KR101577601B1

KR101577601B1 - 효소에 의한 단백질의 개질 방법

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Publication number: KR101577601B1
Application number: KR1020107022741A
Authority: KR
Inventors: 노리코 미와; 노부히사 심바; 미나 나카무라; 에이이치로 스즈키; 게이이치 요코야마; 히로유키 나카고시; 후미유키 히로세; 히로아키 사토
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤; 아마노 엔자임 가부시키가이샤
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2015-12-15
Also published as: BRPI0910821A8; EP2267146A1; JPWO2009113628A1; BRPI0910821B1; EP2267146A4; CN102016057A; BRPI0910821A2; KR20100127824A; CA2717340A1; TW200942616A; MX2010010076A; WO2009113628A1; JP5616216B2; MY155718A

Abstract

단백질에 프로테인 글루타미나제 및 트랜스글루타미나제의 양자를 작용시켜 단백질을 개질하는 방법을 제공하고, 양 효소에 의해 개질된 단백질을 함유하는 식품을 제공하며, 양 효소를 함유한 단백질 개질용 효소 제제를 제공하며, 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 단백질로의 적정 첨가량비를 밝혀내는 방법을 제공한다. 프로테인 글루타미나제의 단백질로의 첨가 시기를 트랜스글루타미나제의 첨가 시기와 실질적으로 동시로 하거나 또는 트랜스글루타미나제가 단백질에 작용하기 전으로 하거나, 또는 단백질에 작용시키는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가 비율을 소정의 비율로 함으로써, 단백질을 개질한다. 동위체 표식 암모늄으로 표식한 단백질의 NMR 시그널 강도 등에 의해 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 적정 첨가량비를 밝혀낸다.

Description

효소에 의한 단백질의 개질 방법{Method of denaturing protein with enzymes}

[관련 출원의 기재]

본 발명은, 일본국특허출원: 특원2008-066765호(2008년 3월 14일 출원) 및 특원2008-294890호(2008년 11월 18일 출원)의 우선권 주장에 기초하는 것이며, 동출원의 전체 기재 내용은 인용하여 본서에 도입되어 기재되어 있는 것으로 한다.

본 발명은, 단백질 중의 글루타민 잔기를 수식하는 효소인 트랜스글루타미나제와 프로테인 글루타미나제의 양자를 작용시켜 2개의 효소 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 단백질의 개질 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 이 방법을 사용하여 개질된 단백질을 함유하는 식품이나, 프로테인 글루타미나제 및 트랜스글루타미나제의 양자를 특정한 비율로 함유한 단백질 개질용 효소 제제, 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 기질 단백질로의 적정 첨가량비를 밝혀내는 방법 등에도 관한 것이다.

트랜스글루타미나제(이하, TG라고 약칭하는 경우가 있다)는, 단백질 및 펩타이드 중의 글루타민 잔기의 γ-카르복시아미드기와 1급 아민간의 아실 전이 반응을 촉매하는 효소이다. TG가 아실 수용체로서 단백질 중의 리신 잔기의 ε-아미노기에 작용하면, 단백질의 가교 중합 반응이 일어난다. 또한, 1급 아민이 존재하지 않는 경우에는, 물이 아실 수용체로서 기능하며, 글루타민 잔기를 글루탐산 잔기로 변환하는 탈아미드 반응을 촉매한다. 식품으로의 응용시에는 대부분이, 단백질의 가교 반응에 의한 것이며, 현재, 단백질의 겔 형성성 부여 또는 향상, 미가열에서의 단백질의 겔화, 접착 등의 성질을 이용하여, 생선묵, 햄, 소세지, 면류, 두부, 빵 등 여러 가지 용도에 따른 TG 제제가 개발되어 있다.

한편, 프로테인 글루타미나제(이하, PG라고 약칭하는 경우가 있다)는, 단백질 중의 글루타민 잔기의 아미드기를 탈아미드하는 작용을 갖는 효소이다. 그 상세한 기술은, 특허 문헌 1, 특허 문헌 2, 비특허 문헌 1 등에 개시되어 있는 바와 같다. 이들에 의하면 PG는 단백질 중의 아미드기에 직접 작용하고, 그것에 의해서 단백질 중의 글루타민 잔기는 글루탐산 잔기로 변환되며, 카르복실기가 생성되는 점에서, 단백질의 부전하의 증가, 정전 반발력의 상승, 등전점의 저하, 수화력의 증가 등이 일어난다. 그 결과, 단백질의 용해성, 수분산성의 증가, 유화력, 유화 안정성 의 향상 등 여러 가지 기능 특성의 향상을 초래하여, 단백질의 용도 확대가 기대된다.

이와 같이, TG도 PG도 산업상 유용한 효소인 것이 알려져 있지만, 이러한 효소를 병용함으로써 새로운 부가 가치를 수득한다고 하는 시도에 관해서, 구체적인 예는 거의 보고되어 있지 않다. 오히려, 특허 문헌 1에 TG 반응 제어제로서의 PG의 이용예가 나타나 있으며, 비특허 문헌 2에도 PG·TG가 공존한 경우, TG에 의한 가교 반응은 진행되지 않는 것이 기재되어 있다. 또한, TG와 PG의 반응성의 차이에 관한 지금까지의 지견을 보다 상세하게 서술한다. 양 효소 모두, 그 기질 단백질 중의 타겟은 동일한 글루타민 잔기이다. 그러나, 단백질 중의 개개의 글루타민 잔기로 대한 기질 특이성은 TG에 비해, PG 쪽이 넓다. 이것은, TG의 경우, 글루타민 잔기 이외에 리신 잔기의 ε-아미노기가 필요한 것에 대해, PG의 경우, 글루타민 잔기 이외에는 반응 환경중 풍부하게 존재하는 물을 필요로 할 뿐이기 때문이라고 생각된다. 예를 들면, 카세인 중의 글루타민 잔기에 대한 반응성은, Km 값, kcat 값에서 보아도 PG는 TG에 비해 촉매 효율이 압도적으로 높고, 양자가 공존한 경우, PG의 반응쪽이 우선하여 일어나 탈아미드화된 글루타민 잔기는 더이상 TG의 기질이 되지 않으며 가교 반응은 진행되지 않는다. 실제로, TG에 의한 카세인의 가교 고분자화 반응 도중에 PG를 첨가하는 실험에 의해, 카세인의 고분자화는 첨가와 동시에 정지하는 결과가 나타나고 있다. 또한, PG에 의해 미리 충분히 탈아미드화를 가한 카세인은 더이상 TG의 기질로 되지 않는, 즉 가교 고분자화되지 않는 것도 확인되고 있다[참조: 비특허 문헌 2]. 또한, Y. S. Gu 외는, 본 효소의 α-락트알부민에 대한 반응성에 관해서 조사하여, 6개의 글루타민 잔기 중 4개를 탈아미드화한다고 보고하고 있다[참조: 비특허 문헌 3]. 한편, 방선균 TG는 그 4개 중 하나인 글루타민 54에밖에 작용하지 않는 점에서, PG의 기질 특이성이 TG에 비해 넓은 것이 거기에 서술되어 있다. 또한, 특허 문헌 1에는, PG의 글루타민 잔기에 대한 높은 반응성을 이용함으로써, TG 반응을 적당한 시점에서 정지시킬 수 있고, PG가, 식품으로의 첨가에는 바람직하지 않은 EDTA나 염화암모늄 등 일반적으로 알려진 TG 저해제를 대체할 수 있을 가능성이 거론되고 있다.

