CN105010720A

CN105010720A - 一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法

Info

Publication number: CN105010720A
Application number: CN201510440288.9A
Authority: CN
Inventors: 杨涛; 赵贵川; 李艳; 黄慧芬
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Hunan Nanzhou Liquor Co.,Ltd.
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: CN105010720B

Abstract

一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：（1）米渣预处理得米渣粉；（2）提取米渣蛋白：将米渣粉与水混合，调节pH值至11～13，搅拌反应，离心收集上清液，调节上清液pH值至5.0～5.8，沉淀，离心，洗涤，得米渣蛋白；（3）超高压处理：将米渣蛋白在超高压下处理，冷冻干燥，得超高压米渣蛋白粉；（4）酶解：将超高压米渣蛋白粉配制成水溶液，酶解，灭酶，离心，收集上清液；（5）将上清液真空浓缩至浓缩液；（6）冷冻干燥，得高抗氧化活性肽。本发明方法所得产品具有较高抗氧化活性，与未经超高压处理所得产品相比，对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的清除率均大大提高。

Description

一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法

技术领域

本发明涉及一种制备抗氧化肽的方法，具体涉及一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法。

背景技术

稻谷是世界上最重要的粮食之一，中国是有名的产粮大国，粮食产量中85%以上是稻谷，仅湖南省粮食的商业库存每年在430～660万吨之间。一部分粮食需要用于淀粉糖工业生产，但会产生大量的副产物米渣，而米渣中蛋白质含量高达40～70%。大米蛋白的品质是公认的谷类蛋白中的上佳者，大米蛋白的营养价值高于小麦蛋白质，大米蛋白中的第一限制性氨基酸——赖氨酸的含量高于其它谷类，且氨基酸含量较为合理，与其它谷类蛋白相比，生物价和蛋白质效用比率更高。另外，大米蛋白的低过敏性使之非常适合作为婴儿或是特殊人群的食品。因此，研究稻米深加工副产物——米渣蛋白的再加工技术具有重要意义。

CN101748182B公开了一种米蛋白抗氧化肽的制备方法，其技术方案是将米渣过筛后用水浸泡，然后使用胶体磨将其磨碎再进行酶解，最终制备米蛋白抗氧化活性肽，但是，使用胶体磨会产生很多泡沫，影响实验准确性，并且碱性蛋白酶水解程度效果不佳。CN 103468777 B公开了一种发芽糙米抗氧化肽的提取方法，其包括糙米浑浊液制备、中性蛋白酶水解、灭酶、离心分离、真空浓缩、冷冻干燥等步骤，但是，其在糙米浑浊液制备的过程中，仅仅使用高速组织捣碎机进行捣碎，这样的操作只是把发芽糙米打碎，并没有破坏其结构，所以酶解的时候效率较差。

超高压技术是目前国际上最热门的食品加工技术之一，超高压处理在食品蛋白加工中可通过改变蛋白的结构，改变蛋白质的溶解性、凝胶性、乳化性、起泡性等诸多加工特性；还可以通过改变蛋白质的酶解特性以产生多种活性肽；并且超高压处理传压速度比较快、均匀，不存在梯度压力，另外，超高压技术相对耗能比较少。CN103540637A公开了一种高压处理和酶解制备高纯度大米蛋白肽的方法，其技术方案是米渣预处理、高压均质、超声、酶解、脱色、分离、干燥，但是，其使用的最高压力为80MPa，研究表明，这样的压力并不能完全破环蛋白质基本结构，不能让蛋白质更好的酶解。CN103283934A公开了一种高纯度大米蛋白的制备方法，其米渣蛋白提取方案是酶法提取，然后再进行高压处理，但是，酶法提取会产生较多的杂质，这样制得的产品，杂质含量较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种能提高米渣蛋白的酶解效率和抗氧化活性，所得高抗氧化活性肽清除自由基效果好，且处理过程不破坏营养成分，产品纯度高，操作简单的利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，包括以下步骤：

