JP2000083695A - 低苦味ペプチドの製造法 - Google Patents
低苦味ペプチドの製造法Info
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- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Abstract
(57)【要約】
【課題】 特別な苦味低減法を必要とせず、低苦味ペプ
チドを製造する方法を提供すること。 【解決手段】 疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低
い基質特異性を持つエンドペプチダーゼを蛋白質に作用
させることを特徴とする低苦味ペプチドの製造法。
チドを製造する方法を提供すること。 【解決手段】 疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低
い基質特異性を持つエンドペプチダーゼを蛋白質に作用
させることを特徴とする低苦味ペプチドの製造法。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、低苦味ペプチドの
製造法に関し、更に詳細には、疎水性アミノ酸末端を切
断する活性が低いエンドペプチダーゼを用いて、苦味低
減操作を必要とせず、酵素分解の単独の操作で苦味の弱
いペプチドを製造する方法に関する。
製造法に関し、更に詳細には、疎水性アミノ酸末端を切
断する活性が低いエンドペプチダーゼを用いて、苦味低
減操作を必要とせず、酵素分解の単独の操作で苦味の弱
いペプチドを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品蛋白質の特性を修飾する目的で種々
の蛋白質分解酵素が利用されている。その結果得られる
ペプチドは各種の機能特性を有しており、目的に合わせ
て様々に利用されている。例えば、ＨＶＰ、ＨＡＰと比
較して遊離アミノ酸が少ないため、マイルドな呈味性を
利用した調味料素材として利用されている。栄養素材と
しては、ペプチド態の方がアミノ酸単体と比較して速や
かに吸収され、分枝鎖アミノ酸の吸収にも優れている。
さらにトウモロコシ蛋白質のように消化しにくい場合で
あってもペプチドに分解することで消化吸収の良い栄養
素として利用できる。また、ペプチド態とすることによ
り、蛋白質と比較して、広範囲のｐＨでの溶解性向上、
粘性低下、吸湿性・保湿性向上、乳化性、気泡性、ゲル
化性が改変され、食材としての優位性が生じる。さら
に、ダイズ蛋白質分解ペプチド等が、血中コレステロー
ル低下作用、コレステロール吸収阻害、胆汁酸結合能、
血小板凝集抑制作用、抗酸化作用等の生理作用を有する
ことも報告されている。また蛋白質を低分子化すること
でアレルゲン性が低下ないし消失することも明らかとな
っている。
の蛋白質分解酵素が利用されている。その結果得られる
ペプチドは各種の機能特性を有しており、目的に合わせ
て様々に利用されている。例えば、ＨＶＰ、ＨＡＰと比
較して遊離アミノ酸が少ないため、マイルドな呈味性を
利用した調味料素材として利用されている。栄養素材と
しては、ペプチド態の方がアミノ酸単体と比較して速や
かに吸収され、分枝鎖アミノ酸の吸収にも優れている。
さらにトウモロコシ蛋白質のように消化しにくい場合で
あってもペプチドに分解することで消化吸収の良い栄養
素として利用できる。また、ペプチド態とすることによ
り、蛋白質と比較して、広範囲のｐＨでの溶解性向上、
粘性低下、吸湿性・保湿性向上、乳化性、気泡性、ゲル
化性が改変され、食材としての優位性が生じる。さら
に、ダイズ蛋白質分解ペプチド等が、血中コレステロー
ル低下作用、コレステロール吸収阻害、胆汁酸結合能、
血小板凝集抑制作用、抗酸化作用等の生理作用を有する
ことも報告されている。また蛋白質を低分子化すること
でアレルゲン性が低下ないし消失することも明らかとな
っている。
【０００３】蛋白質分解ペプチドはこのように優れた機
能、特性を有するものであるが、特有の苦味を有してい
るため、食品への利用が制約されているのが現状であ
る。そのため苦味低減の手法として疎水性アミノ酸残基
を特異的に切断するペプチダーゼにより苦味を除去する
方法（特開平7-274995号公報）などが知られているが、
遊離アミノ酸が増加してしまうという問題がある。基質
蛋白質を限定する方法（特開平5-344847号公報、特開平
10-23863号公報）も知られているが、適用範囲が狭まっ
てしまう。さらに苦味マスキング剤の使用（特開平9-16
2 号公報、特開平9-100297号公報）や、苦味ペプチドを
分画・除去する方法（特開平5-244978号公報）や、プラ
ステイン反応による高分子化（J. Agric. Biol. Chem.
