JP3769289B2 - 新規蛋白質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途 - Google Patents
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Description
れている可能性、或いは同様にして生じたグルタミン含有低分子ペプチドがペプチドグルタミナーゼ様酵素により脱アミドされている可能性が残されている。或いはまたプロテアーゼの副反応により脱アミドされている可能性も否定できない。とりわけ、上記の報告中において、用いられた部分精製標品中に遊離のグルタミンに作用してアンモニアを遊離するグルタミナーゼ活性が存在することが明記されていることは特記すべきである。このように、高分子蛋白質に作用して脱アミド反応を触媒する酵素について、単一蛋白質まで精製し、さらに遺伝子を単離し発現させることにより、その存在を証明した報告はこれまでにはなかった。とりわけ、工業的生産に有利な微生物由来のそのような酵素は、これまでに知られていなかった。
そこで、本願発明者は、広く微生物界に適用できるスクリーニング法を確立し、当該方法を用いることにより、蛋白質の低分子化を招かず、蛋白質を脱アミド化する酵素を生産する微生物を、微生物界において広く見出すことに成功し、当該微生物の培養、脱アミド酵素の分離・精製により本願発明を完成した。
従って、本発明は、以下の構成からなる。
(1)蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素。
(2)蛋白質中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する酵素。
(3)該酵素が微生物由来であることを特徴とする上記(1)又は(2)記載の酵素。 (4) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を有し、蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有するポリペプチドからなるポリペプチド。
(5) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるポリペプチド。
(6) 蛋白質中のアミド基を脱アミドする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド。
(7) 蛋白質中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず、脱アミドする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド。
(8) 下記(a)〜(g)から選択されるヌクレオチドからなり、かつ、蛋白質中のアミド基を脱アミドする活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドからなるヌクレオチド。
(a)配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド、
(b)配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド、
(c)配列表の配列番号5に記載の塩基配列を有するヌクレオチド、
(d)配列表の配列番号5に記載の塩基配列において、1個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされている塩基配列を有するヌクレオチド、
(e)上記(a)〜(d)のいずれかに記載のヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド、
(f)上記(a)〜(d)のいずれかに記載のヌクレオチドに相同性を有するヌクレオチド、
(g)上記(a)〜(f)の少なくともいずれか1つに記載のヌクレオチドに縮重するヌクレオチド。
(9) 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドからなるヌクレオチド。
(10) 上記6から9のいずれかに記載のヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
(11) 上記(10)記載の組換えベクターを導入させた形質転換体。
(12) 上記(11)記載の形質転換体を培養し、蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素を生産せしめ、培養物より蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素を採取することを特徴とする蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素の製造法。
(13) 上記(11)記載の形質転換体を培養し、該培養物から採取される、蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する組換えポリペプチド。
(14)微生物を栄養培地に培養し、蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する新規な酵素を生産せしめ、該酵素を採取することを特徴とする新規な酵素の製造法。
(15)微生物を栄養培地に培養し、蛋白質中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する新規な酵素を生産せしめ、該酵素を採取することを特徴とする蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する新規な酵素の製造法。
(16)微生物がシトファガレス(Cytophagales)或いはアクチノマイセテス(Actinomycetes)に分類される細菌である上記(14)或いは上記(15)記載の製造法。
(17)微生物がフラボバクテリアチェ(Flavobacteriaceae)に分類される細菌である上記(14)或いは上記(15)記載の製造法。