그러나, PG에 의한 TG 반응의 정지 이외의 관점에서 양자의 병용 방법이 제안되어 있는 예는 지금까지 거론되고 있지 않다. 그뿐 아니라, TG와 PG 양자를 기질 단백질에 작용시켜서 목적으로 하는 효과를 수득하는 조건, 보다 상세하게는, TG 반응이 PG에 의해 정지되지 않고, PG가 공존하는 조건하에서도 TG 반응 및 그 개질 효과가 손상되지 않는 조건에 관해서는, 종래의 지견만으로는 알 수가 없다. 또한, 여러 가지 기질 단백질에 대해, TG와 PG를 어떤 비율로 작용시킨 경우에, 어떤 효과가 나타나는지 등, 양 효소를 효과적으로 사용하기 위한 구체적한 방법이 나타난 예는 없으며, 따라서, 완전히 새로운 시도라고 할 수 있으며, TG, PG에 의해 개질된 단백질 제품의 개발을 한다고 하면, 각 용도별 최적의 반응 조건을 모색하는 수 밖에 없는 것이 현재 상황이다.

또한, 효소 반응은, 처리 시간, 온도, 효소 첨가량, 기질의 종류, 상태, 기질 특이성 등, 여러 가지 인자에 의해 그 반응량 및 그 효과의 정도가 다르기 때문에, 기질을 공통으로 하는 2개의 효소를 능숙하게 사용하는 것은 용이한 것이 아니며, 개발자, 가공업자가 용도 마다, 원하는 식품의 제조 조건을 결정하기 위해서는 막대한 시간, 노동력을 필요로 한다. 왜냐하면, 효소 반응은, 처리 시간, 온도, 효소 첨가량, 기질의 종류, 상태, 기질 특이성 등 여러 가지 인자에 의해 그 반응량 및 그 효과의 정도가 다른 데다가, 2개의 효소를 동시에 작용시키고자 하면, 모든 조합을 검토할 필요가 있기 때문이다. 따라서 기질을 공통으로 하는 2개의 효소를 능숙하게 사용하는 방법의 개발이 요구된다.

그런데, 지금까지 TG의 기질 특이성을 조사하는 방법으로서, NMR을 이용하는 방법이 알려져 있다[참조: 특허 문헌 3]. 즉, ¹⁵N 표식 염화암모늄 존재하에서 임의의 단백질을 TG와 작용시켜 TG의 기질이 되는 글루타민 잔기의 카르복시아미드질소를 ¹⁵N 표식한 것을 NMR로 관측함으로써, TG의 반응을 추적하는 방법이다. 이 방법을 사용하면, 단백질 기질을 사용하여 반응성과 기질 특이성을 동시에 해석할 수 있다. 그러나, 특허 문헌 3에는, PG가 반응하는 글루타민 잔기의 카르복시아미드질소가, ¹⁵N 표식되는 것은 기재되어 있지 않다.

특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 2000-50887호

특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 2001-218590호

특허 문헌 3: 일본 공개특허공보 2002-332295호

비특허 문헌 1: Yamaguchi 외, Eur. J. Biochem. Vol.268, 2001, 1410-1412 페이지

비특허 문헌 2: 식품효소화학의 최신기술과 응용-푸드프로테오믹스로의 전망-(CMC 출판), 146 내지 153페이지

비특허 문헌 3: Y. S. Gu 외, J. Agric. Food Chem. Vol.49, 2001, 5999-6005 페이지

이상의 특허 문헌 1 내지 3 및 비특허 문헌 1 내지 3의 전체 개시 내용은, 본서에 인용하여 도입되어 기재되어 있는 것으로 한다.

이하의 분석은, 본 발명의 관점에서 주어진다.

본 발명의 목적은, 단백질에 프로테인 글루타미나제 및 트랜스글루타미나제의 양자를 작용시켜서 단백질을 개질하는 방법을 제공하는 것, 양 효소에 의해 개질된 단백질을 함유하는 식품을 제공하는 것, 양 효소를 함유한 단백질 개질용 효소 제제를 제공하는 것, 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 적정 첨가량비를 간편하게 밝혀내는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기한 것을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 지금까지, PG가 존재하는 경우에는 TG는 작용하지 않으며, PG, TG의 병용 효과는 수득되기 어려운 것으로 생각되고 있었지만, 소정 조건하에서는, PG와 TG가 공존한 경우에 있어서도, 기질 단백질에 양 효소가 작용하여, 양 효소의 병용 효과가 수득되는 것을 밝혀내었다. 또한, PG가 TG와 같이, 단백질 중의 글루타민 잔기의 탈아미드화를 촉매하는 것 이외에, 암모늄염과의 교환 반응도 촉매하는 사실을 발견하였다. 즉, TG 또는 PG가 반응하는 글루타민 잔기의 카르복시아미드질소는, ¹⁵N 표식된다. 여기서, ¹⁵N 표식된 것을 검출하는 측정법, 예를 들면 ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시하면, ¹⁵N 표식율이 NMR 시그널 강도로부터 어림되어 각각의 반응성의 차이를 알 수 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 여러 가지 단백질에 관해서 TG와 PG의 존재 비율이, 각각의 NMR 시그널 강도 비율과 양호한 상관이 있는 것을 밝혀내었다. 또한, TG에 대한 PG의 시그널 강도 비율(이하, PG/TG 시그널 강도비라고 기재한다)이 0.2 내지 3.0인 범위를 부여하는 PG/TG 효소 중량비 또는 활성비가, TG 반응이 PG에 의해 정지되지 않고, PG가 공존하는 조건하에서도 TG 반응 및 그 개질 효과가 손상되지 않는 조건인 것을 밝혀내었다. 즉, ¹⁵N 표식 암모늄 존재하에서 TG 또는 PG를 각각 기질에 작용시켜, NMR을 사용하여 양자의 기질 특이성을 비교함으로써, 양 효소의 병용 효과가 수득되는 조건을 간편하게 밝혀낼 수 있는 것을 발견하였다. 우리들은 PG와 TG를 동시에 작용시키는 이점을 밝혀낸 후, 그 조건을 현실적으로, 용이하게 결정하는 방법을 생각해 낸 것에 성공한 것이다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 프로테인 글루타미나제 및 트랜스글루타미나제를 단백질에 작용시켜서 단백질을 개질하는 방법에 있어서, 프로테인 글루타미나제의 단백질로의 첨가 시기가, 트랜스글루타미나제의 첨가 시기와 실질적으로 동시이거나, 또는 트랜스글루타미나제가 당해 단백질에 작용하기 전인 단백질의 개질 방법.

(2) 상기 항목 (1)에 있어서, 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, 활성비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.05 내지 3 : 1인 방법.

(3) 상기 항목 (1) 또는 (2)에 있어서, 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, 중량비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.01 내지 0.7 : 1인 방법.

