68 %)	13 ( 3.90 %)	12 ( 3.64 %)
글라이신(Glycine)	23 ( 6.52 %)	23 ( 6.91 %)	17 ( 5.15 %)
히스티딘(Histidine)	9 ( 2.55 %)	8 ( 2.40 %)	7 ( 2.12 %)
이소류신(Isoleucine)	21 ( 5.95 %)	18 ( 5.41 %)	28 ( 8.48 %)
라이신(Lycine)	27 ( 7.65 %)	25 ( 7.51 %)	27 ( 8.18 %)
류신(Leucine)	22 ( 6.23 %)	22 ( 6.61 %)	30 ( 9.09 %)
메티오닌(Methionine)	13 ( 3.68 %)	11 ( 3.30 %)	9 ( 2.73 %)
아스파라긴(Asparagine)	18 ( 5.10 %)	15 ( 4.50 %)	16 ( 4.85 %)
프롤린(Proline)	14 ( 3.97 %)	14 ( 4.20 %)	11 ( 3.33 %)
글루타민(Glutamine)	10 ( 2.83 %)	8 ( 2.40 %)	5 ( 1.52 %)
아르기닌(Arginine)	14 ( 3.97 %)	13 ( 3.90 %)	9 ( 2.73 %)
세린(Serine)	9 ( 2.55 %)	7 ( 2.10 %)	19 ( 5.76 %)
트레오닌(Tereonine)	17 ( 4.82 %)	17 ( 5.11 %)	18 ( 5.45 %)
발린(Valine)	41 (11.61 %)	40 (12.01 %)	24 ( 7.27 %)
트립토판(Tryptophan)	4 ( 1.13 %)	3 ( 0.90 %)	0 ( 0.00 %)
타이로신(Tyrosine)	12 ( 3.40 %)	11 ( 3.30 %)	13 ( 3.94 %)

보다 구체적으로 살펴보면, 비교예 2는 비교적 전하성 잔기가 차지하는 비중이 더 높은 반면, 실시예 1은 소수성 잔기가 자치하는 비중이 40%나 되어 더 높은 것을 알 수 있다. 보다 구체적으로 실시예 1의 아미노산 구성 조성은 알라닌 11.52%, 발린 8.48%, 이소류신 9.09%, 류신 3.64%, 페닐알라닌 3.64%를 차지하는 것을 알 수 있다.

이러한 소수성 잔기가 열적안정성에 영향을 미치는 것으로 추정할 수 있으며, 특히 두 개의 시스테인 사이에서 형성되는 이황화결합(disulfide bond)은 실시예 1에 존재할 뿐, 비교예 1 및 비교예 2에서는 존재하지 않는다.

2. 디형젖산탈수소효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

C-말단을 헥사히스티딘(hexa-histidine)으로 표지한 디형젖산탈수소효소를 암호화하는 유전자를 pUC57벡터(Genescript, 미국)를 이용하여 화학적으로 합성하였다. N-말단은 Nde Ⅰ의 제한영역을 포함하고, C-말단은 EcoR Ⅰ의 제한영역을 더 포함하도록 준비하였다.

상기 디형젖산탈수소효소 유전자를 NdeⅠ 및 EcoRⅠ으로 처리하고, 이를 NdeⅠ 및 EcoRⅠ으로 처리한 pET-22b(+) 벡터(Novagen, 미국)와 연결(ligation)하여서 형질전환체를 제조하는 데 사용하였다.

상기 제작된 pET-22b(+)-디형젖산탈수소효소 벡터를 통상의 기술자에게 알려진 방법을 통하여 E. coli BL21(λDE3, RBC 바이오사이언스, 타이완)에 도입하여 혈질전환체를 제조하였다.

3. 디형젖산탈수소효소의 발현 및 정제

상기 제조한 E. coli 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린(ampicillun)을 첨가한 Luteria-Bertani(LB) 배지 3㎖(트립톤 10g, 효모추출물 5g, 염화나트륨 10g)에 접종하여 밤샘 배양하고, 100㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 첨가한 Luteria-Bertani(LB) 배지 50㎖를 새로 접종하여 37℃, 200rpm에서 배양하였다. 600㎚에서의 흡광도가 0.6 내지 0.8에 도달하였을 때, 1.0mM 이소프로필-베타-디-사이오갈락토피라노사이드(isopropryl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 25℃, 200rpm에서 4시간 동안 배양하여 디형젖산탈수소효소의 발현을 유도하였다.