34,1484(1970))）、包接化合物の利用（特開平2-283246
号公報）等も知られている。しかしいずれの方法も、ペ
プチド本来の機能が失われたり、回収率の低下、特殊な
設備が必要、コスト高を招くなどの種々の問題点を有し
ている。
能、特性を有するものであるが、特有の苦味を有してい
るため、食品への利用が制約されているのが現状であ
る。そのため苦味低減の手法として疎水性アミノ酸残基
を特異的に切断するペプチダーゼにより苦味を除去する
方法（特開平7-274995号公報）などが知られているが、
遊離アミノ酸が増加してしまうという問題がある。基質
蛋白質を限定する方法（特開平5-344847号公報、特開平
10-23863号公報）も知られているが、適用範囲が狭まっ
てしまう。さらに苦味マスキング剤の使用（特開平9-16
2 号公報、特開平9-100297号公報）や、苦味ペプチドを
分画・除去する方法（特開平5-244978号公報）や、プラ
ステイン反応による高分子化（J. Agric. Biol. Chem.
34,1484(1970))）、包接化合物の利用（特開平2-283246
号公報）等も知られている。しかしいずれの方法も、ペ
プチド本来の機能が失われたり、回収率の低下、特殊な
設備が必要、コスト高を招くなどの種々の問題点を有し
ている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、従来技術の上記問題点を伴うことなく、苦味の弱い
ペプチドを製造する方法を提供することである。
は、従来技術の上記問題点を伴うことなく、苦味の弱い
ペプチドを製造する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、疎水性アミノ
酸末端を切断する活性が低い基質特異性を持つエンドペ
プチダーゼを蛋白質に作用させることを特徴とする低苦
味ペプチドの製造法を提供するものである。
酸末端を切断する活性が低い基質特異性を持つエンドペ
プチダーゼを蛋白質に作用させることを特徴とする低苦
味ペプチドの製造法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明者は、上記課題を解決する
ためにペプチドの苦味発現機構に注目した。即ち、現在
用いられているエンドペプチダーゼは疎水性アミノ末端
を選択的に切断する基質特異性を有している。そのため
これらの酵素分解ペプチドのＮ末端、Ｃ末端には、疎水
性アミノ酸が存在する確率が高い。しかも、これら苦味
を有するペプチドを疎水性アミノ酸に特異的なペプチダ
ーゼで処理すれば苦みが消失することが知られている。
従って、ペプチドの苦味はペプチド末端に疎水性アミノ
酸が存在することが原因と考えられる。そこで本発明者
は、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低い基質特異
性を持つエンドペプチダーゼを蛋白質に作用させれば、
苦味低減処理を必要とすることなく低苦味ペプチドが得
られるのではないかと考え、研究を進めた結果、本発明
を完成するに至ったものである。
ためにペプチドの苦味発現機構に注目した。即ち、現在
用いられているエンドペプチダーゼは疎水性アミノ末端
を選択的に切断する基質特異性を有している。そのため
これらの酵素分解ペプチドのＮ末端、Ｃ末端には、疎水
性アミノ酸が存在する確率が高い。しかも、これら苦味
を有するペプチドを疎水性アミノ酸に特異的なペプチダ
ーゼで処理すれば苦みが消失することが知られている。
従って、ペプチドの苦味はペプチド末端に疎水性アミノ
酸が存在することが原因と考えられる。そこで本発明者
は、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低い基質特異
性を持つエンドペプチダーゼを蛋白質に作用させれば、
苦味低減処理を必要とすることなく低苦味ペプチドが得
られるのではないかと考え、研究を進めた結果、本発明
を完成するに至ったものである。
【０００７】本発明に使用する疎水性アミノ酸末端を切
断する活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼ
は、分解ペプチドのＣ末端、Ｎ末端に疎水性アミノ酸が
存在する確率が低くなる切断傾向を有するエンドペプチ
ダーゼである。従って、このような基質特異性を有する
エンドペプチダーゼを用いて蛋白質を加水分解すれば、
遊離アミノ酸量が少なく、苦味の弱い分解物が得られる
のである。本発明においては、疎水性アミノ酸末端を切
断する活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼ
の少なくとも１種を使用する。また本発明においては、
苦味低減処理を必要とせずに低苦味ペプチドを得るとい
う目的が達成される限り、疎水性アミノ酸末端を切断す
る活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼの少
なくとも１種に、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が
低くない基質特異性を持つエンドペプチダーゼの少なく
とも１種を併用してもよい。エンドペプチダーゼは、天
然より分離したままの粗酵素でも、精製したものでも、
また遺伝子組み換え体で発現させたものでも良い。
断する活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼ
は、分解ペプチドのＣ末端、Ｎ末端に疎水性アミノ酸が
存在する確率が低くなる切断傾向を有するエンドペプチ
ダーゼである。従って、このような基質特異性を有する
エンドペプチダーゼを用いて蛋白質を加水分解すれば、
遊離アミノ酸量が少なく、苦味の弱い分解物が得られる
のである。本発明においては、疎水性アミノ酸末端を切
断する活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼ
の少なくとも１種を使用する。また本発明においては、