(4) 상기 항목 (1) 내지 (3) 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, NMR 시그널 강도비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1이 되는 조건인 개질 방법.

(5) 상기 항목 (1) 내지 (4) 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 유단백질, 유청 단백질, 대두 단백질, 소맥 글루텐, 플라즈마, 근육 단백질, 콜라겐 및 젤라틴으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 것인 방법.

(6) 상기 항목 (1) 내지 (5) 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 개질된 단백질을 함유하는 식품.

(7) 트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, 활성비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.05 내지 3 : 1인 단백질 개질용 효소 제제.

(8) 트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, 중량비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.01 내지 0.7 : 1인 단백질 개질용 효소 제제.

(9) 트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, NMR 시그널 강도비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1이 되는 조건인 것을 특징으로 하는 단백질 개질용 효소 제제.

(10) 트랜스글루타미나제와 프로테인 글루타미나제를 각각 따로 따로 동위체 표식 암모늄염의 존재하에서 단백질에 작용시켜 당해 단백질의 글루타민 잔기의 관능기를 동위체 표식하고, 그 NMR 시그널 강도를 측정함으로써, 당해 단백질에 있어서의 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 적정 첨가량비를 밝혀내는 방법.

본 발명에 의하면, TG 또는 PG 중 어느 하나의 효소를 단독으로 사용한 경우와는 상이한 단백질의 개질 효과, 즉 TG 및 PG의 병용 효과, 구체적으로는, 식품에 함유되는 단백질의, 당해 식품에 미치는 성질이 개질되고, 그 결과 단백질 함유 식품의 식감(단단함, 매끈 매끈함 등)이 개량되는 효과를 수득할 수 있는, 단백질의 신규 개질 방법을 제공할 수 있다. 또한, 이러한 개질 방법을 사용하여 수득되는 신규 특징을 갖는 단백질을 함유하는 식품을 제공할 수 있다. 또한, 단백질에 있어서 TG 및 PG의 양 효소가 모두 기질에 작용하여 상기 효과가 수득되도록 하기에 적절한 조건(첨가 조건)을 간편하게 밝혀내는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 ¹⁵NH₄Cl 존재하에 있어서의 α-락트알부민의 NMR에 있어서의 ¹H-¹⁵N HSQC 스펙트럼이다(실험예 1).

본 발명에 사용하는 TG는, 젤라틴, 치즈, 요구르트, 두부, 생선묵, 햄, 소세지, 면류 등의 식품의 제조나 식육의 육질 개선 등에 널리 이용되고 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호(참고 문헌 1)]. 또한, 열에 안정적인 마이크로캡슐의 소재, 고정화 효소의 담체 등의 제조에 이용되고 있는 등, 산업상 다양한 목적으로 사용되어 있는 효소이다. TG는, 단백질 분자의 펩타이드쇄 내에 있는 글루타민 잔기의 γ-카르복시아미드기의 아실 전이 반응을 촉매한다. TG가 단백질 분자 중의 리신 잔기의 ε-아미노기가 아실 수용체로서 작용하면 단백질 분자중 및 분자간에 있어서 ε-(γ-글루탐산)-리신 결합이 형성된다. 또한, 참고 문헌 1의 기재 내용은, 인용하여 본서에 도입된다.

TG로서는 칼슘 비의존성의 것과 칼슘 의존성의 것이 있으며, 모두 본 발명에 사용할 수 있다. 전자의 예로서는, 방선균, 고초균 등의 미생물 유래의 것[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호(참고 문헌 2)]를 들 수 있다. 후자의 예로서는 모르모트 간장 유래의 것[참조: 일본 특허공보 제(평)1-50382호(참고 문헌 3)], 사람 표피 케라틴 세포 TG[참조: Phillips, M. A. et al. (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 9333(참고 문헌 4)], 사람 혈액 응고 인자 XIII[참조: Ichinose, A. et al. (1990) Biochemistry 25, 6900.(참고 문헌 5)], 난균 등의 미생물 유래의 것, 소 혈액, 돼지 혈액 등의 동물 유래의 것, 연어, 참돔 등의 어류 유래의 것[참조: 세키 노부오 등, 「일본수산학회지」56권 125 내지 132페이지, 1990년(참고 문헌 6)], 굴 유래의 것 등을 들 수 있다. 이밖에, 유전자 재조합에 의해 제조되는 것[참조: 일본 공개특허공보 제(평)1-300889호(참고 문헌 7), 일본 공개특허공보 제(평)6-225775호(참고 문헌 8), 일본 공개특허공보 제(평)7-23737호(참고 문헌9)] 등을 들 수 있다. 본 발명에는 어느 것이라도 사용할 수 있고, 기원 및 제법에 한정되는 경우는 없다. 한편, 동위체 표식하는 단백질의 성질에 따라서는 칼슘을 포함하는 용매 중에서의 효소 반응이 바람직하지 못한 경우도 있기 때문에, 그러한 단백질에 관해서는 칼슘 비의존성의 TG를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 미생물 유래의 (MTG)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호(참고 문헌 10)] 등은 이 조건도 만족하는 것이며, 현시점에서는 최적이라고 할 수 있다. 예를 들면, 스트렙토베르티실리움 그리세오카르네움(Streptoverticillium griseocarneum) IFO 12776, 스트렙토베르티실리움 시나모네움(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum) IFO 12852, 스트렙토베르티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense) IFO 13819 등에 유래하는 것이다. 이하, 스트렙토베르티실리움 모바라엔스에 유래하는 트랜스글루타미나제를 MTG라고 부르는 경우가 있다. 또한, 상기 참고 문헌 2 내지 10의 기재 내용은, 인용하여 본서에 도입된다.

본 발명에 사용하는 TG의 활성 단위는, 다음과 같이 하여 측정되고 정의된다. 즉, 벤질옥시카르보닐-L-글루타밀글리신(Z-Gln-Gly)과 하이드록실아민을 기질로 하여 반응을 실시하고, 생성된 하이드록삼산을 트리클로르아세트산 존재하에서 철 착체로 변환시킨 후, 525nm의 흡광도로, 그 양을 측정한다. 이렇게 하여 하이드록삼산의 양으로부터 검량선을 작성하고, 1분 동안에 1μmol의 하이드록사메이트를 생성시키는 효소량을 활성 단위, 1유닛이라고 정의한다. 이 측정법의 상세한 것은 이미 보고되어 있는 바와 같다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호(참고 문헌 11) 등]. 또한, 참고 문헌 11의 기재 내용은, 인용하여 본서에 도입된다.

본 발명에 사용하는 PG는, 단백질의 아미드기에 직접 작용하여 펩타이드 결합의 절단 및 단백질의 가교를 동반하지 않고 탈아미드하는 작용을 가진다. 당해작용을 갖는 한에 있어서 그 종류는 특별히 한정되는 것이 아니다. 이러한 효소의 예로서, 특허 문헌 1 또는 특허 문헌 2에 개시된 효소가 있지만, 이들에 특별히 한정되는 것이 아니다. PG는, PG를 생산하는 미생물의 배양액으로부터 조제한 것을 사용할 수 있다. PG의 조제에 사용되는 미생물은 특별히 한정되지 않지만, 크리세오박테리움속, 플라보박테리움속, 엔페도박터속의 미생물이 예시된다.