(18)微生物がクリセオバクテリウム(Chryseobacterium)属、フラボバクテリウム(Flavobacteium)属、エンペドバクター(Empedobacter)属、スフインゴバクチリウム(Sphingobacterium)属、アウレオバクテリウム(Aureobacterium)属及びミロイデス(Myroides)属より選ばれる上記(14) 或いは上記(15)記載の製造法。
(19)微生物がクリセオバクテリウム(Chryseobacterium)属である上記(14)或いは上記(15)記載の製造法。
(20)微生物がクリセオバクテリウム(Chryseobacterium)属に属する新菌クリセオバクテリウム・エスピー(Chryseobacterium sp.)No. 9670(FERM BP−7351)である上記(14)或いは上記(15)記載の製造法。 (21)蛋白質或いはペプチドに、蛋白質或いはペプチド中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する酵素を作用させることを特徴とする蛋白質或いはペプチドの修飾法。
(22)蛋白質或いはペプチド中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず、脱アミドする作用を有する酵素を有効成分としてなる蛋白質或いはペプチドの修飾用組成物。 (23)単離されたクリセオバクテリウム(Chryseobacterium)属に属する新菌クリセオバクテリウム・エスピー(Chryseobacterium sp.)No. 9670(FERM BP−7351)。 (24)蛋白質及びペプチド中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず、脱アミドする作用を有する酵素を植物性、動物性蛋白質及び/又はペプチドに作用させ、当該蛋白質及び/又はペプチドの機能性を改善する方法。 (25)蛋白質及びペプチド中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず、脱アミドする作用を有する酵素を植物性、動物性蛋白質及び/又はペプチドを含む食品に作用させ、当該食品の機能性を改善する方
法。
即ち、本発明の蛋白質脱アミド酵素は、ポリペプチドを含むジペプチド以上から高分子の蛋白質まで基質とすることができる。なお、本願明細書の「ポリペプチド」という用語は、蛋白質を含む。
また、本発明により、蛋白質脱アミドの一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造が可能となる。
Press, Cambridge, United Kingdom)を参照して行う事が出来る。3)における栄養培地での培養も同様である。これらの選定及び実施は、当業者ならば不必要、不適切、広範且つ過度の実験を強いられるものではない。
1994. New Perspective in the Classification of the Flavobacteria: Description of Chryseobacterium gen. nov., Bergeyella gen. nov., and Empedobacter nom
. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 827-831.(2) Holmes, B., R. J. Owen, and T. A. McMeekin. 1984. Genus Flavobacteruium Bergey, Harrison, Breed, Hammer, and Huntoon 1923, 97AL, p.353-361. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol.1. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.
菌体細胞の形: 桿菌
グラム染色性: 陰性
運動性: 陰性
胞子形成: 陰性
II.生理的性質
u/ml=1.76×[A1(E1-E2)-A2(E1-E2)]
基質として10mmol/l Z-Gln-Glyに代えて1%カゼイン(ハマーステン、メルク社製)を用いて同様にして活性を求め、蛋白質に結合するアミド基に作用することを確認する。この時同時に反応停止後の遠心上清について280 nmの吸光度を測定することによりプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性は、この条件下で1ODユニット上昇させる酵素量を1単位とした。
試薬A
0.2 mol/l トリス塩酸緩衝液(pH6.0)
0.1 mol/l ヒドロキシルアミン
0.01 mol/l 還元型グルタチオン
0.03 mol/l ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシン
試薬B
3 mol/l 塩酸
12 % トリクロロ酢酸
5% FeCl3・6H2O(0.1mol/l HCl に溶解)
上記溶液の1:1:1の混合液を試薬Bとする。
酵素液の0.05mlに試薬A 0.5mlを加えて混合し、37℃で10分間反応後、試薬B 0.5mlを加えて反応停止とFe錯体の形成を行った後、525nmの吸光度を測定する。対照として予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別に酵素液のかわりにL−グルタミン酸γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差により生成されたヒドロキサム酸の量を求め、1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位とした。
尚、蛋白質の定量はBCAプロテイン・アッセイ・キット(ピアース社製)により、牛血清アルブミンを標準蛋白質として用いて定量した。