苦味低減処理を必要とせずに低苦味ペプチドを得るとい
う目的が達成される限り、疎水性アミノ酸末端を切断す
る活性が低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼの少
なくとも１種に、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が
低くない基質特異性を持つエンドペプチダーゼの少なく
とも１種を併用してもよい。エンドペプチダーゼは、天
然より分離したままの粗酵素でも、精製したものでも、
また遺伝子組み換え体で発現させたものでも良い。
【０００８】エンドペプチダーゼの疎水性アミノ酸末端
を切断する活性は、例えば、以下の方法で測定すること
ができるが、これに限定されるわけではない。 基質となるペプチドホルモン50mmolに対し、酵素を
0.1 重量％加え、至適pHに調整したバッファーに混合す
る。ペプチドホルモンとしては、酸化型インスリンＢ
鎖、ニューロテンシン、グルカゴン、黄体形成ホルモン
放出ホルモン等が使用できる。 至適温度で１時間反応させる。得られるペプチドの
解析上、反応が不十分であったり、十分過ぎた場合は反
応時間を適度に調節する。 反応を蟻酸で停止し、Ｃ18逆相カラムで分離物を分
離する（Ａバッファーに0.1%TFA 、Ｂバッファーに0.1%
TFA 含有CH3CN を用い、流速1ml/分でＢバッファーを10
−100%のグラジエントで４５分以上で溶出する）。分離
されたペプチドをプロテインシーケンサー、マススペク
トロメトリー、アミノ酸分析機等を用いた分析法で、ア
ミノ酸配列を明らかにする。 以上の方法で酵素の基質切断部位を測定し、疎水性
アミノ酸部位で切断することが知られており、その分解
ペプチドに苦味が生じるズブチリシン、サーモリシン、
ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等と同様の酵素
分解パターンが認められる酵素を疎水性アミノ酸末端を
切断する活性の高い酵素とする。
を切断する活性は、例えば、以下の方法で測定すること
ができるが、これに限定されるわけではない。 基質となるペプチドホルモン50mmolに対し、酵素を
0.1 重量％加え、至適pHに調整したバッファーに混合す
る。ペプチドホルモンとしては、酸化型インスリンＢ
鎖、ニューロテンシン、グルカゴン、黄体形成ホルモン
放出ホルモン等が使用できる。 至適温度で１時間反応させる。得られるペプチドの
解析上、反応が不十分であったり、十分過ぎた場合は反
応時間を適度に調節する。 反応を蟻酸で停止し、Ｃ18逆相カラムで分離物を分
離する（Ａバッファーに0.1%TFA 、Ｂバッファーに0.1%
TFA 含有CH3CN を用い、流速1ml/分でＢバッファーを10
−100%のグラジエントで４５分以上で溶出する）。分離
されたペプチドをプロテインシーケンサー、マススペク
トロメトリー、アミノ酸分析機等を用いた分析法で、ア
ミノ酸配列を明らかにする。 以上の方法で酵素の基質切断部位を測定し、疎水性
アミノ酸部位で切断することが知られており、その分解
ペプチドに苦味が生じるズブチリシン、サーモリシン、
ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等と同様の酵素
分解パターンが認められる酵素を疎水性アミノ酸末端を
切断する活性の高い酵素とする。
【０００９】上記疎水性アミノ酸末端を切断する活性が
低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼの好ましい例
としては、発芽ダイズ子葉中より得られる酵素システイ
ンプロテアーゼＤ３（チオールプロテアーゼＤ３）（特
開平８−246 号公報）、その組み換え体（特開平9-1218
70号公報) 等が挙げられる。この酵素Ｄ３は分子量２６
〜３０ＫＤａのエンドペプチダーゼで、疎水性アミノ酸
のＣ末端に隣接する親水性アミノ酸のＣ末端側を切断す
る傾向が認められ、このような基質特異性を有するＤ３
を用いて蛋白質を加水分解すれば、遊離アミノ酸量が少
なく、苦味の弱いペプチド分解物が得られる。
低い基質特異性を持つエンドペプチダーゼの好ましい例
としては、発芽ダイズ子葉中より得られる酵素システイ
ンプロテアーゼＤ３（チオールプロテアーゼＤ３）（特
開平８−246 号公報）、その組み換え体（特開平9-1218
70号公報) 等が挙げられる。この酵素Ｄ３は分子量２６
〜３０ＫＤａのエンドペプチダーゼで、疎水性アミノ酸
のＣ末端に隣接する親水性アミノ酸のＣ末端側を切断す
る傾向が認められ、このような基質特異性を有するＤ３
を用いて蛋白質を加水分解すれば、遊離アミノ酸量が少
なく、苦味の弱いペプチド分解物が得られる。
【００１０】本発明方法に使用される基質蛋白質に特に
制限はなく、その好ましい例としては、大豆蛋白質、グ
ルテン等の植物性蛋白質、カゼイン、ゼラチン、筋蛋白
質、グロブリン、アルブミン等の動物性蛋白質が挙げら
れる。特に、食品として利用されている蛋白質を用いる
ことが好ましい。本発明方法では、基質蛋白質として、
１種類のみを使用してもよく、複数種類の混合物を使用
してもよく、さらには分離大豆蛋白質のように蛋白質以
外の物質（例えば、糖、食物繊維）を含んでいても良
い。
制限はなく、その好ましい例としては、大豆蛋白質、グ
ルテン等の植物性蛋白質、カゼイン、ゼラチン、筋蛋白
質、グロブリン、アルブミン等の動物性蛋白質が挙げら
れる。特に、食品として利用されている蛋白質を用いる
ことが好ましい。本発明方法では、基質蛋白質として、
１種類のみを使用してもよく、複数種類の混合物を使用
してもよく、さらには分離大豆蛋白質のように蛋白質以
外の物質（例えば、糖、食物繊維）を含んでいても良
い。
【００１１】酵素分解により得られるペプチドの平均分
子量は、４−ニトロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）試薬（K. Imai, Y.
