JPH0870815A - 調味料の製造法 - Google Patents
調味料の製造法Info
- Publication number
- JPH0870815A JPH0870815A JP6238567A JP23856794A JPH0870815A JP H0870815 A JPH0870815 A JP H0870815A JP 6238567 A JP6238567 A JP 6238567A JP 23856794 A JP23856794 A JP 23856794A JP H0870815 A JPH0870815 A JP H0870815A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- transglutaminase
- protein
- raw material
- reaction
- glutamic acid
- Prior art date
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 グルタミン酸等の呈味成分を高濃度に含有す
る調味料を得る。 【構成】 蛋白質原料に、架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼ活性物質を作用せしめた後、蛋白質加水分解酵素活
性物質を作用せしめる。
る調味料を得る。 【構成】 蛋白質原料に、架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼ活性物質を作用せしめた後、蛋白質加水分解酵素活
性物質を作用せしめる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、調味料の製造法に関す
るものであり、さらに詳細には、調味料の好ましい呈味
性を決定するグルタミン酸を蛋白質原料より効果的かつ
高濃度に分離し、グルタミン酸含量の高い調味料または
調味料原料を製造する方法に関するものである。
るものであり、さらに詳細には、調味料の好ましい呈味
性を決定するグルタミン酸を蛋白質原料より効果的かつ
高濃度に分離し、グルタミン酸含量の高い調味料または
調味料原料を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質原料またはペプチドを含有する蛋
白質原料に、蛋白質加水分解酵素を含有する酵素活性物
質を作用せしめ、醤油または醤油様調味料あるいはそれ
らの調味料の原料を製造する方法に関しては、既に多数
の報告がなされている（例えば特公昭５７−１８８５９
号、特公昭６３−９４９７４号各公報参照）。
白質原料に、蛋白質加水分解酵素を含有する酵素活性物
質を作用せしめ、醤油または醤油様調味料あるいはそれ
らの調味料の原料を製造する方法に関しては、既に多数
の報告がなされている（例えば特公昭５７−１８８５９
号、特公昭６３−９４９７４号各公報参照）。
【０００３】また、蛋白質原料に蛋白質加水分解酵素を
作用せしめた際には、その構成部分としてグルタミン酸
を有するにも関わらず、呈味性に寄与しない遊離形のグ
ルタミンが相当高濃度に生成するため、この遊離形グル
タミンにグルタミナ−ゼ等を作用せしめて、加水分解物
中のグルタミン酸の濃度を向上せしめる試みがあり、そ
れらの方法の一部は既に実用化されている（例えば、特
公昭４７−１７８２８号、特公昭４９−１５７８９号各
公報参照）。
作用せしめた際には、その構成部分としてグルタミン酸
を有するにも関わらず、呈味性に寄与しない遊離形のグ
ルタミンが相当高濃度に生成するため、この遊離形グル
タミンにグルタミナ−ゼ等を作用せしめて、加水分解物
中のグルタミン酸の濃度を向上せしめる試みがあり、そ
れらの方法の一部は既に実用化されている（例えば、特
公昭４７−１７８２８号、特公昭４９−１５７８９号各
公報参照）。
【０００４】さらに、遊離形グルタミンは、加水分解物
中で不安定であり、容易に環化（ピロ化）し、グルタミ
ナ−ゼ等が作用し難いピログルタミン酸に変化してしま
うため、加水分解物中のグルタミン酸の濃度を向上させ
る際の障害となっている。
中で不安定であり、容易に環化（ピロ化）し、グルタミ
ナ−ゼ等が作用し難いピログルタミン酸に変化してしま
うため、加水分解物中のグルタミン酸の濃度を向上させ
る際の障害となっている。
【０００５】以上、要するに、蛋白質原料に蛋白質加水
分解酵素を作用せしめ、単純に加水分解反応を行う従来
の方法は、蛋白質原料に存在する結合形のグルタミン酸
を効果的に遊離せしめる方法としては限界のある方法と
云わざるを得ない。
分解酵素を作用せしめ、単純に加水分解反応を行う従来
の方法は、蛋白質原料に存在する結合形のグルタミン酸
を効果的に遊離せしめる方法としては限界のある方法と
云わざるを得ない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明にあっては、蛋
白質原料中に存在する結合形グルタミン酸を蛋白質加水
分解酵素の作用により、遊離形のグルタミン酸として加
水分解物中に効果的に遊離せしめ、且つ、遊離したグル
タミン酸を変化せしめることなく安定に保全し、グルタ
ミン酸を高濃度に含有する調味料または調味料原料を取
得することを目的とする。
白質原料中に存在する結合形グルタミン酸を蛋白質加水
分解酵素の作用により、遊離形のグルタミン酸として加
水分解物中に効果的に遊離せしめ、且つ、遊離したグル
タミン酸を変化せしめることなく安定に保全し、グルタ
ミン酸を高濃度に含有する調味料または調味料原料を取
得することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の課
題及び目的を解決すべく、従来の関連する技術を詳細に
亙って再検討し、更に新たな見地から種々の検討を行っ
た結果、蛋白質原料に蛋白質加水分解酵素を作用せしめ
るに先だって、従来より知られているトランスグルタミ
ナ−ゼに比較して架橋反応よりも脱アミド化反応を優先
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性
物質を前記蛋白質原料に作用せしめ、その後、蛋白質加
水分解酵素活性物質を作用せしめる場合には、極めて効
果的に遊離形のグルタミン酸を加水分解物中に遊離また
は放出させることができ、且つ遊離したグルタミン酸は
変化することなく、加水分解物中に安定に保全出来るこ
とから、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料または
調味料原料を製造し得るという知見を得た。
題及び目的を解決すべく、従来の関連する技術を詳細に
亙って再検討し、更に新たな見地から種々の検討を行っ
