CN114403280A - 一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，具体步骤为：(1)使用液氮粉碎机粉碎牡蛎肉；(2)首先使用红外感应式漩涡混匀器处理牡蛎肉与水混合物，然后通过两次离心处理得到牡蛎蛋白；(3)使用电子束辐照辅助牡蛎蛋白酶解，得到牡蛎蛋白酶解液；(4)使用超临界流体微粉化和喷雾干燥装置处理牡蛎蛋白酶解液，得到牡蛎肽纳米颗粒。本发明使用低温液氮粉碎机和红外感应式漩涡混匀器处理牡蛎肉保护原成份不被破坏，提高牡蛎蛋白提取率；使用电子束辐照辅助牡蛎蛋白酶解加速酶促反应进程，使酶促反应进行的更加彻底；最后使用超临界流体微粉化技术提高牡蛎肽得率，制得纳米级的牡蛎肽颗粒。
Description
技术领域
本发明属于食品开发技术领域，具体涉及一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法。
背景技术
我国海域广阔，海洋面积约300万平方公里。牡蛎是我国南北地区乃至世界其他地区优质营养的重要来源，也是我国重要的水产品之一，有“海底牛奶”之称，因其肉质鲜美、营养丰富，受到广大消费者的喜欢。牡蛎具有含高蛋白质，低脂肪，富含多种维生素和矿物质以及味道鲜美的特点。牡蛎是世界范围内重要的水产养殖物种，在生态系统功能中发挥着重要作用。
牡蛎是一种重要的海洋生物，其营养价值非常丰富。含有蛋白质、牛磺酸、生物活性肽、EPA、DHA以及维生素、钙等营养成分，具有增强机体免疫力，降血压、抗肿瘤、保肝利胆等保健功能。因此，近些年来，国内外学者对牡蛎中的功能活性成分进行提取研究开发，为牡蛎在保健功能品和医药领域奠定了基础。研究发现膳食牡蛎提取物能有效降低机制内总胆固醇的含量，还能有效改善卵巢功能障碍，刺激卵泡受体表达，因此，牡蛎在医药领域也受到了相当大的关注。
然而，随着人们在食品方面对营养的意识逐渐增强，包括中国在内，民众对牡蛎肉的需求有所上升。浙江毗邻东海，海域占地面积约为平方公里，有3061座海岛，其中广为人知的舟山群岛拥有舟山第一渔场的称号，有着绝对丰富的海洋生物资源。目前研究证实，我国海洋生物资源深加工能力还相对不足，海洋资源综合利用率低，导致海洋资源产品附加值低，严重影响着我国海洋资源向高水平、高层次、高利用率发展的趋势。现今牡蛎的蛋白质资源利用方式单一，均以直接食用为主要方式，并没有进行深层次的高值化利用，一些已经研发出来的高值附加产品也不足以达到经济健康的标准。
目前制备多肽的方法各种各样，其中包括化学合成法、基因工程法、从一些动植物组织中直接提取法以及酶解法等手段。蛋白质的提取方法又分为多种，主要是盐析法、有机溶剂萃取法、pH调节法和酶水解法，现在研究方案中经常会结合这其中的两种或多种进行蛋白质的提取实验。有机溶剂萃取法提取蛋白质可同时完成样品富集与净化，大大提高检测灵敏度，能够进行大批量的生产试验并且自动化处理，多次操作结果几乎无差异，最重要的特点是能够大大节省了溶剂量；不足之处就在于使用的那些固态萃取的小柱成本较高，需要专业人员协助进行方法开发。
牡蛎肉使用传统的打浆机得到的颗粒偏大，不仅降低了牡蛎蛋白的得率，而且大颗粒的牡蛎蛋白为酶解反应的进行造成了阻碍，降低了小分子牡蛎肽的得率。低温液氮粉碎法使用冷媒与物料进行热交换，使物料达到脆化状态，脆化以后的物料在粉碎腔中通过粉碎结构进行无数次的撞击、剪切、摩擦，最后形成细小颗粒状，粉碎后的物料精细度可达微米级600-2000目。此项技术目前还没有应用于牡蛎肉的处理。
超临界流体微粉化制备技术是利用改变压力来调节体系的过饱和度和过饱和速率，从而使溶质从超临界溶液中结晶或沉积出来。整个过程在准均匀介质中进行，能够准确地控制结晶过程，因此可以获得平均粒径很小的细微粒子，而且还可控制其粒度尺寸的分布(PSD)。超临界流体微粉化制备方法主要有超临界溶液快速膨胀(RESS)技术和超临界流体抗溶剂(SAS)技术。药物微粉化具有颗粒小、表面反应活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力强等多个特点，使得微粉化的药物有众多优势，其中以纳米颗粒的应用最为广泛，包括纳米脂质体、纳米微球、聚合物胶束等。目前超临界流体微粉化制备技术常用于微粉化药品的制备中，对于小分子肽的提取尚未涉及。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法。该方法首先用低温液氮粉碎牡蛎肉保护原成份不被破坏，然后用红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白提高蛋白提取率，接着用电子束辐照辅助牡蛎蛋白酶解加速酶促反应进程，使酶促反应进行的更加彻底，最后用超临界流体微粉化技术制备得到牡蛎肽纳米颗粒。
本发明为了实现上述目的采用的技术方案是：
一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎；
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3-10与水混合，使牡蛎液的pH为7-12，温度为25-60℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，除去沉淀将上清液pH调至3.5-6，静置10-60min后，再次进行离心处理，得到的沉淀即为牡蛎蛋白；
(3)电子束辐照辅助牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5-15与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液；
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的牡蛎蛋白酶解液放入超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒。
优选的，步骤(1)中所述液氮粉碎机，粉碎温度为-80℃到-200℃，转速为3000-6000rpm，粉碎时间10-60min。
优选的，步骤(2)中所述的红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白的处理条件为转速1000-3000rpm，处理时间1-10min。
优选的，步骤(2)中将涡旋后的牡蛎液进行离心处理的转速为5000-10000rpm，离心时间10-60min。
优选的，步骤(2)中静置10-60min后再次进行离心处理的转速为5000-10000rpm，离心时间10-60min。