Watanabe, Anal. Chem. Acta., 130, 377-383 (1983)）
によりアミノ態・イミノ態窒素量を定量し（特開平6-26
4 号公報) 、ＮＢＤ−Ｆ測定値と分析に供した分解物の
濃度から求めた。
子量は、４−ニトロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−
１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）試薬（K. Imai, Y.
Watanabe, Anal. Chem. Acta., 130, 377-383 (1983)）
によりアミノ態・イミノ態窒素量を定量し（特開平6-26
4 号公報) 、ＮＢＤ−Ｆ測定値と分析に供した分解物の
濃度から求めた。
【００１２】酵素分解後に得られるペプチドの分子量範
囲は、２００〜８０００、望ましくは２００〜５００
０、さらに望ましくは２００〜２０００である。一方、
酵素分解により得られるペプチド中に共存する遊離アミ
ノ酸含有量は、好ましくは１０重量％以下、さらに好ま
しくは５重量％以下が望ましい。このようなペプチドを
得るには、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低い基
質特異性を持つエンドペプチダーゼを、蛋白質１００重
量部に対して0.01〜１重量部使用し、30〜45℃で、１〜
100 時間程度処理すればよい。こうして得られる蛋白質
分解ペプチドの苦味は、後述する苦味評価に従った等価
濃度で、好ましくは0.05％以下、更に好ましくは0.04％
以下、最も好ましくは0.02％以下である。
囲は、２００〜８０００、望ましくは２００〜５００
０、さらに望ましくは２００〜２０００である。一方、
酵素分解により得られるペプチド中に共存する遊離アミ
ノ酸含有量は、好ましくは１０重量％以下、さらに好ま
しくは５重量％以下が望ましい。このようなペプチドを
得るには、疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低い基
質特異性を持つエンドペプチダーゼを、蛋白質１００重
量部に対して0.01〜１重量部使用し、30〜45℃で、１〜
100 時間程度処理すればよい。こうして得られる蛋白質
分解ペプチドの苦味は、後述する苦味評価に従った等価
濃度で、好ましくは0.05％以下、更に好ましくは0.04％
以下、最も好ましくは0.02％以下である。
【００１３】
【実施例】以下、本発明を実施例に従って説明するが、
本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
【参考例】以下の実施例では、特開平9-121870号公報記
載の組み換え体プロテアーゼＤ３のＣ末端側に新たに６
アミノ酸残基（Cys,Asp,Asn,Tyr,Try,Ser)を付加し、天
然に存在するＤ３と同じ、全長が247 アミノ酸からなる
組み換え体プロテアーゼＤ３（以下「ｒＤ３」という）
を使用した。また、この組み換え体の製造においては、
大腸菌でのｒＤ３発現量を増加させるため、プロモータ
ーとして、トリプトファン欠乏で容易に転写が誘導され
るtrp プロモーターを使用した。以下、ｒＤ３の製造法
を説明する。 (1) 形質転換体の作製と培養、封入体の調製 コンピテントセル法によりｒＤ３遺伝子を組み込んだプ
ラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を150 μ
g/mlのアンピシリンを含む寒天培地で選択した。形質転
換体を150 μg/mlのアンピシリンを含む3 mlの2xYT培地
に接種し、37℃で約10時間培養した。この前培養液1 ml
を150 μg/mlのアンピシリンを含む50mlのＭ９−カザミ
ノ酸培地に移し、35℃で約20時間本培養を行った。培養
終了後、遠心により集菌した菌体をＡ液（10mM Tris-HC
l, 1mM EDTA, pH8.0) に懸濁し、超音波破砕した。これ
を、10000rpmで10分間遠心し、Ｂ液（Ａ液＋0.5% Trito
nX-100)で洗浄後、さらにＡ液で洗浄した。最終的に得
られた画分を封入体とした。 (2) ｒＤ３の巻き戻し 上記の方法で調製した封入体を変性剤溶液(8mM尿素, 10
mM DTT, 50mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH8.0) に約20mg/m
l の蛋白質濃度となるように溶解し、40℃で１時間イン
キュベートし、10000rpmで10分間遠心分離を行い上清を
得た。巻き戻し液で平衡化した脱塩カラムPD-10(Sephad
ex G-25, Pharmacia Biotech) に封入体溶液2.5 mlを添
加し、3.5 mlの巻き戻し液で溶出し、ｒＤ３の巻き戻し
を行った。溶出液は、50mMリン酸カリウム, 5mM EDTA,
1mM グルタチオン (還元型), 0.1mMグルタチオン (酸化
型), pH10.5 を用いた。 (3) ｒＤ３の活性化 巻き戻したｒＤ３はpro 配列を有しており、非活性型で
ある。蛋白質分解には以下の方法で予め活性化したｒＤ
３を用いた。巻き戻しｒＤ３を50mM酢酸バッファーに5m
g/ml程度になるよう混合し、37℃でインキュベートし
た。白濁消失後に分画分子量10kDa のウルトラフリー(M
ILLIPORE) で濃縮、脱塩した。蛋白質量を測定後、分解
に用いた。
載の組み換え体プロテアーゼＤ３のＣ末端側に新たに６
アミノ酸残基（Cys,Asp,Asn,Tyr,Try,Ser)を付加し、天