た結果、蛋白質原料に蛋白質加水分解酵素を作用せしめ
るに先だって、従来より知られているトランスグルタミ
ナ−ゼに比較して架橋反応よりも脱アミド化反応を優先
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性
物質を前記蛋白質原料に作用せしめ、その後、蛋白質加
水分解酵素活性物質を作用せしめる場合には、極めて効
果的に遊離形のグルタミン酸を加水分解物中に遊離また
は放出させることができ、且つ遊離したグルタミン酸は
変化することなく、加水分解物中に安定に保全出来るこ
とから、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料または
調味料原料を製造し得るという知見を得た。
【０００８】本発明者等は、この知見に基づき本発明を
完成した。すなわち、本発明は、蛋白質原料に、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るトランスグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後、
蛋白質加水分解酵素活性物質を作用せしめることを特徴
とする調味料の製造法である。
完成した。すなわち、本発明は、蛋白質原料に、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るトランスグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後、
蛋白質加水分解酵素活性物質を作用せしめることを特徴
とする調味料の製造法である。
【０００９】
【作用】本発明における蛋白質原料には、各種の植物性
蛋白質原料、動物性蛋白質原料または微生物性蛋白質原
料、それらの部分加水分解物、それらの各種蛋白質原料
に由来するペプチドならびにそれらの混合物原料が使用
される。
蛋白質原料、動物性蛋白質原料または微生物性蛋白質原
料、それらの部分加水分解物、それらの各種蛋白質原料
に由来するペプチドならびにそれらの混合物原料が使用
される。
【００１０】植物性蛋白質原料としては、丸大豆、大豆
ミ−ル、大豆フレ−ク、大豆搾油ケ−ク、分離大豆蛋
白、小麦粉、分離小麦グルテン、コ−ン・グルテンが例
示される。
ミ−ル、大豆フレ−ク、大豆搾油ケ−ク、分離大豆蛋
白、小麦粉、分離小麦グルテン、コ−ン・グルテンが例
示される。
【００１１】動物性蛋白質原料としては、鳥獣類肉、魚
介類肉、それらの加工品、フィシュ・ミ−ル、フィシュ
・ソルブル、カゼイン、分離乳精蛋白、コテ−ジ・チ−
ズ、絹糸部分加水分解物が例示される。
介類肉、それらの加工品、フィシュ・ミ−ル、フィシュ
・ソルブル、カゼイン、分離乳精蛋白、コテ−ジ・チ−
ズ、絹糸部分加水分解物が例示される。
【００１２】微生物性蛋白質原料としては、酵母菌体、
酵母エキス、アミノ酸発酵菌体、同抽出物が例示され
る。
酵母エキス、アミノ酸発酵菌体、同抽出物が例示され
る。
【００１３】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性を有
するトランスグルタミナ−ゼ活性物質としては、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応
よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する
微生物トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応よりも脱
アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する魚トラン
スグルタミナ−ゼ標品、これらの酵素の生成能を大腸菌
等の微生物菌体内で発現するプラスミドを導入して改質
した改質菌の培養物、同改質菌培養物の処理物などが挙
げられる。
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性を有
するトランスグルタミナ−ゼ活性物質としては、架橋反
応よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有す
るモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応
よりも脱アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する
微生物トランスグルタミナ−ゼ標品、架橋反応よりも脱
アミド化反応を優先的に触媒する能力を有する魚トラン
スグルタミナ−ゼ標品、これらの酵素の生成能を大腸菌
等の微生物菌体内で発現するプラスミドを導入して改質
した改質菌の培養物、同改質菌培養物の処理物などが挙
げられる。
【００１４】この架橋反応よりも脱アミド化反応を優先
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、
従来より知られているトランスグルタミナ−ゼに対して
改変蛋白（ミュテイン、Mutein) の関係にある蛋白構
造、アミノ酸配列を有する。
的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、
従来より知られているトランスグルタミナ−ゼに対して
改変蛋白（ミュテイン、Mutein) の関係にある蛋白構
造、アミノ酸配列を有する。
【００１５】従って、この架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼは、生物化学的あるいは遺伝子工学的な公知の改変
蛋白の調製法に準ずる方法によっても調製することが出
来る。
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼは、生物化学的あるいは遺伝子工学的な公知の改変
蛋白の調製法に準ずる方法によっても調製することが出
来る。
【００１６】但し、本発明の方法において使用されるト
ランスグルタミナ−ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド
化反応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタ
ミナ−ゼは、前述のようなトランスグルタミナ−ゼの改
変蛋白に限定されるものではなく、このような能力を有
するトランスグルタミナ−ゼであれば、何れの調製法に
より調製されたトランスグルタミナ−ゼであっても使用
可能である。
ランスグルタミナ−ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド
化反応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタ
ミナ−ゼは、前述のようなトランスグルタミナ−ゼの改
変蛋白に限定されるものではなく、このような能力を有
するトランスグルタミナ−ゼであれば、何れの調製法に
より調製されたトランスグルタミナ−ゼであっても使用
可能である。
【００１７】トランスグルタミナ−ゼ活性物質を作用せ
しめた後の蛋白質原料に作用せしめる蛋白質分解酵素活
性物質は、各種のプロテイナ−ゼ標品、プロテア−ゼ標
品、ペプチダ−ゼ標品、およびこれらの蛋白質分解酵素
を含有する混合物であって、その起源、原料には特に限
定されない。また、エンド型蛋白質分解酵素、エクソ型
蛋白質分解酵素、あるいはそれらの混合物であっても良
い。さらに蛋白質分解酵素活性物質は、精製された標品
である必要はなく、例えば米麹、麦麹、麹菌液体培地培
養物であっても良い。
しめた後の蛋白質原料に作用せしめる蛋白質分解酵素活
性物質は、各種のプロテイナ−ゼ標品、プロテア−ゼ標
品、ペプチダ−ゼ標品、およびこれらの蛋白質分解酵素
を含有する混合物であって、その起源、原料には特に限
定されない。また、エンド型蛋白質分解酵素、エクソ型
蛋白質分解酵素、あるいはそれらの混合物であっても良
い。さらに蛋白質分解酵素活性物質は、精製された標品
である必要はなく、例えば米麹、麦麹、麹菌液体培地培
養物であっても良い。
【００１８】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を蛋白質原料に作用せしめるには、水性媒体中で、蛋白
質原料とこのトランスグルタミナ−ゼ活性物質を接触せ
しめる方法が採用される。
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を蛋白質原料に作用せしめるには、水性媒体中で、蛋白
質原料とこのトランスグルタミナ−ゼ活性物質を接触せ
しめる方法が採用される。
【００１９】この酵素の活性範囲は、５〜５５℃、ｐＨ
４〜１０であるので、接触せしめる条件もこの範囲から
選択される。また、接触せしめる時間は０．１〜２４時
間が適当である。蛋白質分解酵素の共存によって、この
酵素の活性は損われることが多いので、蛋白質加水分解
酵素活性物質を作用せしめる次工程を同時に実施するこ
とは得策ではない。
４〜１０であるので、接触せしめる条件もこの範囲から
選択される。また、接触せしめる時間は０．１〜２４時
間が適当である。蛋白質分解酵素の共存によって、この
酵素の活性は損われることが多いので、蛋白質加水分解
酵素活性物質を作用せしめる次工程を同時に実施するこ
とは得策ではない。
【００２０】架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を作用せしめた後の蛋白質原料に、蛋白質加水分解酵素
活性物質を作用せしめるには、水性媒体中で、同トラン
スグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後の蛋白質原
料と蛋白質加水分解酵素活性物質を接触せしめる方法が
採用される。
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼ活性物質
を作用せしめた後の蛋白質原料に、蛋白質加水分解酵素
活性物質を作用せしめるには、水性媒体中で、同トラン
スグルタミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後の蛋白質原
料と蛋白質加水分解酵素活性物質を接触せしめる方法が
採用される。
【００２１】この場合の接触の条件は、選択した蛋白質
加水分解酵素の活性範囲から選択される。また、接触せ
しめる時間は０．５〜１２時間が適当である。尚、この
工程では、トランスグルタミナ−ゼ活性物質が共存して
いても、蛋白質加水分解酵素の活性には影響が生じない
ので、格別な中間処理を行うことなく、前工程より本工
程に移行することが出来る。
加水分解酵素の活性範囲から選択される。また、接触せ
しめる時間は０．５〜１２時間が適当である。尚、この
工程では、トランスグルタミナ−ゼ活性物質が共存して
いても、蛋白質加水分解酵素の活性には影響が生じない
ので、格別な中間処理を行うことなく、前工程より本工
程に移行することが出来る。
【００２２】蛋白質加水分解酵素活性物質を作用せしめ
た後の蛋白質加水分解液は、そのまま、あるいは必要に
より固液分離、濃縮、乾燥などの処理工程を経た後、調
味料またはその原料として利用される。
た後の蛋白質加水分解液は、そのまま、あるいは必要に
より固液分離、濃縮、乾燥などの処理工程を経た後、調
味料またはその原料として利用される。
【００２３】本発明で使用するトランスグルタミナ−
ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に触
媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、本発明
者等が新たに発見した酵素であって、その調製法および
特異活性については、後述の参考例１及び２にそれらの
具体的事項を述べる。尚、このトランスグルタミナ−ゼ
の調製法および特異活性については、各参考例の末尾に
記載したように既に公表されている事柄である。
ゼ、即ち、架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に触
媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼは、本発明
者等が新たに発見した酵素であって、その調製法および
特異活性については、後述の参考例１及び２にそれらの
具体的事項を述べる。尚、このトランスグルタミナ−ゼ
の調製法および特異活性については、各参考例の末尾に
記載したように既に公表されている事柄である。
【００２４】以下、実施例により本発明の内容を具体的
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。
【００２５】
（実施例１）架橋反応よりも脱アミド化反応を優先的に
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼとして本
実施例で使用したトランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、Ｔ
ＧＭ２またはＴＧＭ３は、後述の参考例１の方法により
調製され、その特異活性は参考例２に記載した通りであ
る。
触媒する能力を有するトランスグルタミナ−ゼとして本
実施例で使用したトランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、Ｔ