优选的，步骤(3)中所述的酶解反应条件为：pH为6-11，温度为35-60℃，每种酶的添加量为0.01-0.5％，酶解时间1-6h。
优选的，步骤(3)中所述高能电子加速器通过电子束为4-20MeV，辐射剂量为5-75kGy，辐照时间10-60min，生产厂家为中国无锡艾邦辐射科技。
优选的，步骤(4)中所述超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒的条件为：萃取剂为CO2，流量为10-100L/h，压力为75-500bar，温度为80-200℃，萃取时间10-120min。
优选的，步骤(2)中所述红外感应式漩涡混匀器采用VELP品牌TX4型。
优选的，步骤(4)中所述超临界流体微粉化和喷雾干燥装置采用瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明所使用的低温液氮粉碎机，可以解决牡蛎粉碎目数太大的问题，直接将牡蛎肉粉碎为目数极小的粉末状，可以得到微米级的牡蛎肉，使更多的牡蛎蛋白被提取出来，且原成份不会破坏，微米级大小的牡蛎蛋白也可使牡蛎蛋白的酶解进行的更加彻底。
(2)本发明使用红外感应式漩涡混匀器进行牡蛎蛋白的提取，无需施加外在压力，就可使牡蛎肉与水快速、彻底的进行混合，相较于传统的磁力搅拌器处理，涡旋仪处理效率可增加几百倍，使牡蛎蛋白在短时间内就可大量提取到水中，减少了牡蛎蛋白的提取时间，大幅度提高牡蛎蛋白提取率。
(3)本发明利用电子束辐照技术辅助酶处理牡蛎蛋白，不仅可以对酶进行改性修饰，同时可以修饰牡蛎蛋白结构，改善牡蛎蛋白的物理化学性质，电子束辐照会加速各物质之间的相互碰撞，加速底物与酶的结合，进而加速了酶促反应进程，使酶促反应进行的更加彻底。另外，由于牡蛎作为海产品，所含有的微生物较多，使用电子束辐照还可以对牡蛎蛋白起到杀菌的作用。
(4)本发明利用蛋白谷氨酰胺酶酶解牡蛎蛋白，通过脱酰胺反应将谷氨酰胺转化为谷氨酸，可以对蛋白酶及牡蛎蛋白起到改性处理，不仅可以提高牡蛎蛋白溶解度，还可以对碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶进行改性修饰，从而提高其酶活，改善酶促反应进程。
(5)本发明使用的瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置可用于药物微粉化和喷雾干燥等多种方面；可以实现超临界流体的多个过程，包括超临界流体萃取、超临界溶液的快速膨胀(RESS)以及超临界流体抗溶剂(SAS)。
采用高压进行下的微粉化其原理是通过高压流体的膨胀来产生非常细小、均有且有确定几何形状的固体颗粒。运用此装置对牡蛎肽的酶解液进行处理，在设备运行的过程中，高压处理会切断酶解后一些不稳定的肽链和一些小分子蛋白，从而可以提高牡蛎肽得率，还可以获得更多分子量更小的牡蛎肽，得到的牡蛎肽粉大小可以达到纳米级别，使牡蛎肽粉的应用范围更广，功能特性更加完善。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-80℃，转速6000rpm，粉碎时间60min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:10与水混合，使牡蛎液的pH为12，温度为25℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速1000rpm，处理10min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为10000rpm，离心10min，除去沉淀将上清液pH调至3.5；静置10min后，再次进行离心处理，转速为10000rpm，离心10min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:15与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 11，温度60℃的范围，每种酶的添加量为0.01％，酶解6h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为4MeV，辐射剂量为5kGy，辐照时间为60min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为10L/h，压力为75bar，温度为80℃，萃取时间为120min。
实施例2：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-100℃，转速5500rpm，粉碎时间50min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:9与水混合，使牡蛎液的pH为11，温度为30℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速1500rpm，处理8min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为9000rpm，离心20min，除去沉淀将上清液pH调至4；静置20min后，再次进行离心处理，转速为9000rpm，离心20min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:13与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 10，温度55℃的范围，每种酶的添加量为0.1％，酶解5h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为8MeV，辐射剂量为20kGy，辐照时间为50min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为25L/h，压力为135bar，温度为100℃，萃取时间为100min。