然に存在するＤ３と同じ、全長が247 アミノ酸からなる
組み換え体プロテアーゼＤ３（以下「ｒＤ３」という）
を使用した。また、この組み換え体の製造においては、
大腸菌でのｒＤ３発現量を増加させるため、プロモータ
ーとして、トリプトファン欠乏で容易に転写が誘導され
るtrp プロモーターを使用した。以下、ｒＤ３の製造法
を説明する。 (1) 形質転換体の作製と培養、封入体の調製 コンピテントセル法によりｒＤ３遺伝子を組み込んだプ
ラスミドをE.coli JM109に導入し、形質転換体を150 μ
g/mlのアンピシリンを含む寒天培地で選択した。形質転
換体を150 μg/mlのアンピシリンを含む3 mlの2xYT培地
に接種し、37℃で約10時間培養した。この前培養液1 ml
を150 μg/mlのアンピシリンを含む50mlのＭ９−カザミ
ノ酸培地に移し、35℃で約20時間本培養を行った。培養
終了後、遠心により集菌した菌体をＡ液（10mM Tris-HC
l, 1mM EDTA, pH8.0) に懸濁し、超音波破砕した。これ
を、10000rpmで10分間遠心し、Ｂ液（Ａ液＋0.5% Trito
nX-100)で洗浄後、さらにＡ液で洗浄した。最終的に得
られた画分を封入体とした。 (2) ｒＤ３の巻き戻し 上記の方法で調製した封入体を変性剤溶液(8mM尿素, 10
mM DTT, 50mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH8.0) に約20mg/m
l の蛋白質濃度となるように溶解し、40℃で１時間イン
キュベートし、10000rpmで10分間遠心分離を行い上清を
得た。巻き戻し液で平衡化した脱塩カラムPD-10(Sephad
ex G-25, Pharmacia Biotech) に封入体溶液2.5 mlを添
加し、3.5 mlの巻き戻し液で溶出し、ｒＤ３の巻き戻し
を行った。溶出液は、50mMリン酸カリウム, 5mM EDTA,
1mM グルタチオン (還元型), 0.1mMグルタチオン (酸化
型), pH10.5 を用いた。 (3) ｒＤ３の活性化 巻き戻したｒＤ３はpro 配列を有しており、非活性型で
ある。蛋白質分解には以下の方法で予め活性化したｒＤ
３を用いた。巻き戻しｒＤ３を50mM酢酸バッファーに5m
g/ml程度になるよう混合し、37℃でインキュベートし
た。白濁消失後に分画分子量10kDa のウルトラフリー(M
ILLIPORE) で濃縮、脱塩した。蛋白質量を測定後、分解
に用いた。
【００１５】
【実施例１】分離大豆蛋白質溶液をpH4.5 付近に塩酸で
調整した。この分離大豆蛋白質溶液に活性体ｒＤ３を基
質／酵素＝５００／１（重量比）となるように加え、37
℃で24時間反応させた。反応終了後、100 ℃で15分間の
加熱処理により酵素を失活させ、遠心分離で上清画分を
得た。上清部分のpHをNaOHで中性付近に中和し、凍結乾
燥により酵素分解ペプチドを得た。この分解ペプチド中
に共存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。別
に、活性体ｒＤ３の代わりに、ペプシン、またはアルカ
ラーゼ（ノボノルディスク社製）をそれぞれの至適pHに
調整した分離大豆蛋白質溶液に加え、基質／酵素＝５０
０／１（重量比）となるように加え、37℃で24時間反応
させた。反応終了後、同様の方法で酵素分解ペプチドを
得た。この分解ペプチド中に共存する遊離アミノ酸は５
重量％以下であった。分解ペプチドの平均分子量を表１
に示す。
調整した。この分離大豆蛋白質溶液に活性体ｒＤ３を基
質／酵素＝５００／１（重量比）となるように加え、37
℃で24時間反応させた。反応終了後、100 ℃で15分間の
加熱処理により酵素を失活させ、遠心分離で上清画分を
得た。上清部分のpHをNaOHで中性付近に中和し、凍結乾
燥により酵素分解ペプチドを得た。この分解ペプチド中
に共存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。別
に、活性体ｒＤ３の代わりに、ペプシン、またはアルカ
ラーゼ（ノボノルディスク社製）をそれぞれの至適pHに
調整した分離大豆蛋白質溶液に加え、基質／酵素＝５０
０／１（重量比）となるように加え、37℃で24時間反応
させた。反応終了後、同様の方法で酵素分解ペプチドを
得た。この分解ペプチド中に共存する遊離アミノ酸は５
重量％以下であった。分解ペプチドの平均分子量を表１
に示す。
【００１６】
【表１】酵素 平均分子量 ｒＤ３ １１５３ ペプシン １２５６アルカラーゼ ５８５
【００１７】分解ペプチドの苦味評価は以下のように行
った。まず、カフェインを0.00, 0.02, 0.04, 0.06およ
び0.08重量％となるように水に溶解した標準苦味液を調
製し、各標準苦味液の苦味スコアをそれぞれ１（全く苦
味なし）、２（殆ど苦味なし）、３（僅かに苦味があ
る）、４（苦味がある）および５（苦味が強い）とす
る。評価のパネル（６名）はあらかじめ訓練を行い、カ
フェインの苦味と濃度の識別が十分に行えるようにして
おく。次に、分解ペプチドを所定濃度（この実施例では
２重量％）となるように水に溶解し、各パネルは、この
ペプチド試料液の苦味をカフェイン標準苦味液と比較
し、苦味が最も近い標準苦味液の苦味スコアをその試料
液の苦味スコアとする。各パネルが与えたスコアの平均
値を求め、これに対応するカフェイン濃度（等価濃度）
を、各試料の苦味の指標とする。上記評価方法により得
られた各試料の等価濃度を表２に示した。ｒＤ３分解ペ
プチドは他の酵素分解ペプチドと比較して有意に苦味が