ＧＭ２またはＴＧＭ３は、後述の参考例１の方法により
調製され、その特異活性は参考例２に記載した通りであ
る。
【００２６】トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ
２又はＴＧＭ３の標品、各０．１ｇを、脱脂大豆粉また
は小麦粉よりアルカリ抽出等電点沈殿法によって各々新
たに分離した大豆蛋白粉末または小麦蛋白粉末の各５ｇ
とｐＨ７の燐酸塩緩衝液１Ｌ中にて弱撹拌下、３７℃で
２．０時間に亘り接触せしめた。次いで、各々ｐＨを７
に再調整した後、エクソ型ペプチダ−ゼ標品「プロテア
−ゼＭ」（商品名：天野製薬（株）製品）各０．１ｇを
添加し、弱撹拌下にて３７℃で２．０時間に亘り更に接
触を続けた。この場合、何れの加水分解試料中にも固体
物は存在せず、蛋白粉末は完全に溶解したことが認めら
れた。
２又はＴＧＭ３の標品、各０．１ｇを、脱脂大豆粉また
は小麦粉よりアルカリ抽出等電点沈殿法によって各々新
たに分離した大豆蛋白粉末または小麦蛋白粉末の各５ｇ
とｐＨ７の燐酸塩緩衝液１Ｌ中にて弱撹拌下、３７℃で
２．０時間に亘り接触せしめた。次いで、各々ｐＨを７
に再調整した後、エクソ型ペプチダ−ゼ標品「プロテア
−ゼＭ」（商品名：天野製薬（株）製品）各０．１ｇを
添加し、弱撹拌下にて３７℃で２．０時間に亘り更に接
触を続けた。この場合、何れの加水分解試料中にも固体
物は存在せず、蛋白粉末は完全に溶解したことが認めら
れた。
【００２７】他方で、上記のトランスグルタミナ−ゼを
添加せずに、Ｎ塩酸０．１ｍＬを添加した試料（対照
１）と、上記のトランスグルタミナ−ゼを添加しない試
料（対照２）と、モルモット肝トランスグルタミナ−ゼ
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を導入した大腸菌の培養物
より調製したトランスグルタミナ−ゼＴＧ標品の０．１
ｇを添加した試料（対照３）とについても、同様に処理
した。尚、対照３で使用したトランスグルタミナ−ゼＴ
Ｇ標品は、架橋反応を優先的に触媒する通常のトランス
グルタミナ−ゼ活性を有する。
添加せずに、Ｎ塩酸０．１ｍＬを添加した試料（対照
１）と、上記のトランスグルタミナ−ゼを添加しない試
料（対照２）と、モルモット肝トランスグルタミナ−ゼ
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を導入した大腸菌の培養物
より調製したトランスグルタミナ−ゼＴＧ標品の０．１
ｇを添加した試料（対照３）とについても、同様に処理
した。尚、対照３で使用したトランスグルタミナ−ゼＴ
Ｇ標品は、架橋反応を優先的に触媒する通常のトランス
グルタミナ−ゼ活性を有する。
【００２８】以上の合計１２種類の加水分解試料につい
て、イオン交換カラムを使用する通常のアミノ酸分析
（液体クロマトグラフ法）により検出される総グルタミ
ン酸量（ＧＨ）の定量およびミクロケ−ルダ−ル法によ
る総窒素量（ＴＮ）の定量により、総窒素量に対するグ
ルタミン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）を算出した。それらの
結果をまとめて表１に示す。
て、イオン交換カラムを使用する通常のアミノ酸分析
（液体クロマトグラフ法）により検出される総グルタミ
ン酸量（ＧＨ）の定量およびミクロケ−ルダ−ル法によ
る総窒素量（ＴＮ）の定量により、総窒素量に対するグ
ルタミン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）を算出した。それらの
結果をまとめて表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】改変型トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、
ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を使用した試料は、蛋白質原料が
大豆蛋白または小麦蛋白の場合とも、対照１、対照２及
び対照３の試料に比較して、総窒素量に対するグルタミ
ン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）は同等または高い数値が認め
られた。
ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を使用した試料は、蛋白質原料が
大豆蛋白または小麦蛋白の場合とも、対照１、対照２及
び対照３の試料に比較して、総窒素量に対するグルタミ
ン酸量の比（ＧＨ／ＴＮ）は同等または高い数値が認め
られた。
【００３１】この事実は、架橋反応よりも脱アミド化反
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３との接触により、
蛋白質原料からグルタミン酸が効果的に遊離し、加水分
解液中に保全されていることを示す。
応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタミナ
−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３との接触により、
蛋白質原料からグルタミン酸が効果的に遊離し、加水分
解液中に保全されていることを示す。
【００３２】尚、ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を作
用せしめた試料では、対照１の試料のように酸処理は行
っていないので、人体に悪影響を与えるとされるモノク
ロロプロパノ−ル、ジクロロプロパノ−ルなどの有機塩
素化合物は全く副生しないと云う利点がある。
用せしめた試料では、対照１の試料のように酸処理は行
っていないので、人体に悪影響を与えるとされるモノク
ロロプロパノ−ル、ジクロロプロパノ−ルなどの有機塩
素化合物は全く副生しないと云う利点がある。
【００３３】参考例１： ＝改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又は
ＴＧＭ３の調製例＝ モルモット肝トランスグルタミナ−ゼの大腸菌発現用プ
ラスミドｐＫＴＧ１を鋳型とし、ポリメラ−ゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を使用する部位特異的変異法（特定部位を変
異させたプライマ−を使用したＤＮＡ鎖の特定部位のみ
を迅速且つ容易に増幅する反応；小野寺一清監修「組換
えＤＮＡ実験ノ−ト」１１２−１１５頁；現代工学社
刊）により、３種類の改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