미생물의 배양액으로부터의 PG의 조제 방법에 관해서는, 공지의 단백질 분리, 정제 방법(원심 분리, UF 농축, 염석, 이온 교환 수지 등을 사용한 각종 크로마토그래피 등)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고, 그 후 염석, 크로마토그래피 등을 조합하여 목적의 효소를 수득할 수 있다. 균체 내로부터 효소를 회수하는 경우에는, 예를 들면 균체를 가압 처리, 초음파 처리 등에 의해 파쇄한 후, 상기와 같이 분리, 정제를 실시함으로써 목적의 효소를 취득할 수 있다. 한편, 여과, 원심 처리 등에 의해 미리 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 상기 일련의 공정(균체의 파쇄, 분리, 정제)을 실시해도 된다. 효소는 동결 건조, 감압 건조 등의 건조법에 의해 분말화해도 되고, 그 때에 적당한 부형제, 건조 조제를 사용해도 된다.

본 발명의 PG의 활성 단위는, 특허 문헌 1 기재의 방법을 개량한 방법, 즉, 하기의 방법으로 측정한다.

(1) 30mM Z-Gln-Gly을 포함하는 176mM 인산 완충액(pH 6.5) 100㎕에 PG를 포함하는 수용액 10㎕을 첨가하고, 37℃, 10분간 항온처리한 후, 12% TCA 용액 100㎕을 가하여 반응을 정지시킨다. 이 때, 효소 농도가 0.05mg/ml이 되도록 20mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 적절히 희석한다.

(2) 원심 분리(12000rpm, 4℃, 5분간) 후, 상청에 관해서 F-kit 암모니아[Roche 제조]에 의한 NH₃의 정량을 실시한다. 그 방법은 이하와 같다.

(3) 시약 II액(F-kit 부속품) 100㎕에 상청 10㎕과 0.1M 트리에탄올아민 완충액(pH 8.0) 190㎕을 첨가하고, 실온에서 5분간 방치후 100㎕을 사용하여 340nm의 흡광도(E1)를 측정한다. 나머지 200㎕에, 1.0㎕의 시약 III(글루타메이트 데하이드로게나제)을 가한 후, 다시 20분간 실온에 방치한 후에 나머지 200㎕의 340nm의 흡광도(E2)를 측정한다. F-kit에 부속된 암모니아 표준액을 사용하여 작성한 암모니아 농도와 흡광도(340nm)의 변화량의 관계를 나타내는 검량선으로부터, 반응액 중의 암모니아 농도를 구한다.

(4) 단백질 농도의 측정은, 프로테인 어세이 CBB(쿠마시 브릴리언트 블루) 용액[나카라이테스크 제조]을 사용하고, 검출 파장 595nm으로 측정한다. Standard로서, BSA[Pierce사 제조]를 사용한다.

(5) PG의 활성을 이하의 식에 의해 구하였다.

본 발명에 있어서, PG 및 TG를 개질하고자 하는 단백질에 첨가하는 시기는, PG의 단백질로의 첨가 시기가, TG의 첨가 시기와 실질적으로 동시이거나, 또는 TG가 당해 단백질에 작용하기 전이다. 따라서, 특허 문헌 1에 기재되어 있는 TG 반응을 PG 첨가에 의해 정지시키는 방법은, PG의 단백질로의 첨가 시기가 TG가 당해 단백질에 작용하는 후이기 때문에, 본 발명에는 포함되지 않는다. 한편, PG 및 TG의 단백질로의 첨가 시기가 실질적으로 동시이다란, 일련의 원료 투입 공정에서, PG와 TG가 투입되는 것을 의미한다. 즉, 상업 규모의 제조에 있어서는, 원료 A를 투입후, 원료 B, 원료 C …을 순서대로 투입하는 것과 같이, 복수의 원료를 미리 혼합하지 않고, 순번대로 투입하는 것이 일반적이지만, 일련의 원료 투입 공정에서, PG와 TG가 투입되는 한, 본 발명의 「트랜스글루타미나제와 프로테인 글루타미나제의 단백질로의 첨가 시기가 실질적으로 동시이다」에 포함된다. 물론, PG, TG를 포함하는 복수의 원료를 미리 혼합하고, 첨가하는 경우도, 본 발명의 「실질적 동시」에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.

PG, TG를 반응시키는 온도는 일반적으로, 3 내지 60℃ 정도이며, 이 온도로 유지하면 약 1분 내지 약 48시간 정도에서 양자의 반응이 진행된다. 그러나, 바람직하게는 5 내지 50℃ 정도에서 약 5분 내지 약 24시간 정도 실시하는 것이 양호하다. 식품으로의 PG, TG의 첨가 방법은, 기질이 되는 단백질을 포함하는 원료에 PG, TG만을 첨가하거나 또는 다른 원료와 함께 첨가하면 양호하다. PG와 TG의 첨가량은 개질하는 단백질의 종류, 최종 제품이나 목적으로 하는 효과에 따라서 자유롭게 변화시킬 수 있지만, 예를 들면 TG의 첨가량은, 식품 원재료 중의 단백질 그램 중량당, 표준적으로는 0.1 내지 100유닛이다. 한편 PG는, 식품 원재료 중의 단백질 그램 중량당, 표준적으로는 0.01 내지 120유닛 첨가하면 양호하다. 단, 양자의 상기 첨가량은 기준이며, 본 발명의 소기의 효과를 나타내는 한 반드시 이들에 한정되는 것이 아니다.

본 발명에 있어서, 단백질에 작용시키는 PG와 TG의 비율이 중요하다. PG의 단백질로의 첨가 시기가 TG의 첨가 시기와 실질적으로 동시이거나, 또는 TG가 당해 단백질에 작용하기 전인 경우, 단백질에 첨가하는 프로테인글루타제와 트랜스글루타미나제의 첨가량은, 활성비에 있어서 PG : TG = 0.05 내지 3 : 1, 바람직하게는 PG : TG = 0.05 내지 2 : 1이면, PG, TG는 모두 단백질에 작용하기 때문에, 단백질을 개질할 수 있다. 또는 중량비에 있어서 PG : TG = 0.01 내지 0.7 : 1, 바람직하게는 PG : TG = 0.01 내지 0.4 : 1, 보다 바람직하게는 PG : TG = 0.01 내지 0.3 : 1이면, PG, TG는 모두 단백질에 작용하기 때문에, 단백질을 개질할 수 있다. PG의 비율이 상기 비율보다도 큰 경우는, PG의 작용이 TG에 비해 지나치게 발휘되어 병용에 의한 효과는 발휘되지 않으며, 또한 작은 경우는 반대로 PG의 작용이 지나치게 약해서 병용 효과는 그다지 기대할 수 없다.