弱く、食品として十分に耐えうるものである。
った。まず、カフェインを0.00, 0.02, 0.04, 0.06およ
び0.08重量％となるように水に溶解した標準苦味液を調
製し、各標準苦味液の苦味スコアをそれぞれ１（全く苦
味なし）、２（殆ど苦味なし）、３（僅かに苦味があ
る）、４（苦味がある）および５（苦味が強い）とす
る。評価のパネル（６名）はあらかじめ訓練を行い、カ
フェインの苦味と濃度の識別が十分に行えるようにして
おく。次に、分解ペプチドを所定濃度（この実施例では
２重量％）となるように水に溶解し、各パネルは、この
ペプチド試料液の苦味をカフェイン標準苦味液と比較
し、苦味が最も近い標準苦味液の苦味スコアをその試料
液の苦味スコアとする。各パネルが与えたスコアの平均
値を求め、これに対応するカフェイン濃度（等価濃度）
を、各試料の苦味の指標とする。上記評価方法により得
られた各試料の等価濃度を表２に示した。ｒＤ３分解ペ
プチドは他の酵素分解ペプチドと比較して有意に苦味が
弱く、食品として十分に耐えうるものである。
【００１８】
【表２】酵素 等価濃度（％） ｒＤ３ ０．０２０ ペプシン ０．０５３＊アルカラーゼ ０．０６７＊ ＊ p<0.05でｒＤ３分解物より有意に苦い
【００１９】
【実施例２】酸カゼイン溶液をpH4.5 付近に塩酸で調整
した。分離大豆蛋白質溶液の場合と同様に活性体ｒＤ３
を基質／酵素＝５００／１（重量比）となるように加
え、37℃で24時間反応させた。反応終了後、100 ℃で15
分間の加熱処理により酵素を失活させ、遠心分離で上清
画分を得た。上清部分のpHをNaOHで中性付近に中和し、
凍結乾燥により分解ペプチドを得た。この分解ペプチド
中に共存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。別
に、活性体ｒＤ３の代わりに、トリプシン、またはアル
カラーゼをそれぞれの至適pHに調整した分離大豆蛋白質
溶液に基質／酵素＝５００／１（重量比）となるように
加え、37℃で24時間反応させた。反応終了後、同様の方
法で酵素分解ペプチドを得た。この分解ペプチド中に共
存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。得られた
分解ペプチドの平均分子量を表３に示す。分解ペプチド
を１重量％となるように水に溶解し、苦味評価を行っ
た。表４に示したとおり、ｒＤ３分解ペプチドは有意に
他の酵素より苦味が弱く、ペプチド素材としての優位性
が示された。
した。分離大豆蛋白質溶液の場合と同様に活性体ｒＤ３
を基質／酵素＝５００／１（重量比）となるように加
え、37℃で24時間反応させた。反応終了後、100 ℃で15
分間の加熱処理により酵素を失活させ、遠心分離で上清
画分を得た。上清部分のpHをNaOHで中性付近に中和し、
凍結乾燥により分解ペプチドを得た。この分解ペプチド
中に共存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。別
に、活性体ｒＤ３の代わりに、トリプシン、またはアル
カラーゼをそれぞれの至適pHに調整した分離大豆蛋白質
溶液に基質／酵素＝５００／１（重量比）となるように
加え、37℃で24時間反応させた。反応終了後、同様の方
法で酵素分解ペプチドを得た。この分解ペプチド中に共
存する遊離アミノ酸は５重量％以下であった。得られた
分解ペプチドの平均分子量を表３に示す。分解ペプチド
を１重量％となるように水に溶解し、苦味評価を行っ
た。表４に示したとおり、ｒＤ３分解ペプチドは有意に
他の酵素より苦味が弱く、ペプチド素材としての優位性
が示された。
【００２０】
【表３】酵素 平均分子量 ｒＤ３ １２０２ トリプシン ２０９６アルカラーゼ ７９５
【００２１】
【表４】酵素 等価濃度（％） ｒＤ３ ０．０２０ トリプシン ０．０５３＊アルカラーゼ ０．０７３＊ ＊ p<0.05でｒＤ３分解物より有意に苦い
【００２２】
【発明の効果】本発明によって調製されたペプチドは、
現在産業上用いられている酵素で調製されたペプチドと
比較して苦味が弱く、非常に飲食し易く、アミノ酸の遊
離も少ない。また蛋白質が本来有する栄養価を十分に利
用することが出来る。従って、本発明によって調製され
たペプチドは、食品、経腸栄養剤、医療食、調味料、風
味改良材、食品物性改良材、食品添加物、飼料等多くの
分野で用いられる。
現在産業上用いられている酵素で調製されたペプチドと
比較して苦味が弱く、非常に飲食し易く、アミノ酸の遊
離も少ない。また蛋白質が本来有する栄養価を十分に利
用することが出来る。従って、本発明によって調製され
たペプチドは、食品、経腸栄養剤、医療食、調味料、風
味改良材、食品物性改良材、食品添加物、飼料等多くの
分野で用いられる。
フロントページの続き (72)発明者 三輪 哲也 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 丹尾 式希 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B047 LB06 LE01 LG19 LG58 LP18 4B064 AG01 BA10 CA02 CA19 CA21 CC03 CC24 CD20 DA10 4H045 AA20 CA33 CA43 EA01 FA70 HA03
Claims (2)
- 【請求項１】 疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低
い基質特異性を持つエンドペプチダーゼを蛋白質に作用