Ｍ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫ
ＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２又はｐＫＴＧＭ３を構築した。
これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して取得し
た改質菌を培養し、培養菌体よりＴＧＭ１、ＴＧＭ２又
はＴＧＭ３を調製した。又、それらはｐＫＴＧ１を導入
した大腸菌の場合と同程度のレベルで発現した。
ＴＧＭ３の調製例＝ モルモット肝トランスグルタミナ−ゼの大腸菌発現用プ
ラスミドｐＫＴＧ１を鋳型とし、ポリメラ−ゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を使用する部位特異的変異法（特定部位を変
異させたプライマ−を使用したＤＮＡ鎖の特定部位のみ
を迅速且つ容易に増幅する反応；小野寺一清監修「組換
えＤＮＡ実験ノ−ト」１１２−１１５頁；現代工学社
刊）により、３種類の改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
Ｍ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫ
ＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２又はｐＫＴＧＭ３を構築した。
これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに導入して取得し
た改質菌を培養し、培養菌体よりＴＧＭ１、ＴＧＭ２又
はＴＧＭ３を調製した。又、それらはｐＫＴＧ１を導入
した大腸菌の場合と同程度のレベルで発現した。
【００３４】改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１を発
現するプラスミドｐＫＴＧＭ１により形質転換された大
腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１３
０３７は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１
４５１３である。
現するプラスミドｐＫＴＧＭ１により形質転換された大
腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１３
０３７は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１
４５１３である。
【００３５】また、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
２を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ２により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３８は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１４である。
２を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ２により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３８は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１４である。
【００３６】更に、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
３を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ３により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３９は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１５である。
３を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ３により形質転換さ
れた大腸菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)Ａ
Ｊ１３０３９は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
Ｐ−１４５１５である。
【００３７】加えて、モルモット肝トランスグルタミナ
−ゼ発現用プラスミドｐＫＴＧ１で形質転換された大腸
菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１２３
７０は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１０
００８である。
−ゼ発現用プラスミドｐＫＴＧ１で形質転換された大腸
菌、エシェリヒア・コリ（Echerichia coli)ＡＪ１２３
７０は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１０
００８である。
【００３８】また、（１）モルモット肝トランスグルタ
ミナ−ゼの大腸菌発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する
大腸菌を培養して取得した生産物と、（２）その改変ト
ランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２及びＴＧＭ３
を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２及び
ｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有する大腸菌を培養して取得し
た生産物と、（３）対照としてモルモット肝トランスグ
ルタミナ−ゼを発現する遺伝子を担持していないプラス
ミド・ベクタ−ｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌の培養
物の抽出物および（４）モルモット肝から抽出したトラ
ンスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポリ
アクリルアミド・ゲル上で電気泳動を行ったところ、
（３）を例外として他の試料では略全て殆ど同一の分子
量を有していることが判明した。（３）では該電気泳動
条件下でモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ蛋白に対