实施例3：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-120℃，转速5000rpm，粉碎时间40min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3与水混合，使牡蛎液的pH为10，温度为35℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速2000rpm，处理6min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为8000rpm，离心30min，除去沉淀将上清液pH调至4.5；静置30min后，再次进行离心处理，转速为8000rpm，离心30min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:11与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 9，温度50℃的范围，每种酶的添加量为0.2％，酶解4h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为10MeV，辐射剂量为35kGy，辐照时间为40min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为40L/h，压力为200bar，温度为120℃，萃取时间为80min。
实施例4：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-140℃，转速4500rpm，粉碎时间30min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3与水混合，使牡蛎液的pH为9，温度为40℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速2300rpm，处理4min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为7000rpm，离心40min，除去沉淀将上清液pH调至5；静置40min后，再次进行离心处理，转速为7000rpm，离心40min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:9与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 8，温度45℃的范围，每种酶的添加量为0.3％，酶解3h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为13MeV，辐射剂量为45kGy，辐照时间为10min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为55L/h，压力为300bar，温度为140℃，萃取时间为60min。
实施例5：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-160℃，转速4000rpm，粉碎时间20min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3与水混合，使牡蛎液的pH为8，温度为50℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速2500rpm，处理2min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为6000rpm，离心50min，除去沉淀将上清液pH调至5；静置50min后，再次进行离心处理，转速为6000rpm，离心50min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:8与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 7，温度40℃的范围，每种酶的添加量为0.4％，酶解2h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为17MeV，辐射剂量为60kGy，辐照时间为10min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为80L/h，压力为400bar，温度为160℃，萃取时间为40min。
实施例6：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎，粉碎温度为-200℃，转速3000rpm，粉碎时间10min。
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：取步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3与水混合，使牡蛎液的pH为7，温度为60℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，转速3000rpm，处理1min；随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，转速为5000rpm，离心60min，除去沉淀将上清液pH调至5；静置60min后，再次进行离心处理，转速为5000rpm，离心60min，得到的沉淀即为牡蛎蛋白。
(3)牡蛎蛋白的酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，酶解条件为pH 6，温度35℃的范围，每种酶的添加量为0.5％，酶解1h；在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液，高能电子加速器通过的电子束为20MeV，辐射剂量为75kGy，辐照时间为10min。
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的酶解液放入瑞士SITEC多用途超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒，制备条件为：萃取剂为CO2，流量为100L/h，压力为500bar，温度为200℃，萃取时间为10min。
测试例：
测定了实施例制备的牡蛎肽的溶解度、肽含量、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率。
具体测定方法如下，测定结果如表1所示。
(1)溶解度的测定：称取100mg样品分散于10ml，pH 7.5，0.05mol/L的磷酸缓冲溶液中，磁力搅拌30min后离心(20℃，12000×g，20min)。上清液经适度稀释，采用Lowry法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准物，绘制标准曲线。溶解度定义为上清液蛋白质量浓度占总蛋白质量浓度的百分比。
(2)