또한, 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, NMR 시그널 강도비에 있어서, PG : TG = 0.2 내지 3.0 : 1, 바람직하게는 0.2 내지 2.3 : 1이 되는 조건이면, PG, TG의 첨가 시기에 의하지 않고, PG, TG는 모두 단백질에 작용하기 때문에, 단백질을 개질할 수 있다. PG의 비율이 상기 비율보다도 큰 경우는, PG의 작용이 TG에 비해 지나치게 발휘되어 병용에 의한 효과는 발휘되지 않으며, 또한 작은 경우는 반대로 PG의 작용이 지나치게 약해서 병용 효과는 그다지 기대할 수 없다.

본 발명의 NMR 시그널 강도비는, TG 또는 PG를 동위체 표식 암모늄염(¹⁵N 또는 ¹⁴N) 존재하에서, 기질 단백질에 작용시켜 당해 단백질의 글루타민 잔기를 동위체 표식한 후에, 표식된 단백질의 NMR 스펙트럼을 측정하고, NMR 시그널 강도로부터 산출할 수 있다. NMR의 측정법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, ¹⁵N 표식된 글루타민 잔기를 검출하는 경우에는, ¹H와 ¹⁵N의 상관 스펙트럼, 예를 들면 HSQC스펙트럼을 측정하면 된다. 시그널이 2개 이상 수득되는 경우는 각 시그널 강도의 총 합을 시그널 강도로서 산출한다. 즉, NMR 시그널 강도비는 「PG를 작용시킨 경우의 시그널 강도의 합」÷「TG를 작용시킨 경우의 시그널 강도의 합」으로 표현된다. 표식 화합물로서는 암모늄염이면 양호하며, 염화암모늄, 황산암모늄 등 널리 들 수 있다. ¹⁵N 표식하는 것이면 암모늄염의 질소가 ¹⁵N인 것을 사용하고, ¹⁴N 표식하는 것이면 암모늄염의 질소가 ¹⁴N인 것을 사용하면 된다. 표식 방법은, 수성 용매 중에서 약 pH 3.0 내지 약 pH 9.0의 범위, 바람직하게는 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.0의 범위에서, 온도 약 4 내지 약 65℃의 범위에서, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 60℃의 범위에서, 표식해야 할 단백질 및 암모늄염을 유지하면 양호하다. 반응 시간에는 특별히 제한은 없지만, 약 30초 내지 1주일, 보다 바람직하게는 약 1분 내지 약 1일로 하면 양호하다. 이 반응에 있어서, 표식해야 할 단백질의 농도에 대해 암모늄염의 농도를 약 10배 이상, 바람직하게는 약 200배 이상으로 하는 것이 바람직하고, 표식해야 할 단백질의 농도가 약 1μM 내지 약 40mM의 범위에서, 암모늄염의 농도가 약 10μM 내지 약 10M의 범위인 것이 보다 바람직하다. 한편, α-락토글로불린, 카세인, 대두 글로불린, 미오신, 액트 미오신 등 식품 중에 포함되는 단백질이 동위체 표식될 수 있기 때문에, 본 발명의 NMR 시그널 강도비는, 단백질을 포함하는 식품 전반에 있어서 측정할 수 있다.

TG 또는 PG의 작용에 의해, 단백질을 동위체 표식 염화암모늄과 반응시킨 예를 나타낸다. α-락트알부민(α-lactalbumin, 이후α-La라고 약칭한다)을 기질로서 사용하는 경우, 기질 용액(10mg/ml α-La, 200mM ¹⁵NH₄Cl, 5% D₂O/20mM Tris-HCl(pH 7.0))을 조제하고, 기질-효소비가 1000:1이 되도록 TG 또는 PG를 첨가후, 37℃, 26.5시간 동안 항온처리한다. 항온처리후의 용액을 NMR 샘플관에 옮기고, Bruker사 제조의 Avance600 등을 사용하여, ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시한다. 카르복시아미드질소가 ¹⁵N 표식되면, ¹⁵N에 2개의 ¹H가 결합하고 있기 때문에, 1개의 ¹⁵N의 화학 시프트에 대해 2개의 시그널이 페어로서 관측된다. 「PG를 작용시킨 경우의 시그널 강도의 합」÷「TG를 작용시킨 경우의 시그널 강도의 합」을 산출하고, NMR 시그널 강도비로 한다.

본 발명의 단백질은, 특별히 제한은 되지 않지만, 유단백질, 유청 단백질, 대두 단백질, 소맥 글루텐, 근육 단백질, 플라즈마, 콜라겐, 젤라틴 등을 들 수 있다. 또한 이러한 단백질을 2종 이상 혼합한 것이라도 양호하다. 본 발명에 해당하는 식품으로서는, 상기한 단백질을 PG, TG의 병용에 의해 개질한 것을 포함하는 것이면, 원료의 종류나 가공 상태는 상관없다. 예를 들면, 살균된 상태, 탈지된 상태, 희석된 상태, 농축된 상태, 건조된 상태, 그 외, 여러 가지 가공을 한 상태도 여기에 포함된다.

다음에, 본 발명의 효소 제제에 관해서 설명한다. 본 발명의 단백질 개질용 효소 제제는, 필수 구성 성분인 트랜스글루타미나제, 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, 활성비에 있어서 PG : TG = 0.05 내지 3 : 1, 바람직하게는 PG : TG = 0.05 내지 2 : 1인 것이나, 중량비에 있어서 PG : TG = 0.01 내지 0.7 : 1, 바람직하게는 PG : TG = 0.01 내지 0.4 : 1, 보다 바람직하게는 PG : TG = 0.01 내지 0.3 : 1인 것이나, NMR 시그널 강도비에 있어서, PG : TG = 0.2 내지 3.0 : 1, 바람직하게는 PG : TG = 0.2 내지 2.3 : 1이 되는 조건인 것이면 양호하며, PG, TG 이외에 이 분야에서 통상 사용되고 있는 유당, 자당, 말티톨, 소르비톨, 덱스트린, 분기 덱스트린, 사이클로덱스트린, 전분류, 다당류, 검류, 펙틴 등 다양한 임의 성분을 배합할 수도 있다. 또한, 동물성 단백질이나, 대두 단백질, 소맥 단백질 등의 식물성 단백질을 함유시킬 수도 있다. 또한, 중조, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 등의 생리학적으로 허용되는 무기 염류도 필요에 따라 본 효소 제제에 배합할 수 있다. 또한, 조미료, 설탕, 향신료, 착색료, 발색제, 아스코르브산, 그 염류 등의 유기 염류, 유화제, 유지 등도 적절히 배합할 수 있다.

본 발명은, 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 적정 첨가량비를 간편하게 밝혀내는 방법도 포함한다. 즉, 상기한 대로, PG와 TG를 각각 별도로 동위체 표식 암모늄염의 존재하에서 단백질에 작용시키고, 당해 단백질의 글루타민 잔기의 관능기를 동위체 표식하고, 그 NMR 시그널 강도를 측정하여, NMR 시그널 강도비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1, 바람직하게는 0.2 내지 2.3 : 1이 되는 조건을 밝혀냄으로써, PG와 TG의 적정 첨가량비를 밝혀낼 수 있다. PG와 TG의 NMR 시그널 강도비의 상기 적정 범위는, 기질 단백질의 종류에 의하지 않고 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1, 바람직하게는 0.2 내지 2.3 : 1이며, NMR 시그널 강도비와 각 기질 단백질에 있어서의 PG와 TG의 적정 첨가량비(활성비, 중량비) 간에는 상관이 있기 때문에, PG와 TG의 적정 첨가량비(활성비, 중량비)를 많은 실험에 의해 시행 착오를 반복하지 않고, 간단히 밝혀낼 수 있다.