배양 후 균체를 13,000g, 4℃, 30분 동안 원심분리한 후 상청액은 부어내어 회수하였다. 회수한 균체 펠렛을 라이소자임(lysozyme)과 벤조네이즈 뉴클레이즈(Benzonase^® Nuclease)를 함유한 용해완충액(lysis buffer, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)로 재현탁하였다. 상기 현탁액을 얼음 위에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 주면서 냉각한 후 13,000g, 4℃, 30분 동안 원심분리하여서 수용성 분획과 불수용성 분획을 분리한다.

상기에서 수득한 수용성 재조합 디형젖산탈수소효소는 Ni-NTA 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 구체적으로, Ni-NTA 칼럼을 세척완충액(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 8.0)으로 2회 세척한 후 수용성 재조합 디형젖산탈수소효소를 포함하는 상청액을 직접 Ni-NTA 칼럼으로 주입하였다. 이후 300㎕ 용출완충액(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 재조합 디형젖산탈수소효소를 최종적으로 용출하였다.

4. 실험 및 평가방법

1) 효소의 발현 및 순도

상기 제조된 재조합 디형젖산탈수소효소의 발현 및 순도는 Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)와 Native PAGE를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) 표준을 사용하여 측정하였다.

2) 효소활성 측정

상기 재조합 디형젖산탈수소효소의 활성은 디형젖산탈수소효소에 의해 분해되는 산화환원과정 동안의 NADH 농도를 연속식 340㎚ UV 흡광기로 분석하여 측정하였다. 1단위는 표준상태(25℃, pH 8.0) 하에서 1μmol NADH의 산화를 촉진시키는 효소의 양으로 정의하였다.

환원 반응에서의 효소 활성 결정은, 기질용액(50mM Triz-HCl 완충액에 피루브산을 50mM로 희석하여 제조, pH 8.0) 2.94㎖, 20mM NADH 용액(증류수에 희석) 60㎕, 효소용액 10㎕를 함유하는 분석 혼합물로 평가하였다.

디형젖산의 산화에 대한 효소 활성 결정은, 기질용액(50mM Triz-HCl 완충액에 디형젖산을 100mM로 희석하여 제조, pH 8.0) 2.94㎖, 100mM NAD⁺ 용액(증류수에 희석) 60㎕, 효소용액 10㎕를 함유하는 분석 혼합물로 평가하였다. 모든 반응은 효소용액의 첨가와 함께 시작되었다.

2) pH 의존성

상기 재조합 디형젖산탈수소효소의 pH 의존성은 상기 서술된 표준 산화 활성 측정법에 따라, 모든 조건은 일정하게 유지하고 오로지 pH만을 변화하면서 평가하였다. 디형젖산탈수소효소의 최적 pH는 표준 활성 완충액 Triz-HCl(pH 8.0 - 9.0), MES(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, pH 6.0 - 7.0) 및 구연산 칼륨(potassium citrate, pH 5.0)을 사용하여 측정하였다.

3) 내열성

상기 재조합 디형젖산탈수소효소의 내열성은 열역학적 안정성, 온도의존성 및 효소반응속도 측정을 통해 평가하였다.

서로 상이한 온도에서 배양한 후 잔여 활성을 측정하여 디형젖산탈수소효소의 열안정성을 평가하였다. 잔여 효소 활성을 측정하기 전에 효소액을 25℃ 내지 60℃의 서로 상이한 온도에서 한 시간 동안 배양하고, 얼음 위에서 10분 동안 냉각하였다.

효소의 열불활성화에 대한 저항성(T₅₀ ⁶⁰)은 25℃에서 1시간 배양한 경우의 효소 활성과 대비하여 효소 잔여 활성이 50% 남아 있는 경우의 온도로 표시하였다.