させることを特徴とする低苦味ペプチドの製造法。 - 【請求項２】 疎水性アミノ酸末端を切断する活性が低
い基質特異性を持つエンドペプチダーゼが、発芽ダイズ
酵素システインプロテアーゼＤ３である請求項１記載の
低苦味ペプチドの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10261175A JP2000083695A (ja) | 1998-09-16 | 1998-09-16 | 低苦味ペプチドの製造法 |
| US09/805,248 US6455273B1 (en) | 1998-09-16 | 2001-03-14 | Method for producing a protein hydrolysate with low bitterness |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10261175A JP2000083695A (ja) | 1998-09-16 | 1998-09-16 | 低苦味ペプチドの製造法 |
| US09/805,248 US6455273B1 (en) | 1998-09-16 | 2001-03-14 | Method for producing a protein hydrolysate with low bitterness |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000083695A true JP2000083695A (ja) | 2000-03-28 |
Family
ID=26544958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10261175A Pending JP2000083695A (ja) | 1998-09-16 | 1998-09-16 | 低苦味ペプチドの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6455273B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000083695A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002055546A1 (fr) * | 2001-01-16 | 2002-07-18 | Ajinomoto Co.,Inc. | Inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine |
| US6455273B1 (en) * | 1998-09-16 | 2002-09-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a protein hydrolysate with low bitterness |
| WO2002081708A1 (fr) * | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de prothease thiol d3 |
| WO2004032641A1 (ja) * | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Ajinomoto Co., Inc. | チーズの製造法 |
| WO2005079826A1 (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-01 | Ajinomoto Co., Inc. | 疲労回復剤及び疲労回復用食品 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7399496B2 (en) * | 2003-02-07 | 2008-07-15 | Glanbia Nutritionals (Ireland) Limited | Hydrolyzed whey protein compositions |
| WO2004086882A1 (en) * | 2003-04-03 | 2004-10-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Powderous formulations of fat-soluble active ingredients |
| ATE531274T1 (de) * | 2003-07-15 | 2011-11-15 | Dsm Ip Assets Bv | Pulverförmige zusammensetzungen von fettlöslichen substanzen |
| DE10339180A1 (de) * | 2003-08-21 | 2005-03-24 | Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag | Kollagenhydrolysat |
| US8252314B2 (en) * | 2004-09-24 | 2012-08-28 | Hill's Pet Nutrition, Inc. | Hypoallergenic composition |