이하에 실험예, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은, 이들 실시예에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.

실험예 1

α-락트알부민(α-lactalbumin, 이후α-La라고 약칭한다)[Sigma 제조]을 기질로서 사용하였다. 기질 용액(10mg/ml α-La, 200mM ¹⁵NH₄Cl, 5% D₂O/20mM Tris-HCl(pH 7.0))을 조제하고, 기질-효소비가 1000:1이 되도록 TG(아지노모토 「악티바」TG로부터의 효소 정제품) 또는 PG(특허 문헌 1 기재의 크리세오박테리움(Chryseobacterium)속 유래의 것)을 첨가후, 37℃, 26.5시간 동안 항온처리하였다. 항온처리후의 용액을 NMR 샘플관으로 옮기고, NMR(Bruker사 제조 Avance600)을 사용하고, ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시하였다. 26.5시간후의 ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시한 결과를 도 1에 도시한다. 카르복시아미드질소가 ¹⁵N 표식되면, ¹⁵N에 2개의 ¹H가 결합하고 있기 때문에, 1개의 ¹⁵N의 화학 시프트에 대해 2개의 시그널이 페어로서 관측된다. 도 1로부터, α-La에 존재하는 글루타민 잔기의 카르복시아미드질소 중 일부가 ¹⁵N 표식되는 것이 판명되어, PG에 의한 ¹⁵N 표식을 나타내는 것에 성공하였다. 이와 같이 본 방법에 의해, TG와 같이, PG도 탈아미드 반응뿐만 아니라 염화암모늄을 글루타민 잔기와 반응시킬 수 있는 것이 나타났다. 한편, NMR 시그널 강도는 도 1의 타원상의 스폿의 에어리어 면적의 총 합이며, 이 에어리어 면적이 클수록 반응량이 많은 것을 나타낸다.

실시예 1

시판 우유, 0.2M ¹⁵NH₄Cl, 5% D₂O에 실험예 1 기재의 TG 또는 PG를 각각 단독으로 첨가하고, 각 첨가 농도에 있어서의 시그널 강도를 산출하였다. TG는 기질/효소비(S/E비)가 중량비 7400/1이 되도록 첨가하였다. 한편, PG는, 중량비로 TG의 0.002 내지 5배 첨가하였다. 사용한 TG의 비활성은 효소 단백질 1mg당 26유닛, PG의 비활성은 효소 단백질 1mg당 120유닛이었다. 효소 첨가후의 용액을 37℃에서 3시간 동안 항온처리시킨 후, NMR 샘플관으로 옮기고, 실험예 1 기재의 NMR을 사용하여, ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시하였다. TG 첨가량을 기준으로 하여 그것에 대한 PG 첨가량을 각각의 효소 중량비(PG/TG) 및 활성비(PG/TG)로 나타내었다. 그리고, 각각의 비에 대응하는 PG/TG 시그널 강도비를 구한 결과를 표 1에 기재한다.

시판 우유를 사용하여 요구르트를 조제하였다. 시판 우유 400g을 50℃로 가온하고, 실험예 1 기재의 TG, PG를 표 2에 기재한 양을 첨가하였다. 사용한 TG의 비활성은 효소 단백질 1mg당 26유닛, PG의 비활성은 120유닛이었다. 50℃, 90분의 효소 반응을 실시한 후, 비등욕 중에서 섞으면서 가열하였다. 90℃에 도달하면 즉시 빙수에 담구어 45℃까지 냉각시켰다. 20g(대 원료 5%)의 스타터(메이지뉴교 가부시키가이샤 제조의 불가리아 요구르트)를 첨가하고, 잘 섞은 후 40g씩 시음컵에 분주하였다. 알루미늄호일로 뚜껑을 덮고, 38℃에서 pH가 4.5로 저하될 때까지 약 3 내지 4시간 동안 발효시켰다. 저온(4℃)에서 보존하고, 다음날, 물성 평가 및 관능평가를 실시하였다.

물성은, 텍스처 애널라이저[에이코세이키 제조]를 사용하여 파단응력을 측정하였다. 10mm 직경 원주형 플랜저를 사용하고, 파단 속도는 6cm/min(1mm/초)로 하였다. 그 결과를 표 3에 기재한다. TG만 첨가한 비교품 T의 파단응력은 대조품에 비해 현저하게 증가하였다. 이것은, TG에 의한 유단백질의 가교에 의한 효과이다. 본 발명품 1 내지 4에 관해서도, 역시 대조품과 비교하면 파단응력은 크고, TG에 의한 파단응력을 증가시키는 효과는 손상되지 않았다. 그러나, 비교품 T-P의 파단응력은, 비교품 P와 거의 변함이 없었던 점에서, TG 반응이 PG에 의해 거의 정지되어, TG의 효과가 거의 나타나지 않는 것이 확인되었다.

관능평가로 단단함을 6명의 패널이 평가하였다. 대조품을 0점으로 했을 때, 단단할수록 +5점, 부드러울수록 -5점이 되도록 채점하고, 평균치를 구하였다. 그 결과를 표 4에 기재한다. 대조품에 비해, TG만 첨가한 비교품 T는 현저하게 단단함이 증가하였다. 본 발명품 1 내지 4에 있어서도, TG에 의한 단단함의 증가는 유지되고 있었다. 그러나, 비교품 T-P의 단단함은, 비교품 P와 같이 요구르트를 연화시키고, 이것은 TG 반응이 PG에 의해 거의 정지되고, TG의 효과가 거의 나타나지 않는 것을 의미하는 것이다. 본 결과는, 위에서 나타낸 물성 측정의 결과를 대략 반영하는 것이다. 종합적인 식감의 선호도를 평가한 결과, 본 발명품 1 내지 4에서는, TG에 의한 요구르트의 단단함 향상 효과를 유지하면서, 매끈 매끈함은 TG만 첨가한 경우보다도 향상된다고 하는 바람직한 평가 결과가 수득되었다. 즉, PG, TG의 병용 효과가 확인되었다.