応する蛋白の存在を認め得なかった。図１は、それらの
ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上での電気泳動の結果
を示す模式図である。
ミナ−ゼの大腸菌発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する
大腸菌を培養して取得した生産物と、（２）その改変ト
ランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２及びＴＧＭ３
を発現するプラスミドｐＫＴＧＭ１、ｐＫＴＧＭ２及び
ｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有する大腸菌を培養して取得し
た生産物と、（３）対照としてモルモット肝トランスグ
ルタミナ−ゼを発現する遺伝子を担持していないプラス
ミド・ベクタ−ｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌の培養
物の抽出物および（４）モルモット肝から抽出したトラ
ンスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポリ
アクリルアミド・ゲル上で電気泳動を行ったところ、
（３）を例外として他の試料では略全て殆ど同一の分子
量を有していることが判明した。（３）では該電気泳動
条件下でモルモット肝トランスグルタミナ−ゼ蛋白に対
応する蛋白の存在を認め得なかった。図１は、それらの
ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上での電気泳動の結果
を示す模式図である。
【００３９】尚、未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧに
対するＴＧＭ１、ＴＧＭ２またはＴＧＭ３の改変部位は
次の通りである。 ＴＧＭ１：中央部負電荷領域、２３１および２３２残基
目のアスパラギン酸残基２個をアスパラギン残基に変
換。 ＴＧＭ２：Ｃ−末端側負電荷領域、４４５、４４８、４
４９、４５０および４５２残基目にあるグルタミン酸残
基５個をグルタミン残基に変換。 ＴＧＭ３：ＴＧＭ１およびＴＧＭ２の改変部位を併有。
尚、未改変モルモット肝トランスグルタミナ−ゼのＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列については特開平１−３００
８８９号公報等に記載されている。
対するＴＧＭ１、ＴＧＭ２またはＴＧＭ３の改変部位は
次の通りである。 ＴＧＭ１：中央部負電荷領域、２３１および２３２残基
目のアスパラギン酸残基２個をアスパラギン残基に変
換。 ＴＧＭ２：Ｃ−末端側負電荷領域、４４５、４４８、４
４９、４５０および４５２残基目にあるグルタミン酸残
基５個をグルタミン残基に変換。 ＴＧＭ３：ＴＧＭ１およびＴＧＭ２の改変部位を併有。
尚、未改変モルモット肝トランスグルタミナ−ゼのＤＮ
Ａ配列およびアミノ酸配列については特開平１−３００
８８９号公報等に記載されている。
【００４０】参考例２ ＝改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又は
ＴＧＭ３の特異活性の確認＝ （１）架橋反応の抑制： 改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴ
ＧＭ３は、アセチル化αs1- カゼインへの蛍光性一級ア
ミンであるモノダンシルカダベリンに代表される架橋反
応において、この蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋ
ｍは未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧと変わりなく同
一である一方、最大反応速度Ｖｍａｘは２．５倍以上低
下していることから、架橋反応の抑制が発生しているこ
とを認めた。
ＴＧＭ３の特異活性の確認＝ （１）架橋反応の抑制： 改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴ
ＧＭ３は、アセチル化αs1- カゼインへの蛍光性一級ア
ミンであるモノダンシルカダベリンに代表される架橋反
応において、この蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋ
ｍは未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧと変わりなく同
一である一方、最大反応速度Ｖｍａｘは２．５倍以上低
下していることから、架橋反応の抑制が発生しているこ
とを認めた。
【００４１】尚、蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋ
ｍ及び最大反応速度Ｖｍａｘは次式により定義される。 Ｋｍ＝（Ｖｍａｘ／ｖ−１）［Ｓ］ Ｖｍａｘ＝（Ｋｍ＋［Ｓ］）ｖ／［Ｓ］ 但し、ｖは生成物の生成速度、［Ｓ］は基質濃度であ
る。
ｍ及び最大反応速度Ｖｍａｘは次式により定義される。 Ｋｍ＝（Ｖｍａｘ／ｖ−１）［Ｓ］ Ｖｍａｘ＝（Ｋｍ＋［Ｓ］）ｖ／［Ｓ］ 但し、ｖは生成物の生成速度、［Ｓ］は基質濃度であ
る。
【００４２】蛋白基質との間の酵素学的な親和性Ｋｍ及
び最大反応速度Ｖｍａｘに関する測定値を表２に示す。
び最大反応速度Ｖｍａｘに関する測定値を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】また、反応開始後、３０分単位で測定した
反応系に存在するαs1- カゼイン単量体の存在比は、未
改変トランスグルタミナ−ゼＴＧの反応系では、時間の
経過と共に急速に低下したのに対し、改変トランスグル
タミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の反応系で
は殆ど変化がなく、当初の９０〜９５％に維持、抑制さ
れていることを認めた（図２参照）。
反応系に存在するαs1- カゼイン単量体の存在比は、未
改変トランスグルタミナ−ゼＴＧの反応系では、時間の
経過と共に急速に低下したのに対し、改変トランスグル
タミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の反応系で
は殆ど変化がなく、当初の９０〜９５％に維持、抑制さ
れていることを認めた（図２参照）。
【００４５】（２）脱アミド化反応の無変化：改変トラ
ンスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の