Melting transition의 중앙값(T_m)은 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 유전자 증폭기(real time quantitative PCR thermal cycler)를 이용한 DSF(differential scanning fluorimetry), (LightCycler 480, 로슈)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, Sypro Orange Dye(인비트로젠, 미국)를 사용하여 효소의 중첩풀림(unfolding)을 측정하였다. Sypro Orange (DMSO에 준비된 5000× 스톡) 20㎕와 인산완충액(phosphate buffer, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, pH 8.0) 980㎕를 혼합하여 100× 스톡솔루션(stock solution)을 준비하였다. 10 내지 50μM 정제된 디형젖산탈수소화효소 20㎕, 인산완충액 20㎕, 100× Sypro Orange (최종 용액 농도 기준 20×) 10㎕를 혼합하여 제조한 효소 염색액 50㎕를 96-well 정량 PCR 마이크로플레이트에 점적한 다음, Kebin and Andres의 논문(비특허문헌 4)에 기재된 방법에 따라 20℃ 내지 80℃에서 가열하였다. T_m값은 LightCycler 480을 사용하여 측정하였다.

온도 의존성은 상기 서술된 표준 산화 활성 측정법에 따라 측정하였다. 모든 조건은 일정하게 유지하고, 오로지 온도만을 변화하여 평가하였으며, 효소 용액을 25℃ 내지 45℃에서 60분 동안 배양한 후 효소활성을 분석하였다. 상기 반응은 분석 용액에 효소를 첨가하면서 개시하였다.

반응속도상수를 분석하기 위하여, 0.02 ~ 0.50mM의 NADH를 50mM의 피루브산과 실험하였고, 0.02 ~ 2.00mM의 NAD⁺를 100mM의 디형젖산과 실험하였다. 실험결과는 라인위버-버크 그래프(Lineweaver-Burk plot)로 분석하였다.

5. 실험결과

1) 정제 및 효소활성

상기 상술한 방법에 의하여 발현 및 정제된 재조합 디형젖산탈수소효소는 NAD⁺를 보조인자로 하는 디형젖산의 산화과정에서 1.5 내지 6.7U/㎎의 특이적 활성을 나타내었다.

해당 효소에 대한 전기영동실험결과, 분자량 34 내지 43 kDa에 해당하는 범위에서 밴드가 형성되었고, 보다 구체적으로 밴드가 형성된 분자량은 39.93, 37.73 및 37.41 kDa 인 것으로 확인되었다(도 4 참조). 또한, 실시예 1에 대한 전기영동실험(native PAGE) 결과는 상부에 밴드가 나타나 있는 것을 알 수 있다(도 5 참조).

온도 변화에 따른 접합풀림 측정결과는 도 6에 도시하였다. 본 발명에 따른 효소의 열역학적 안정성은 결과는 도 11에 도시하였다. 실험결과, 실시예 1(검정선)은 비교예 1(청색선) 및 비교예 2(적색선)와 대비하여 가장 높은 열역학적 안정성을 보였다.

상기 결과를 각 효소별로 분석한 결과는 각각 도 7 내지 도 9에 도시하였다. 각 효소마다 3회 내지 4회 반복측정하였으며, 비교예 1은 도 7, 비교예 2는 도 8, 실시예 1은 도 9에 각각 나타내었다. 모든 분석 결과는 높은 반복재현성을 보였다.

실시예 1은 55.7℃로 높은 전이최고점(transition peak)를 보여 비교예 1(48.59℃)과 비교예 2(45.66℃)의 효소에 비하여 높은 열역학적 안정성을 가진다 (도 6 내지 도 9 참조).

2) pH 의존성

NAD⁺를 사용하여 측정한 상기 재조합 디형젖산탈수소효소의 최적 pH는 도 10에 도시하였다. 실험결과, 비교예 1(●) 및 비교예 2(▽)는 pH 8 정도에서 최적의 활성을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 실시예 1은 pH 9 에서 최적 활성을 나타내었다.

Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , Lactobacillus delbreuckii , Staphylococus epidermidis와 같은 다른 급원으로부터 유래한 디형젖산탈수소효소는 pH 7.4 내지 8.5에서 최적 활성을 나타내는 것을 보고된 바 있다(비특허문헌 1 내지 3 참조).