(3)DPPH自由基消除率：取1.00mL 1％的大豆寡聚活性肽水溶液，加入4.00mL的100μmol/L DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30min，以原溶剂调零，在517nm处测定吸光度记为Ai；同法取1.00mL溶剂加入4.00mL DPPH溶液混匀，测定吸光度记为Ac；取1.00mL水解物加入4.00mL的溶剂混匀，测定吸光度记为Aj。DPPH自由基清除率计算公式为：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％。
(4)ABTS自由基清除率：ABTS储备液配制：取1.72mg过硫酸钾和10mgABTS溶于2.6ml、pH＝7.4PBS缓冲液中，在室温下避光静置12～16h后，用pH＝7.4PBS缓冲液稀释，使其在酶标仪734nm下吸光度值为0.7±0.02，得ABTS工作液(现用现配)。实验分为空白组、对照组和样品组三组。
空白组Ab：每孔加入200μL PBS缓冲液；
对照组AC：每孔加20μL PBS和180μL ABTS工作液；
实验组AS：每孔加20μL样品溶液和180μL ABTS工作液，放置于振荡器振荡10s，室温条件下避光反应5min，用酶标仪测定其在734nm处的吸光度值。ABTS自由基清除率计算公式如下：
ABTS自由基清除率(％)＝(AC-AS)/(AC-Ab)×100％
(5)羟基自由基(.OH)清除率：采用D-脱氧核糖-Fe体系法。吸取0.1mL 1％的大豆寡聚活性肽水溶液，移入试管中，加0.1mL 1.04mmol/L EDTA溶液、0.1mL1 mmol/L FeCl3溶液、0.1mL2 mmol/L Vc溶液、0.1mL10 mmol/L H2O2溶液、0.1mL60 mmol/L DR溶液和0.4mLpH 7.5KH2PO4-NaOH缓冲溶液。37℃水浴1h，加1mL 25％HCl溶液终止反应，加1mL 1％硫代巴比妥酸(TBA)溶液，100℃水浴15min，冷却后有沉淀，加入1mL正丁醇萃取颜色，然后于532nm波长处测定吸光值。以空白作参比，按下式计算。
羟基自由基清除率(％)＝[(A0－(A1－A2)/A0]×100％
式中：A0－不加样品的空白吸光度；
A1－加入样品和2-脱氧-D-核糖的吸光度；
A2－样品在体系中吸光度(不加DR)
(6)菌落总数参照GB 4789.2-2016进行测定。
表1(单位：％)
由表1可以得出，实施例3最佳，制备的牡蛎肽的溶解度、肽含量占比、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率、菌落总数去除的效果最优。
对比例：
在实施例3的基础上，设置对比例：
对比例1：省去液氮粉碎机，改用破壁机处理牡蛎肉，其他加工工艺与实施例3相同。
对比例2：省去红外涡旋仪，改用磁力搅拌机，其他加工工艺与实施例3相同。
对比例3：省去高能电子加速器，改用磁力搅拌机，其他加工工艺与实施例3相同。
对比例4：省去蛋白谷氨酰胺酶，其他加工工艺与实施例3相同。
对比例5：省去超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒，改用喷雾干燥机，其他加工工艺与实施例3相同。
测定了对比例制备的牡蛎肽的溶解度、肽含量、DPPH自由基消除率、ABTS自由基清除率、羟基自由基清除率。
具体测定方法与测试例相同，测定结果如表2所示。
表2(单位：％)
由表2可以得出，省略本技术方案中某些制备工艺将使得到的产品性能显著下降。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)液氮粉碎机粉碎牡蛎肉：从新鲜牡蛎中收集牡蛎肉，用去离子水清洗干净，切碎后使用液氮粉碎机进行粉碎；
(2)红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白：将步骤(1)处理后的牡蛎肉按照料液比1:3-10与水混合，使牡蛎液的pH为7-12，温度为25-60℃，然后使用红外感应式漩涡混匀器进行处理，随后将涡旋后的牡蛎液进行离心处理，除去沉淀将上清液pH调至3.5-5，静置10-60min后，再次进行离心处理，得到的沉淀即为牡蛎蛋白；
(3)电子束辐照辅助牡蛎蛋白酶解：将步骤(2)得到的牡蛎蛋白按照料液比1:5-15与去离子水混合，然后依次加入碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白谷氨酰胺酶进行酶解，在酶解过程中使用高能电子加速器进行电子束辐照，得到牡蛎蛋白酶解液；
(4)超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒：将步骤(3)获得的牡蛎蛋白酶解液放入超临界流体微粉化和喷雾干燥装置中制备牡蛎肽纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述液氮粉碎机，粉碎温度为-80℃到-200℃，转速为3000-6000rpm，粉碎时间10-60min。
3.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的红外感应式漩涡混匀器提取牡蛎蛋白的处理条件为转速1000-3000rpm，处理时间1-10min。
4.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将涡旋后的牡蛎液进行离心处理的转速为5000-10000rpm，离心时间10-60min。
5.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中静置10-60min后再次进行离心处理的转速为5000-10000rpm，离心时间10-60min。
6.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酶解反应条件为：pH为6-11，温度为35-60℃，每种酶的添加量为0.01-0.5％，酶解时间1-6h。
7.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述高能电子加速器通过电子束为4-20MeV，辐射剂量为5-75kGy，辐照时间10-60min。
8.根据权利要求1所述的一种具有多种功能的纳米级牡蛎肽粉的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述超临界流体微粉化技术制备牡蛎肽纳米颗粒的条件为：萃取剂为CO2，流量为10-100L/h，压力为75-500bar，温度为80-200℃，萃取时间10-120min。
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