（1）米渣预处理：将米渣磨碎，过60～100目筛，得米渣粉；

（2）提取米渣蛋白：将步骤（1）所得米渣粉与水以质量比1:6～10混合，调节混合液pH值至11～13，恒温搅拌反应3～5h，然后离心，收集上清液，调节上清液pH值至5.0～5.8，静置沉淀，离心，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白；

（3）超高压处理：将步骤（2）所得米渣蛋白在300～500MPa（优选350～450MPa，进一步优选400 MPa）压力下，处理5～15min（优选8～12min），冷冻干燥，得超高压米渣蛋白粉；

（4）酶解：将步骤（3）所得超高压米渣蛋白粉配制成3～5wt%的水溶液，加入4000～8000U中性蛋白酶/g超高压米渣蛋白粉，酶解2～3h，灭酶，离心收集上清液；

（5）真空浓缩：将步骤（4）所得上清液真空浓缩至固形物质量分数为50～70wt%的浓缩液；

（6）冷冻干燥：将步骤（5）所得浓缩液进行冷冻干燥，即得高抗氧化活性肽。

步骤（2）中，用氢氧化钠调节混合液pH值至11～13，用盐酸调节混合液pH值至5.0～5.8，碱液和酸液的浓度均为1.0mol/L。

步骤（2）中，由于米渣蛋白中80%为碱溶性蛋白质，所以需要先让蛋白质溶于碱液，再加酸调节pH值使蛋白质沉淀，pH值不宜过高，否则会破环蛋白质结构，酸性条件下蛋白质凝聚从而沉淀，在等电点的时候沉淀达到最大值，所以依据米渣蛋白的等电点确定最佳酸沉pH值。

进一步，步骤（2）中，所述搅拌反应的温度为30～50℃，搅拌反应的转速为500～900r/min。

进一步，步骤（2）中，所述离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为10～20min。

进一步，步骤（2）中，所述静置沉淀的时间为1～3h。

步骤（3）中，所述超高压处理的温度为室温，本发明超高压设备的升压和降压过程均可在1min内完成。超高压处理对蛋白质的改性作用主要体现在以下两个方面：（1）对蛋白质结构的影响：超高压处理主要是破坏蛋白质的三级、四级结构的非共价键，而对共价键作用较小，不同超高压力处理对蛋白质结构的影响不同，一般在100～200MPa下，蛋白质变化是可逆的，但当压力超过300MPa时，蛋白质会发生氢键断裂，产生不可逆变性而改变蛋白质的三级结构，另外，因为超高压只能破坏蛋白质的大分子结构，而肽是小分子，超高压对它的作用很小，所以，本发明是先对米渣蛋白进行超高压再酶解，而不是对酶解后的肽进行超高压，如果是先酶解再超高压，就都达不到提高抗氧化力的效果；（2）对蛋白质酶解的影响：超高压处理能影响蛋白质的结构和性质，从而也影响到酶对蛋白质的催化特性，超高压处理对蛋白的影响主要是在于蛋白三级、四级结构的非共价键，蛋白经超高压处理后结构伸展而变得松散，从而暴露出更多位点，易于酶解反应进行，提高酶解效率。所以，本发明方法采用先将米渣蛋白进行超高压处理，再进行酶解反应。

步骤（4）中，由于底物浓度过高会抑制酶的活性，所以酶解时，选择超高压米渣蛋白粉的水溶液浓度为3～5wt%。

进一步，步骤（4）中，所述中性蛋白酶的酶活为40000～60000U/g。因不同蛋白酶的底物特异性及作用位点的差异，不同蛋白酶作用于大米蛋白的水解程度不同，而且不同蛋白酶水解得到的酶解产物的功能性质也将有所不同，中性蛋白酶具有作用条件温和，作用于大米蛋白水解度高，酶解产物抗氧化活性高的优点。因此，最终确定中性蛋白酶为酶解米渣蛋白的合适酶源。