(2)至適pHの測定:各pHの(10mmol/lのZ-Gln-Glyを含む)100μl[40mmol/lブリットン−ロビンソン緩衝液(pH3〜12)を37℃で5分間予熱後、0.32μgの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液10μlを加え、37℃で60分間反応し、酵素活性を測定した。その結果、至適pHは6付近であった。
各種蛋白質に本発明の蛋白質脱アミド酵素を作用させる。蛋白質としては上記酵素の作用を受けるものであればいかなるものであってもよく、例えば、植物性蛋白質であれば豆類、穀類由来の蛋白質、動物性蛋白質であればカゼイン、β−ラクトグロブリンなどの乳蛋白、オボアルブミンなどの卵蛋白、ミオシン、アクチンなどの肉蛋白、血清アルブミンなどの血液蛋白、ゼラチン、コラーゲンなどの腱蛋白質があげられる。また、酸、アルカリなどによる化学的、あるいはプロテアーゼなどによる酵素的部分分解蛋白質や、各種試薬による化学修飾蛋白質や
、合成ペプチドであってもよい。
るヌクレオチド、(e)上記(a)〜(d)のいずれかに記載のヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、(f)上記(a)〜(d)のいずれかに記載のヌクレオチドに相同性を有するヌクレオチド、(g)上記(a)〜(f)の少なくともいずれか1つに記載のヌクレオチドに縮重するヌクレオチド。
まず、蛋白質脱アミド酵素を産生する微生物のゲノムDNA を鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて PCR反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。PCR 法は、PCR テクノロジー〔PCR Technology、エルリッヒ(Erlich)HA編集、ストックトンプレス社(Stockton press)、1989年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅 DNA断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に蛋白質脱アミド酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の蛋白質脱アミド酵素遺伝子の一部を取得することができる。もちろん得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって蛋白質脱アミド酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
また、本発明の蛋白質脱アミド酵素遺伝子は、配列番号6に記載のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドや該ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、該ヌクレオチドに相同性を有するヌクレオチド、及び該ヌクレオチドに縮重するヌクレオチドもそれらがコードするポリペプチドが蛋白質脱アミド酵素活性を有する限り本発明に含まれる。
まず、目的の蛋白質脱アミド酵素遺伝子を含むベクターを用いて宿主の形質転換を行い、次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、蛋白質脱アミド酵素活性を有するポリペプチドを生産させることができる。
ed Dual Amber :ODA )法、ジーン、第 152巻、第271 〜275 頁(1995)、特開平7-289262号公報〕、 DNAの修復系を誘導させた宿主を利用する方法(特開平 8-70874号公報)、 DNA鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法(特開平8-140685号公報)、制限酵素の認識部位を付加した2種類の変異導入用プライマーを用いた PCRによる方法(USP5,512,463)、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖 DNAベクターと2種類のプライマーを用いた PCRによる方法〔ジーン、第 103巻、第73〜77頁(1991)〕、アンバー変異を利用した PCRによる方法〔国際公開WO98/02535号公報〕等を用いることができる。
a)集積培養:Cbz-Gln-Glyを唯一のN源としたA培地5mlに320の土壌サンプルを接種し、30度で6日間振トウ培養した。その培養液50μlを新しいA培地に接種し、さらに30度で3日間振トウ培養した。培養液を栄養培地にSpreadもしくはStreakして生育してきたバクテリアもしくはFungiを単菌分離した。
b)プレート選択:得られた菌株を、1.5%の寒天を含むA培地からなる寒天培地にレプリカして、30度、6日間培養し、生育した菌株(バクテリア150株、Fungi294株)をピックアップした。
c)蛋白質脱アミド酵素生産性チェック:これらの菌株をラクトース液体培地に接種し、30度、2から7日間振トウ培養し、培養液を遠心分離して、培養上清を得た。この培養上清中の蛋白質脱アミド酵素活性を測定したところ、バクテリア50株、Fungi85株が陽性であった。
*A培地:0.1% Cbz-Gln-Gly, 0.5% Glucose, 0.02% KH2PO4, 0.02% MgSO4・7H2O,
0.01% NaCl,0.002% CaCl2,0.0002% FeSO4・7H2O,0.0005% NaMoO4・2H2O,
0.0005% NaWO4・4H2O, 0.0005% MnSO4・4H2O, 0.01% CuSO4・5H2O (pH8.0)
*ラクトース液体培地:0.5% lactose, 1.0% peptone,0.17% Na2HPO4・H2O,0.025%
KH2PO4, 0.025% MgSO4・7H2O and 0.005% FeSO4・7H2O(pH7.2, adjusted
with 6mol/l NaOH).