실시예 2

타카나시 저지방 우유(유단백 3.3%, 유지방 1.0%)에 유단백을 3.6%로 조정하기 위해서, 탈지 분유(로우히트 타입, 유단백 35% 함유, 요츠바뉴교 제조)를 0.85% 첨가하고, 55℃에서 가온하면서 용해하여, 요구르트용 원료유를 조제하였다. 당해 원료유를 비등욕 중에서 가열하여, 95℃ 달온한 후 2분 동안 유지한 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각시켰다. 47℃가 되면, 유산균 스타터(Yo-Flex, DVS YC-370, 크리스챤한센 제조)를 0.006% 첨가하는 동시에, TG, PG를 표 5에 기재한 대로, 첨가하여 잘 교반하였다. 플라스틱 컵에 일정량씩 분주하여, pH가 4.5 내지 4.6에 도달할 때까지 44℃의 항온처리기 내에서 발효시켰다. 발효 개시로부터 종료까지는 대체로 4 내지 5시간을 필요로 하고, 발효 종료후에는 냉장고(5℃)에서 보존하였다. 다음날, 수득된 세트 타입 요구르트의 표면 이수를 관찰하였다. 또한, 요구르트의 물성을 텍스처 애널라이저(장치 메이커: Stable Macro System, LTD)에 의해 평가하였다. 관능평가는, 5명의 훈련된 패널로 실시하였다. 요구르트의 물성 측정 조건은, 테스트 속도 1mm/s, 직경 10mm의 평판 플랜저, 10% 압축시의 파단응력과 부착 면적을 평가하였다. 파단응력은, 요구르트의 단단함, 부착 면적은, 요구르트의 크리미감과 상관이 높은 것을 본 발명자들은 이미 확인하고 있다. 평가의 결과를 표 6에 정리하였다.

표면 이수는, 대조품과 비교품 2가 많으며, 또한 비교품 3에서는 약간 많이 관찰되었다. 비교품 1, 본 발명품 1 및 2에서는 표면 이수는 나타나지 않고 표면에 윤기가 있었다. 한편, 물성 측정 및 관능평가 결과에 의하면, 비교품 1은 단단하고, 무른 한천과 같은 식감이며, 입안에 머금으면 촉촉한 느낌이었다. 비교품 2, 3은 대조품보다도 단단함이 감소되고, 부착성이 증가하였다. 관능평가에서는, 매끈매끈하지만, 부드럽고 바디감이 결여된다고 하는 코멘트도 있었다. 한편, 본 발명품 1, 2는 모두, 단단함과 부착성 양자가 증가하고, 바디감이 있으며, 매끈매끈하고 크리미한 요구르트이었다. 이상, 외관, 물성·식감으로부터 종합적으로 평가하면, 본 발명품 1, 2는 가장 바람직한 요구르트이며, TG와 PG를 적절한 균형으로 사용함으로써 세트 타입 저지방 요구르트의 식감 개량이 가능한 것이 나타났다.

실시예 3

타카나시 저지방 우유(유단백 3.3%, 유지방 1.0%)에 유단백을 3.94%로 조정하기 위해서, 탈지 분유(로우히트 타입, 유단백 35% 함유, 요츠바뉴교 제조)를 첨가하고, 55℃에서 가온하면서 용해하고, 요구르트용 원료유를 조제하였다. 당해 원료유를 비등욕 중에서 가열하고, 95℃ 달온한 후 2분 동안 유지한 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각시켰다. 47℃가 되면, 유산균 스타터(Yo-Flex, DVS YC-370, 크리스챤한센 제조)를 0.0O6% 첨가하는 동시에, TG, PG를 표 7에 기재한 대로, 첨가하여 잘 교반하였다. 스테인리스 컵에 일정량씩 분주하고, pH가 4.5 내지 4.6에 도달할 때까지 44℃의 항온처리기 내에서 발효시켰다. 발효 종료후에는 냉장고(5℃)에서 냉각시킨 후, 메쉬(216μm)의 체로 여과하여 스터드화하였다. 완성된 스터드 요구르트는 5℃에서 보존하고, 보존 단계에 있어서 외관 및 식감의 변화를 해석하는 것으로 하였다. 또한, 요구르트의 물성을 동적 점탄성 측정 장치(HAAKE, 레오스트레스 RS1)에 의해 평가하였다. 관능평가는, 3명의 훈련된 패널로 실시하였다. 요구르트의 물성 측정 조건은, 직경 6cm의 콘플레이트를 사용하고, 전단 속도 0→100〔1/s〕을 300초 동안 증가시킨 후, 즉시 전단 속도를 100→0〔1/s〕으로 동일한 시간에 걸쳐 감소시키는 프로그램을 작성하였다. 측정 온도는, 10℃로 하고, 전단 속도 100〔1/s〕일 때의 점도를 기록하였다. 결과를 표 8에 정리하였다.

스터드화하기 전의 표면 이수는, 대조품에서 대량으로, 또 비교품 2에서는 적은 양이 확인되었지만, 비교품 1, 본 발명품 1 내지 4에서는 거의 보이지 않았다. 스터드화한 직후의 관능평가의 결과, 대조품은 꺼끌거림이 있고, 촉촉하고 부드러운 식감이었다. 비교품 1은, 바디감이 부여되어 있지만, 꺼끌거리는 식감이었던 것에 대해, 비교품 2에서는, 표면의 윤기가 있고 매끈매끈하지만, 촉촉하고 부드러운 식감이었다. 본 발명품 1 내지 4는 모두 표면의 윤기가 있으며, 바디감과 함께, 매끈 매끈함도 부여되어 있었다. 점도의 측정 결과도 관능평가와 잘 일치하는 것이며, 본 발명품 1 내지 4의 점도는 대조품이나 비교품 2에 비하면 명백히 높고, 바디감이 부여된 것을 뒷받침하는 것이었다. 3주간 냉장 보존후의 외관 및 식감의 변화를 확인한 결과, 비교품 1은 멍울이 나타나며, 꺼칠꺼칠한 모래와 같은 식감이 현저했던 것에 대해, 본 발명품 1에서는 그 경향이 저감, 본 발명품 2 내지 4에서는 거의 개선되어 있었다. 이상의 결과를 종합적으로 평가하면, 대조품 및 비교품 1, 2와 비교하여, 본 발명품 1 내지 4는 명백히 물성, 식감(보존 중의 변화)의 점에서 우수한 것이었다.

이와 같이, TG만 사용한 요구르트(비교품 1)는, 무첨가품에 비해 바디감을 부여하는 효과는 있지만, 보존 중의 품질 열화가 문제가 되며, 또한, PG만 사용한 요구르트(비교품 2)는 매끈 매끈하지만, 바디감이 없는 촉촉한 식감이 문제가 된다. 그러나, TG와 PG를 일정 첨가 비율로 병용한 요구르트(본 발명품 1 내지 4)는 이러한 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 표면의 윤기나 매끈 매끈함을 부여함으로써 품질 향상이 가능한 것이 나타났다.

실시예 4

시판 두유(타이시 무조정; 최종 단백질 함량 4.8%), 0.2M ¹⁵NH₄Cl, 5% D₂O, 실험예 1 기재의 TG 또는 PG를 각각 단독으로 첨가하여 잘 혼합하였다. TG는 기질/효소비(S/E비)가 중량비 6000/1이 되도록 첨가하였다. 한편, PG는, TG의 0.01 내지 1배 첨가하였다. 37℃에서 1시간 15분 동안 항온처리시킨 후의 용액을 NMR 샘플관에 옮기고, 실험예 1 기재의 NMR을 사용하여, ¹H-¹⁵N HSQC 측정을 실시하였다. 실시예 1과 같이, 각각의 효소 중량비(PG/TG) 및 활성비(PG/TG)에 관해서, PG/TG 시그널 강도비를 산출한 결과를 표 9에 기재한다.