이는 L. jansenii에서 유래한 디형젖산탈수소효소의 최적 pH가 7.8 정도라는 기존의 연구보고 및 비교예들과 비교하여, 본 발명에 따른 디형젖산탈수소효소(실시예 1)는 더욱 알카리성 환경에서 최적 활성을 나타내는 것이다.

3) 내열성

열불활성화에 대한 저항성(T₅₀ ⁶⁰)은 효소의 열역학적 안정성을 비교하여 측정하였다. 시중에서 시판되고 있는 Lactobacillus mesenteroides에서 유래한 디형젖산탈수소효소를 대조군으로 비교실험하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

실험 결과, 50℃에서 1시간 동안 배양한 이후, 비교예1(●), 비교예2(∇) 및 대조군(○)은 효소 잔여 활성이 없었으나, 실시예1(■)은 25℃에서 1시간 동안 배양한 경우의 활성을 그대로 유지하였다.

T₅₀ ⁶⁰값 및 T_m값은 다음 하기 표 2와 같다. 한편 실시예의 T₅₀ ⁶⁰값은 55℃에서 1시간 동안 배양하는 경우 급격하게 활성 저하를 보여서 정확하게 산출하기는 어려웠으나, 50~55℃에 존재할 것으로 예측된다(도 11 참조).

분류	T₅₀ ⁶⁰(℃)	T_m(℃)
실시예1	50~55	55.72
비교예1	38.8	48.59
비교예2	34.9	45.66
대조군	42.7	-

상기의 결과는, Lactobacillus jansenii 62G로부터 유래한 디형젖산중합효소를 50℃에서 5분간 배양한 결과 25%의 활성을 상실하는 결과를 보고한 Gasser et al(비특허문헌 5)의 결과와 비교될 수 있다.

디형젖산탈수소효소의 온도 의존성을 평가하기 위한 최적활성온도는 NAD⁺ 보조인자 및 디형젖산 기질을 사용하여 측정하였으며, 그 결과는 도 12에 도시하였다.

실험 결과, 본 발명에 따른 실시예 1만이 상승된 온도 조건에서 효소 활성이 증가하는 결과를 보였다. 보다 구체적으로, 40℃에서 1시간 동안 배양하였을 때, 실시예 1만이 25℃에서 1시간 배양한 경우와 대비하여 거의 대부분의 활성을 유지하였다. 45℃에서 1시간 배양하였을 때, 비교예 1 및 비교예 2는 25℃에서 1시간 동안 배양한 경우와 대비하여 5% 이하의 활성을 유지한 반면, 실시예 1은 오히려 증가하려 120%의 효소활성을 나타내었다.

디형젖산탈수소효소의 반응속도상수를 분석한 결과는 하기 표 3과 같다. 비교예 1 및 비교예 2의 NADH에 대한 K_m값은 각각 0.7mM 및 2.83mM이고, NAD⁺에 대한 K_m값은 각각 2.75mM 및 2.58mM 이었다. 반면, 실시예 1의 NADH에 대한 K_m값은 0.036mM이고, NAD⁺에 대한 K_m값은 0.41mM이었다.

		비교예 1	비교예 2	실시예 1
분자량(MW)		39.93	37.73	37.41
NADH	K _m (mM)	0.70	2.83	0.04
	v _max (U/mg)	216.92	821.24	13.28
	k _cat (s^-1)	144.36	516.42	8.28
	k _cat/K _m (mM^-1·s^-1)	206.29	182.57	232.63
NAD⁺	K _m (mM)	2.75	2.58	0.41
	v _max (U/mg)	6.64	5.81	1.03
	k _cat (s^-1)	4.42	3.65	0.64
	k _cat/K _m (mM^-1·s^-1)	1.61	1.41	1.56

6. 실험결과에 대한 고찰

상기 실험결과를 종합하면, 본 발명에 따른 디형젖산탈수소효소(실시예 1)는 열에 불안정한 다른 비교예 효소들과 비교하여 소수성 잔기의 비중이 많고, 이들 아미노산 간의 소수성 작용에 의한 소중합체화 반응(oligomerization)을 통하여 열적안정성을 획득하는 것을 추정할 수 있다.