示す。
小麦グルテン、乳カゼイネート、乳清蛋白質、卵白蛋白質及び大豆蛋白質1gを100 mlの100 mmol/l 燐酸ナトリウム緩衝液(pH 6.5)に縣濁し、6.13 Uの蛋白質脱アミド酵素を添加して、37 ℃で24時間振とう反応させた。この時の脱アミド化率の変化のタイムコースを図2に示す。脱アミド化率は、反応終了後に溶液中に遊離したアンモニア又はアンモニウムを定量し、蛋白質の総アミド含量に対する百分率として表した。蛋白質の総アミド含量は、蛋白質(2% w/v)を1.5mol/l硫酸中110℃で3時間加水分解し、遊離したアンモニアを定量して求めた。このように、対照として行った酵素無添加の反応ではアンモニアの遊離が観察されなかったのに対し、酵素添加の反応においては、反応時間の進行と共にアンモニアが遊離し脱アミド反応が生じていることが判る。脱アミド化率は、小麦グルテンで74%、カゼイネートで60%、乳清蛋白質で23%、大豆蛋白質で20%、卵白蛋白質で7%であった。反応後、75℃で15分間加熱し酵素を失活させ反応を停止し、水に対して透析後凍結乾燥して脱アミド化蛋白質粉末を得た。また対照として行った酵素無添加の反応物も同様の処理を施し、対照粉末を得た。
実施例7で得た脱アミド化蛋白質粉末及び対照実験で得た酵素未処理蛋白質粉末を10 mmol/l リン酸緩衝液(pH7.0)に0.5mg/mlの濃度に溶解し、マイクロコンダクティビティ法(Wilde PJ, Colloid and Interface Science, 178, 733-739, 1996)で起泡性、泡沫安定性を測定した。泡沫安定性は5分後の伝導度の残存度で表した。結果を表6に示す。
実施例7で得た脱アミド化蛋白質粉末及び対照実験で得た酵素未処理蛋白質粉末を2.0mg/mlの濃度pH2.7から6までの10 mmol/lクエン酸−燐酸緩衝液、pH7から9までの10 mmol/l Tris-HCl緩衝液及びpH12の水溶液(NaOHで調整)に縣濁、溶解させ室温で30分間振とう後、さらに30分間室温に静置した。ここでpHを測定後、16000×gの高速で遠心分離し、得られた上清を0.45μmの膜で濾過し、濾液中の蛋白質含量をBCA法で測定した。この濾液中の蛋白質含量を溶解性の指標とし、pH12での溶解度を100%として表示した(Methods of Testing Protein Functinality, p47-55, edited by G.M.Hall, Blackie Academic & Professional, London, 1996)。脱アミド化蛋白質のpH-溶解性曲線を図4〜8に示す。
a)染色体DNAの単離
"Current Protocols in Molecular Biology", Unit 2.4 (John Wiley & Sons, Inc., 1994)に従って、100ml のカルチャーから、210μg/mlの濃度の染色体DNAを、4.5ml得た。
実施例3で得られた蛋白質脱アミド酵素の精製標品を、プロテイン・シークエンサー(Applied Biosystems社)に供し、配列番号1に示す20残基のN末端アミノ酸配列を決定した。次に、実施例3で得られた蛋白質脱アミド酵素の精製標品を過ギ酸により還元・アルキル化した後、トリプシンによる分解を行った。得られた分解物を逆相液体クロマトグラフィーに供し、分離されたペプチド画分の一つをプロテイン・シークエンサーに供し、配列番号2に示す20残基の内部アミノ酸配列を決定した。
Leu-Ala-Ser-Val-Ile-Pro-Asp-Val-Ala-Thr-Leu-Asn-Ser-Leu-Phe-Asn-Gln-Ile-Lys-Asn
配列番号2:
Ser-Pro-Ser-Asn-Ser-Tyr-Leu-Tyr-Asp-Asn-Asn-Leu-Ile-Asn-Thr-Asn-Cys-Val-Leu-Thr
N末端領域アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をもとに、以下の2種の混合オリゴヌクレオチドをDNA合成機(Applied Biosystems社)により合成し、PCRプライマーとした。
センス・プライマー:
5'-GCI(TA)(CG)IGTIAT(TCA)CC(TACG)GA(TC)GT-3' <N-1g>
配列番号4
アンチセンス・プライマー:
5'-A(AG)(AGTC)AC(AG)CA(AG)TT(AGTC)GT(AG)TT(AGT)AT-3' <M-2a>
これらのプライマーとクリセオバクテリウム・エスピー No.9670 (Chruseobacterium sp. No9670)の染色体DNAを鋳型として、以下の条件下、Omnigene Thermal Cycler(Hybaid 社)を用いてPCR反応を行なった。
10 x PCR反応緩衝液 (Perkin Elmer社) 5.0 μl
dNTP混合液 (それぞれ2.5 mmol/l、Promega社) 4.0 μl
20 μmol/l センス・プライマー 10.0 μl
20 μmol/l アンチセンス・プライマー 10.0 μl
蒸留水 20.25 μl
染色体DNA溶液 (190μg/ml) 0.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ (Perkin Elmer社) 0.25 μl
ステージ1: 変性(94℃、5分) 1サイクル
ステージ2: 変性(94℃、1分) 30サイクル
アニール(44℃、1分)
伸長(72℃、1分)
ステージ3: 伸長(72℃、10分) 1サイクル
クリセオバクテリウム・エスピー No.9670 (Chryseobacterium sp. No9670)の染色体DNAのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、Eco RI分解物中にプローブDNAとハイブリダイズする約4.9 kbのシングルバンドが確認された。この約4.9 kbのEcoRI DNA断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作成した。上記a)で調製した染色体DNAをEcoRIで分解し、得られた分解物をEcoRI処理したλZAPII (Stratagene社)ベクターにライゲーションし、Gigapack III gold (Stratagene社)を用いてパッケージングし遺伝子ライブラリーを得た。