표 10에 기재한 첨가비로 TG와 PG를 병용한 두부를 조제하였다. 모듬 용기에 30% 간수[아코가세이 제조] 용액을 10g(간수 3g 상당), 스테인리스 저그(jug)에 상기 시판 두유를 1kg 칭량하여 중탕으로 55℃로 가온하였다. 두유에 효소 용액을 첨가하여 교반·혼합하고, 신속하게 간수가 들어간 모듬 용기에 거세게 쏟아 붓고, 교반판을 4회 상하시켰다. 뚜껑을 덮고, 55℃의 항온처리기에 옮기고, 50분간 정치하였다. 물을 채운 배트에 두부를 옮기고, 30분 내지 1시간 동안 방치한 후, 두부를 잘라 내어 두부 용기에 옮기고 내용 중량을 측정하였다. 용기에 찰랑 찰랑해질 때까지 물을 첨가하고, 필름을 덮어 가열 씰하였다. 85℃의 항온 수조에 투입하고, 45분간 가열하고(2차 가열), 그 후, 유수로 남은 열을 없애고, 빙수 중에서 차게 하여 냉장 보존하였다. 다음날, 용기내의 물을 제외하고 고형물의 중량을 측정하여, 물성 및 관능평가에 제공하였다.

물성 평가는, 레오미터[후도고교사 제조]에 의한 파단 시험을 실시하였다. 사용한 플랜저는 5mm 직경 원반, 파단 속도 6cm/분(1mm/초)로 하였다. 관능평가는 5명의 패널로 효소 무첨가품을 0점으로 하고, 매끈 매끈함과 단단함에 관해서 ±3점 사이에서 7단계 평가를 실시하고, 평균치를 구하였다. 표 11에 결과를 기재한다. TG를 첨가한 비교품 T1 및 T2는 대조품에 비해 파단응력이 증가하였다. 한편, PG를 첨가한 비교품 P1 및 P2는 대조품에 비해 파단응력이 감소되었다. 본 발명품 1은, 동량의 TG를 첨가한 비교품 T1과 파단응력은 거의 동등하고, 맛이 보다 매끄럽게 변화되었다. 본 발명품 2는, 동량의 TG를 첨가한 비교품 T2에 비해 파단응력은 약간 저하되었지만, 대조품과 비교하면 여전히 파단응력은 크고, 매끈 매끈함도 부여되어 있었다. 본 발명품 3은, 동량의 TG를 첨가한 비교품 T2와 비교하면 파단응력은 감소되었지만, 동량의 PG를 첨가한 비교품 P2와 비교하면 파단응력은 크고, TG의 첨가 효과를 확인할 수 있었다. 비교품 T-P는, 비교품 P1, P2와 동정도로 부드러우며, 이미 TG 반응에 의하지만 단단함 부여 효과가 나타나지 않았다. 이것은, TG 반응이 PG에 의해 거의 정지된 것을 의미하는 것이다. 또한, 관능평가의 결과, 본 발명품 1 내지 3 중 어느 것에 있어서도, TG에 의한 단단함 부여가 유지되며, TG 단독 첨가보다도 맛이 향상되고 있어 종합적으로 바람직한 식감이 부여되어 있었다. 즉, PG, TG의 병용 효과가 확인되었다.

실시예 5

표 12에 기재한 배합 및 시작(試作) 공정에서 우동 및 중화면을 조제하였다. 트랜스글루타미나제 및 프로테인 글루타미나제는, 가수시에 물에 용해시켰다. 우동 및 중화면에 있어서의 각각의 효소 첨가량을 표 13에 기재하였다. 우동은, 면 100g에 대해 15배량의 끓인 물로 20분간 삶고, 그 후의 식감을 훈련된 패널(n=5)이 평가하였다. 중화면은, 삶기 시간은 5분으로 한 것 이외에는 우동과 같이 평가를 실시하였다. 대조품을 기준으로 하여, 단단함, 점성, 매끈 매끈함의 항목에 관해서 평가하였다(분명히 약해진다: ××, 다소 약해진다: ×, 동등: △, 다소 강해진다: ○, 분명히 강해진다: ◎). 우동, 중화면의 평가 결과는 거의 동일한 경향이었기 때문에 표 14에 정리하여 기재하였다. 우동, 중화면의 어느 것에 있어서도 PG/TG비가 중량비에 있어서, 0.01, 0.05, 0.2(각각 본 발명품 1, 2, 3)일 때에 면의 단단함, 점성, 매끈 매끈함이 균형적으로 부여된 식감이 되었다. 즉, 트랜스글루타미나제와 프로테인 글루타미나제의 양자를 작용시켜 양쪽의 바람직한 효과를 수득하는 적절한 비율인 것이 면류의 예에서도 나타났다.

본 발명에 의하면, 트랜스글루타미나제, 프로테인 글루타미나제 각 효소를 단독으로 사용한 경우와는 상이한 단백질 개질 효과를 수득할 수 있고, 완전히 신규한 특징을 갖는 단백질 식품을 제조할 수 있다. 또한, TG, PG 양 효소가 함께 기질에 작용하는 적절한 조건을 간편하게 밝혀낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 식품 분야에 있어서 매우 유용하다.

또한, 상기한 특허 문헌 등의 각 개시를, 본서에 인용하여 도입하는 것으로 한다. 본 발명의 전체 개시(청구의 범위를 포함)의 범위내에 있어서, 또한 그 기본적 기술 사상에 기초하여, 실시형태 또는 실시예의 변경·조정이 가능하다. 또한, 본 발명의 청구의 범위의 틀내에 있어서 다양한 개시 요소의 다양한 조합 내지 선택이 가능하다. 즉, 본 발명은, 청구의 범위를 포함하는 전체 개시, 기술적 사상에 따라서 당업자라면 이룰 수 있는 각종 변형, 수정을 포함하는 것은 물론이다.

Claims

프로테인 글루타미나제 및 트랜스글루타미나제를 단백질에 작용시켜서 단백질을 개질하는 방법에 있어서, 프로테인 글루타미나제의 단백질로의 첨가 시기가, 트랜스글루타미나제의 첨가 시기와 동시이거나, 또는 트랜스글루타미나제가 당해 단백질에 작용하기 전이고,
상기 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, 활성비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.05 내지 3 : 1이거나, 상기 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, 중량비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.01 내지 0.7 : 1이거나, 상기 단백질에 첨가하는 프로테인 글루타미나제와 트랜스글루타미나제의 첨가량이, NMR 시그널 강도비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1이 되는 조건인 것을 특징으로 하는, 단백질의 개질 방법.
제1항에 있어서, 단백질이 유단백질, 유청 단백질, 대두 단백질, 소맥 글루텐, 플라즈마, 근육 단백질, 콜라겐 및 젤라틴으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 따르는 방법으로 개질된 단백질을 함유하는 식품.
트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, 활성비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.05 내지 3 : 1이거나, 트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, 중량비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.01 내지 0.7 : 1이거나, 트랜스글루타미나제 : 프로테인 글루타미나제의 배합 비율이, NMR 시그널 강도비에 있어서, 프로테인 글루타미나제 : 트랜스글루타미나제 = 0.2 내지 3.0 : 1이 되는 조건인 것을 특징으로 하는 단백질 개질용 효소 제제.
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