한편, 실시예 1에 대한 전기영동실험(native PAGE) 결과(도 5)는 상부에 밴드가 나타난 점은 본 발명에 따른 디형젖산탈수소효소가 동형이량체(homodimer)일 가능성을 제시하고 있다.

또한, 실시예 1에 따른 효소는 최고전이점 분석결과 두 개의 전이점(51.45℃ 및 55.72℃)을 가지며, 이것은 상기 효소의 구조가 동형이량체(homodimer)라는 점을 제시한다. 즉, 온도에 따른 변성과정 동안, 실시예 1의 효소는 51℃에서 먼저 단량체(monomer)간의 분리가 먼저 일어나고, 55℃에서 단량체의 풀림현상이 일어나는 것으로 설명할 수 있다.

상기 온도안정성에 대한 실험결과를 종합하면, 본 발명에 따른 디형젖산탈수소효소(실시예 1)의 이합체화(dimerization)는 열적안정성 획득에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. 더욱이, 단량체 상태에서도 어느 정도의 효소 활성을 보유한다는 점을 고려할 때(즉, 50℃ 이상 55℃ 이하에서의 배양), 이합체화 반응은 상기 효소의 작용보다는 열적안정성에 더욱 기여하는 것으로 결론지을 수 있다.

상기 반응속도상수에 대한 실험결과를 종합하면, 본 발명에 따른 디형젖산탈수소효소(실시예 1)는 디형젖산 산화 방향보다 피루브산 환원 방향으로 더욱 높은 반응 효율을 보이고, 특히 NADH에 대한 K_m과 NAD⁺에 대한 K_m이 각각 0.04mM 및0.41mM로서, 비교예 1, 비교예 2의 효소 및 기존에 보고(비특허문헌 6 및 7 참조)된 다른 디형젖산탈수소효소와 대비하여 더욱 효율적으로 디형젖산을 합성한다는 것을 추정할 수 있다.

결론적으로, 본 발명은 동일하게 락토바실러스 잔센이로부터 유래한 여타의 디형젖산탈수소효소와 대비하여 구조적으로 상이하고, 예상치 못할 정도로 우수한 열적안정성을 보유하고 있다. 따라서 본 발명은 디형젖산의 산업적 생산 또는 이를 사용한 디형젖산중합체나 바이오플라스틱의 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물로서,
상기 내열성 디형젖산탈수소효소는 하기 a) 내지 c) 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 디형젖산 제조용 조성물.
a) 서열목록 제1서열에 기재된 디형젖산탈수소효소 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및
c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열.
내열성 디형젖산탈수소효소(D-Lactate Dehydrogenase)를 함유하는 디형젖산 제조용 조성물로서,
상기 내열성 디형젖산탈수소효소는 하기 a) 내지 c) 중에서 선택된 하나 이상의 염기 서열로 이루어진 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 디형젖산 제조용 조성물.
a) 서열목록 제2서열에 기재된 디형젖산탈수소효소의 염기 서열;
b) 상기 a) 염기 서열에 상보적인 염기 서열; 및
c) 상기 a) 또는 b)의 염기 서열과 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 염기 서열.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 핵산분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 디형젖산 제조용 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 형질전환체는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 하는 디형젖산 제조용 조성물.
다음의 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는 디형젖산 생산방법;
(a) 상기 제4항 또는 제5항에 따른 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 형질전환된 숙주세포를 배양하여 내열성 디형젖산탈수소효소를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 수득한 내열성 디형젖산탈수소효소를 피루브산과 반응시키는 단계.
제8항에 있어서,
상기 피루브산과 반응시키는 단계는 40℃ 내지 60℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 디형젖산 생산방법.
제8항에 있어서,
상기 피루브산과 반응시키는 단계는 pH 8 내지 10에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 디형젖산 생산방법.
제8항에 있어서,
상기 핵산분자는 락토바실러스 젠센이(Lactobacillus jensenii) 속 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 디형젖산 생산방법.
제8항에 있어서,
상기 형질전환된 숙주세포는 락토바실러스 속 균주인 것을 특징으로 하는 디형젖산 생산방법.