进一步，步骤（4）中，所述酶解的pH值为7，温度为40～50℃。

进一步，步骤（4）中，所述灭酶的温度为75～95℃，时间为8～15min。

进一步，步骤（4）中，所述离心的转速为4000～6000r/min ，离心的时间为10～20min。

进一步，步骤（5）中，所述真空浓缩的真空度为0.08～0.10MPa，温度为45～50℃。

进一步，步骤（3）、（6）中，所述冷冻干燥是指在真空度10～30MPa，温度-20～-40℃下，冷冻干燥24～48h至水分含量为5～10%。

本发明方法利用超高压技术处理所得米渣蛋白，与未经超高压处理的进行对比，其DPPH自由基清除率由20～45%提升到50～60%，ABTS自由基清除率由50～60%提升到80～95%，羟基自由基清除率由3～7%提升到4～12%，说明超高压所得的米渣蛋白酶解液的抗氧化活性远大于未经高压处理的；而超声处理所得米渣蛋白，其DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基清除率分别为30～50%，60～75%，3～8%，说明超高压所得的米渣蛋白酶解液的抗氧化活性相对于经过超声处理的具有明显的提高；另外，本发明方法不会破坏米渣的营养成分，所得高抗氧化活性肽产品呈乳白色，不含糖分等杂质。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的中性蛋白酶，酶活50000U/g，生产厂家为鸿鹰祥生物工程股份有限公司；其它所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

实施例1

（1）米渣预处理：将500g米渣磨碎，过80目筛，得米渣粉；

（2）提取米渣蛋白：将步骤（1）所得米渣粉与4L水混合，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节混合液pH值至12，在温度40℃，转速700r/min下，恒温搅拌反应4h，然后4000r/min离心15min，收集上清液，用1.0mol/L的盐酸溶液调节上清液pH值至5.4，静置沉淀2h，4000r/min离心15min，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白；

（3）超高压处理：将步骤（2）所得米渣蛋白用双层聚氯乙烯袋包装，密封，在400MPa压力下，处理10min，在真空度20MPa，温度-30℃下，冷冻干燥36h至粉末状，得超高压米渣蛋白粉，干燥后产品水分含量为8%；

（4）酶解：将步骤（3）所得超高压米渣蛋白粉配制成4wt%的水溶液，加入6000U中性蛋白酶/g超高压米渣蛋白粉，在pH值为7，温度45℃下，酶解2.5h，85℃灭酶10min，5000r/min离心15min，收集上清液；

（5）真空浓缩：将步骤（4）所得上清液在真空度0.09MPa，温度47℃下，进行真空浓缩，至固形物质量分数为60wt%的浓缩液；

（6）冷冻干燥：将步骤（5）所得浓缩液在真空度20MPa，温度-30℃下，冷冻干燥36h至粉末状，即得高抗氧化活性肽，干燥后产品水分含量为8%。

所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等杂质。

实施例2

（1）米渣预处理：将500g米渣磨碎，过60目筛，得米渣粉；

（2）提取米渣蛋白：将步骤（1）所得米渣粉与3L水混合，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节混合液pH值至11，在温度30℃，转速500r/min下，恒温搅拌反应3h，然后3000r/min离心10min，收集上清液，用1.0mol/L的盐酸溶液调节上清液pH值至5.0，静置沉淀1h，3000r/min离心10min，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白；

（3）超高压处理：将步骤（2）所得米渣蛋白用双层聚氯乙烯袋包装，密封，在300MPa压力下，处理5min，在真空度10MPa，温度-20℃下，冷冻干燥24h至粉末状，得超高压米渣蛋白粉，干燥后产品水分含量为5%；

（4）酶解：将步骤（3）所得超高压米渣蛋白粉配制成3wt%的水溶液，加入4000U中性蛋白酶/g超高压米渣蛋白粉，在pH值为7，温度40℃下，酶解2h，75℃灭酶8min，4000r/min离心10min，收集上清液；