脱アミド化反応は、未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
のそれと比較して殆ど同一のレベルにあり、両者の間に
実質的な差異は認められなかった（図３参照）。
ンスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の
脱アミド化反応は、未改変トランスグルタミナ−ゼＴＧ
のそれと比較して殆ど同一のレベルにあり、両者の間に
実質的な差異は認められなかった（図３参照）。
【００４６】（３）改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の酵素学的挙動：上記のよう
に、ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３は、未改変トラン
スグルタミナ−ゼＴＧに比較して、架橋反応の抑制が発
生している一方で脱アミド化反応には変化がないので、
ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を作用せしめた蛋白基
質に蛋白加水分解酵素を作用せしめた場合、蛋白基質を
構成している結合グルタミン酸は、容易に且つ変化を蒙
ることなく、換言すれば効果的に、遊離のグルタミン酸
に変化して加水分解物中に放出される。
１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３の酵素学的挙動：上記のよう
に、ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３は、未改変トラン
スグルタミナ−ゼＴＧに比較して、架橋反応の抑制が発
生している一方で脱アミド化反応には変化がないので、
ＴＧＭ１、ＴＧＭ２又はＴＧＭ３を作用せしめた蛋白基
質に蛋白加水分解酵素を作用せしめた場合、蛋白基質を
構成している結合グルタミン酸は、容易に且つ変化を蒙
ることなく、換言すれば効果的に、遊離のグルタミン酸
に変化して加水分解物中に放出される。
【００４７】尚、参考例１及び参考例２に記載の事項
は、次の通り既に公表されている。『伊倉宏司ほか「ト
ランスグルタミナ−ゼ分子に保存された負電荷領域の部
位特異的変異」日本生化学会第６６回大会発表：内容要
旨、同大会要旨７３３頁、要旨発行日、平成５年８月２
５日、口頭発表、平成５年１０月２日』
は、次の通り既に公表されている。『伊倉宏司ほか「ト
ランスグルタミナ−ゼ分子に保存された負電荷領域の部
位特異的変異」日本生化学会第６６回大会発表：内容要
旨、同大会要旨７３３頁、要旨発行日、平成５年８月２
５日、口頭発表、平成５年１０月２日』
【００４８】
【発明の効果】本発明は、以上に説明した通り、蛋白質
原料中に存在する結合形グルタミン酸を、遊離形のグル
タミン酸として加水分解物中に効果的に遊離せしめ、且
つ遊離したグルタミン酸は変化することなく安定に保全
し得るので、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料ま
たは調味料原料を製造出来るという効果がある。
原料中に存在する結合形グルタミン酸を、遊離形のグル
タミン酸として加水分解物中に効果的に遊離せしめ、且
つ遊離したグルタミン酸は変化することなく安定に保全
し得るので、グルタミン酸を高濃度に含有する調味料ま
たは調味料原料を製造出来るという効果がある。
【図１】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼの大腸菌
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する大腸菌を培養して
取得した生産物と、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
１，ＴＧＭ２及びＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫＴ
ＧＭ１，ｐＫＴＧＭ２及びｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有す
る大腸菌を培養して取得した各生産物、並びに対照とし
てモルモット肝トランスグルタミナ−ゼの遺伝子を担持
していないプラスミドｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌
の培養物の抽出物、およびモルモット肝から抽出したト
ランスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポ
リアクリルアミド・ゲル上における電気泳動の結果を示
す模式図である。図において縦軸は分子量（ＫＤａ）
を、横軸には上記の生産物またはＧ．Ｐ．Ｌ．を示す。
発現用プラスミドｐＫＴＧ１を有する大腸菌を培養して
取得した生産物と、改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ
１，ＴＧＭ２及びＴＧＭ３を発現するプラスミドｐＫＴ
ＧＭ１，ｐＫＴＧＭ２及びｐＫＴＧＭ３をそれぞれ有す
る大腸菌を培養して取得した各生産物、並びに対照とし
てモルモット肝トランスグルタミナ−ゼの遺伝子を担持
していないプラスミドｐＫＫ２３３−２を有する大腸菌
の培養物の抽出物、およびモルモット肝から抽出したト
ランスグルタミナ−ゼＧ．Ｐ．Ｌ．について、ＳＤＳポ
リアクリルアミド・ゲル上における電気泳動の結果を示
す模式図である。図において縦軸は分子量（ＫＤａ）
を、横軸には上記の生産物またはＧ．Ｐ．Ｌ．を示す。
【図２】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼＴＧと、
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との架橋化反応活性を示す線図である。図２に
おいて縦軸は架橋化反応後のαs1- カゼイン単量体存在
比（％）を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒丸
はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、黒
三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との架橋化反応活性を示す線図である。図２に
おいて縦軸は架橋化反応後のαs1- カゼイン単量体存在
比（％）を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒丸
はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、黒