上記c)で得た0.48 kbのDNA断片をMegaprime DNA Labeling system (Amersham社)とP32-α-dCTPを用いてラベルした。これをDNAプローブとして、d)で得た遺伝子ライブラリーをプラーク・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られた陽性プラークからファージを回収した後、Stratagene社のインストラクションに従い、in vivo Exicision法により、約4.5 kb Eco RI断片を含むプラスミドp9T1-2を得た。
プラスミドp9T1-2の塩基配列を定法に従って決定した。蛋白質脱アミド酵素をコードする塩基配列を配列番号5に示す。また配列番号5によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号6に示す。このアミノ酸配列中には、 b)で決定したN末端領域アミノ酸配列(配列番号1)および内部アミノ酸配列(配列番号2)が見出された。
TTGGCGAGTGTAATTCCTGATGTAGCTACATTAAATTCTTTATTCAATCA
AATAAAGAATCAGTCTTGCGGTACCTCTACGGCGTCCTCACCATGCATCA
CATTCAGATATCCTGTAGACGGATGTTATGCAAGAGCCCATAAGATGAGA
CAAATCTTAATGAACAACGGCTATGACTGTGAAAAACAATTTGTATACGG
AAACCTAAAGGCATCAACAGGAACTTGCTGTGTGGCGTGGAGCTACCACG
TTGCAATATTGGTAAGCTATAAAAATGCTTCCGGAGTAACGGAAAAAAGA
ATTATTGATCCTTCACTATTTTCAAGCGGTCCTGTAACAGATACAGCATG
GAGAAACGCTTGCGTTAACACCTCTTGCGGATCTGCATCCGTTTCCTCTT
ATGCTAATACTGCAGGAAATGTTTATTACAGAAGTCCTAGTAATTCTTAC
CTGTATGACAACAATCTGATCAATACCAACTGTGTACTGACTAAATTTTC
ACTGCTTTCCGGATGTTCTCCTTCACCTGCACCGGATGTATCCAGCTGTG
GATTT
(555 bp)
L A S V I P D V A T L N S L F N Q I K N
Q S C G T S T A S S P C I T F R Y P V D
G C Y A R A H K M R Q I L M N N G Y D C
E K Q F V Y G N L K A S T G T C C V A W
S Y H V A I L V S Y K N A S G V T E K R
I I D P S L F S S G P V T D T A W R N A
C V N T S C G S A S V S S Y A N T A G N
V Y Y R S P S N S Y L Y D N N L I N T N
C V L T K F S L L S G C S P S P A P D V
S S C G F
(185 amino acid)
AGTTAAAATAACCAACCAACTTAACAAAAACTCACCATTAAACTACAAATTACAATTATT
ATGAAAAATCTTTTTTTATCAATGATGGCCTTTGTGACCGTCTTAACTTTTAATTCCTGT
M K N L F L S M M A F V T V L T F N S C
GCCGATTCCAACGGGAATCAGGAAATCAACGGAAAGGAAAAACTAAGTGTAAATGATTCT
A D S N G N Q E I N G K E K L S V N D S
AAGCTGAAAGATTTCGGAAAGACTGTACCGGTAGGGATAGACGAAGAAAACGGAATGATA
K L K D F G K T V P V G I D E E N G M I
AAGGTGTCATTTATGTTAACTGCGCAATTCTATGAAATTAAGCCGACCAAAGAAAATGAG
K V S F M L T A Q F Y E I K P T K E N E
CAGTATATCGGAATGCTTAGACAGGCTGTTAAGAATGAATCTCCTGTACACATTTTCTTA
Q Y I G M L R Q A V K N E S P V H I F L
AAGCCTAATAGCAATGAAATAGGAAAAGTGGAGTCTGCAAGTCCGGAAGACGTAAGATAT
K P N S N E I G K V E S A S P E D V R Y
TTTAAAACGATCCTGACAAAAGAAGTAAAAGGGCAAACCAATAAATTGGCGAGTGTAATT
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(320 amino acid)
N末端領域アミノ酸配列およびC末端領域アミノ酸配列をコードするDNA配列をもとに、以下の2種のオリゴヌクレオチドをDNA合成機(Applied Biosystems社)により合成し、PCRプライマーとした。
成熟体発現用センス・プライマー:
5'-CCGAATTCTTGGCGAGTGTAATTCCTGATG-3'
配列番号10
プレプロ体発現用センス・プライマー
5'-CAGAATTCATGAAAAATCTTTTTTTATCAATGGCC-3'
配列番号11
アンチセンス・プライマー:
5'-TCGAATTCTTAAAATCCACAGCTGGATAC-3'
10 x PCR反応緩衝液 (Perkin Elmer社) 10.0 μl
dNTP混合液 (それぞれ2.5 mmol/l、Promega社) 8.0 μl
20 μmol/l センス・プライマー 2.5 μl