| BRPI0611740A2 (pt) | 2005-06-09 | 2012-08-28 | Hills Pet Nutrition Inc | composição alimentìcia cozida retortável, produto alimentìcio suplementado por glutamina, processo para a preparação de um produto alimentìcio suplementado com glutamina, métodos para aumentar a absorção de glutamina em um animal, para o fortalecimento da função imune de um animal com sua necessidade, para aumentar a estabilidade da glutamina suplementar adicionada antes do cozimento e/ou esterilização de uma composição alimentìcia retornável, e, meio para comunicar a informação ou instruções sobre a alimentação de uma composição alimentìcia cozida |
| US20100184132A1 (en) * | 2006-01-13 | 2010-07-22 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Enzymatic Process for Debittering of Protein Hydrolysate Using Immobilized Peptidases |
| MY158225A (en) * | 2007-11-07 | 2016-09-15 | Mjn Us Holdings Llc | Method for decreasing bitterness and improving taste of protein-free and hydrolyzed infant formulas |
| US8974843B2 (en) | 2010-10-01 | 2015-03-10 | Ronald E. Rosedale | mTOR pathway optimized nutritional compositions |
| CN103734666B (zh) * | 2013-12-20 | 2015-10-21 | 广东美味鲜调味食品有限公司 | 一种富肽酱油的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6098993A (ja) * | 1983-11-04 | 1985-06-01 | Fuji Oil Co Ltd | オリゴペプチド混合物の製造法 |
| JPS60192599A (ja) * | 1983-11-30 | 1985-10-01 | Fuji Oil Co Ltd | オリゴペプチド混合物の製造法 |
| JP3503220B2 (ja) | 1994-04-21 | 2004-03-02 | 味の素株式会社 | 新規チオールプロテアーゼ |
| JP3503319B2 (ja) | 1994-12-29 | 2004-03-02 | 味の素株式会社 | 新規チオールプロテアーゼをコードするｄｎａおよびこれを用いた該チオールプロテアーゼの製造方法 |
| JPH09294583A (ja) * | 1996-03-08 | 1997-11-18 | Ajinomoto Co Inc | アミノペプチダーゼｇｘ及びそれを用いるタンパク質の加水分解方法 |
| JP2000083695A (ja) * | 1998-09-16 | 2000-03-28 | Ajinomoto Co Inc | 低苦味ペプチドの製造法 |
| US6303359B1 (en) * | 1999-03-15 | 2001-10-16 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA molecule encoding new aminopeptidase, and method of producing the aminopeptidase |
-
1998
- 1998-09-16 JP JP10261175A patent/JP2000083695A/ja active Pending
-
2001
- 2001-03-14 US US09/805,248 patent/US6455273B1/en not_active Expired - Fee Related
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| US6455273B1 (en) * | 1998-09-16 | 2002-09-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a protein hydrolysate with low bitterness |
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| JP2005239579A (ja) * | 2004-02-24 | 2005-09-08 | Ajinomoto Co Inc | 疲労回復剤及び疲労回復用食品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6455273B1 (en) | 2002-09-24 |
| US20020168704A1 (en) | 2002-11-14 |
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