三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。
【図３】モルモット肝トランスグルタミナ−ゼＴＧと、
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との脱アミド化反応活性を示す線図である。図
３において縦軸は脱アミド化反応で生成するアンモニア
量（ｍＭ) を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒
丸はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、
黒三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。
その改変トランスグルタミナ−ゼＴＧＭ１、ＴＧＭ２、
ＴＧＭ３との脱アミド化反応活性を示す線図である。図
３において縦軸は脱アミド化反応で生成するアンモニア
量（ｍＭ) を、横軸は反応時間（分）を示す。また、黒
丸はＴＧを、白三角はＴＧＭ１を、白丸はＴＧＭ２を、
黒三角はＴＧＭ３をそれぞれ示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 蛋白質原料に、架橋反応よりも脱アミド
化反応を優先的に触媒する能力を有するトランスグルタ
ミナ−ゼ活性物質を作用せしめた後、蛋白質加水分解酵
素活性物質を作用せしめることを特徴とする調味料の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23856794A JP3395397B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 調味料の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23856794A JP3395397B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 調味料の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870815A true JPH0870815A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3395397B2 JP3395397B2 (ja) | 2003-04-14 |
Family
ID=17032147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23856794A Expired - Fee Related JP3395397B2 (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | 調味料の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3395397B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104621530A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-20 | 广东厨邦食品有限公司 | 一种酱油的制备方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4882068A (ja) * | 1972-02-10 | 1973-11-02 | ||
| JPS4843637B1 (ja) * | 1969-03-19 | 1973-12-19 | ||
| JPS4915789B1 (ja) * | 1970-11-05 | 1974-04-17 | ||
| JPS6336797A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-17 | Fuji Oil Co Ltd | 改質蛋白の製造法 |
| JPH04126039A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-04-27 | Ajinomoto Co Inc | 脱苦味された機能性ペプチドの製造法 |
| JPH06225775A (ja) * | 1992-01-14 | 1994-08-16 | Ajinomoto Co Inc | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 |
| JPH0723740A (ja) * | 1993-07-02 | 1995-01-27 | Ajinomoto Co Inc | 新規肉質改良剤および肉質改良方法 |
| JPH0775569A (ja) * | 1987-03-04 | 1995-03-20 | Ajinomoto Co Inc | 新規なトランスグルタミナーゼ |
-
1994
- 1994-09-05 JP JP23856794A patent/JP3395397B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4843637B1 (ja) * | 1969-03-19 | 1973-12-19 | ||
| JPS4915789B1 (ja) * | 1970-11-05 | 1974-04-17 | ||
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| JPH0775569A (ja) * | 1987-03-04 | 1995-03-20 | Ajinomoto Co Inc | 新規なトランスグルタミナーゼ |
| JPH04126039A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-04-27 | Ajinomoto Co Inc | 脱苦味された機能性ペプチドの製造法 |
| JPH06225775A (ja) * | 1992-01-14 | 1994-08-16 | Ajinomoto Co Inc | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104621530A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-20 | 广东厨邦食品有限公司 | 一种酱油的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3395397B2 (ja) | 2003-04-14 |
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