20 μmol/l アンチセンス・プライマー 2.5 μl
蒸留水 75.5 μl
プラスミドp7T-1溶液 (50μg/ml) 1.0 μl
Taq DNAポリメラーゼ (Perkin Elmer社) 0.5 μl
<PCR反応条件>
ステージ1: 変性(94℃、5分) 1サイクル
ステージ2: 変性(94℃、1分) 30サイクル
アニール(55℃、1分)
伸長(72℃、1分)
ステージ3: 伸長(72℃、10分) 1サイクル
発現プラスミドpN7-9及びpP3-9を大腸菌BL21(Pharmacia社)に導入し形質転換体を得た。また対照として発現ベクターpGEX-1λTを有する大腸菌BL21の形質転換体も得た。これらの形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地で37℃, 200rpmで培養して得た対数増殖期(OD600=0.9〜1.0)の細胞に終濃度0.1 mmol/lのIPTGを添加後さらに4時間同条件で培養し集菌した。菌体を培養液の1/10量の50 mmol/l TrisHCl, pH8.0/2 mmol/l EDTAに縣濁し、終濃度0.1 mg/mlのEgg white lysozymeと終濃度0.1%のTriton X-100を添加し、30℃で15 min放置後、温和な超音波処理(10 sec. On and 30 sec. Offを3 cycles)で粘凋なDNAを揃断しCell extractを得た。このCell extract 100 μlに、4μlのThrombin(1U/μl-9 mmol/l sodium phosphate, pH6.5/140 mmol/l NaCl)を添加し、室温に16時間放置し、Trombin処理Cell extractを得た。また4μlの緩衝液(9 mmol/l sodium phosphate, pH6.5/140 mmol/l NaCl)を添加し、同様の反応を行ったものをTrombin処理の対照とした。
Claims (16)
- 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチド。
- 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号8に記載のアミノ酸配列において、1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列からなり、カゼイン中のアミド基を脱アミドする作用を有し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わない作用特異性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項3から5のいずれかに記載のヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
- 請求項6記載の組換えベクターを導入させた形質転換体。
- 請求項7記載の形質転換体を培養し、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する組換えポリペプチドを生産せしめ、培養物より該組換えポリペプチドを採取することを特徴とするカゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する組換えポリペプチドの製造法。
- 請求項7記載の形質転換体を培養し、該培養物から採取される、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有する組換えポリペプチド。
- クリセオバクテリウム(Chryseobacterium)属に属する新菌クリセオバクテリウム・エスピー(Chryseobacterium sp.)No. 9670(FERM BP−7351)を栄養培地に培養し、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有し、分子量が20kDaであり且つ、等電点が10.0である新規な酵素を生産せしめ、該酵素を採取することを特徴とする蛋白質中のアミド基を脱アミドする作用を有する酵素の製造法。
- 蛋白質或いはペプチドに、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種を作用させることを特徴とする蛋白質或いはペプチドの修飾法。
- 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種を有効成分としてなる蛋白質或いはペプチドの修飾用組成物。
- 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種を植物性、動物性蛋白質及び/又はペプチドに作用させ、当該蛋白質及び/又はペプチドの機能性を改善する方法。
- 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種を植物性、動物性蛋白質及び/又はペプチドを含む食品に作用させ、当該食品の機能性を改善する方法。
- 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種を植物性、動物性蛋白質及び/又はペプチドを含有する粗原料に作用させ、当該原料から蛋白質及び/又はペプチドの抽出効率を改善する方法。
- 配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つがなされているアミノ酸配列を含み、カゼイン中のアミド基に直接作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする作用を有するポリペプチド、配列表の配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項1〜2の何れか記載のポリペプチド又は請求項9記載の組換えポリペプチドの少なくとも1種によりトランスグルタミナーゼの反応を制御する方法。
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