（5）真空浓缩：将步骤（4）所得上清液在真空度0.08MPa，温度45℃下，进行真空浓缩，至固形物质量分数为50wt%的浓缩液；

（6）冷冻干燥：将步骤（5）所得浓缩液在真空度10MPa，温度-30℃下，冷冻干燥24h至粉末状，即得高抗氧化活性肽，干燥后产品水分含量为5%。

所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等杂质。

实施例3

（1）米渣预处理：将500g米渣磨碎，过100目筛，得米渣粉；

（2）提取米渣蛋白：将步骤（1）所得米渣粉与5L水混合，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节混合液pH值至13，在温度50℃，转速900r/min下，恒温搅拌反应5h，然后5000r/min离心20min，收集上清液，用1.0mol/L的盐酸溶液调节上清液pH值至5.8，静置沉淀3h，5000r/min离心20min，弃去上清液，采用去离子水洗涤沉淀至中性，沉淀即为米渣蛋白；

（3）超高压处理：将步骤（2）所得米渣蛋白用双层聚氯乙烯袋包装，密封，在500MPa压力下，处理15min，在真空度30MPa，温度-40℃下，冷冻干燥48h至粉末状，得超高压米渣蛋白粉，干燥后产品水分含量为10%；

（4）酶解：将步骤（3）所得超高压米渣蛋白粉配制成5wt%的水溶液，加入8000U中性蛋白酶/g超高压米渣蛋白粉，在pH值为7，温度50℃下，酶解3h，95℃灭酶15min，6000r/min离心20min，收集上清液；

（5）真空浓缩：将步骤（4）所得上清液在真空度0.10MPa，温度50℃下，进行真空浓缩，至固形物质量分数为70wt%的浓缩液；

（6）冷冻干燥：将步骤（5）所得浓缩液在真空度30MPa，温度-40℃下，冷冻干燥48h至粉末状，即得高抗氧化活性肽，干燥后产品水分含量为10%。

所得高抗氧化活性肽呈乳白色，表明不含糖分等杂质。

对比例1

本对比例技术方案同实施例1，其区别仅在于，将步骤（3）替换为：将步骤（2）所得米渣蛋白在超声波清洗机中，以超声频率 20kHz进行超声处理30min，在真空度20MPa，温度-30℃下，冷冻干燥36h至粉末状，得超声米渣蛋白粉，干燥后产品水分含量为8%；步骤（4）中酶解的对象为超声米渣蛋白粉。

对比例2

本对比例技术方案同实施例1，其区别仅在于，去掉步骤（3），直接将步骤（2）所得米渣蛋白进行酶解。

将实施例1～3和对比例1、2所得高抗氧化活性肽进行活性评价，评价方法如下：

高抗氧化活性肽的抗氧化活性评价方法：

（1）DPPH自由基清除能力测定：

将干燥的高抗氧化活性肽分别溶解在4mL蒸馏水中，制得浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液；在4mL蒸馏水和上述各浓度高抗氧化活性肽溶液样品中分别添加1mL浓度40μmol/L的DPPH自由基的乙醇溶液，25℃下静置30min，于517nm处分别测定吸收值A_空白和A_样品，DPPH自由基清除能力的计算公式为：DPPH自由基清除能力（%）=（1-A_样品/A_空白）×100，检测结果如表1所示：

表1 不同浓度的实施例1～3和对比例1、2高抗氧化活性肽产品对DPPH自由基的清除率

（2）ABTS自由基清除能力测定：

将干燥的高抗氧化活性肽分别溶解在4mL蒸馏水中，制得浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液，将ABTS反应液用PBS缓冲液稀释，使其在734nm处的吸光值为0.700，制成ABTS测定液，取4mLABTS测定液，加入40μL样品，在734nm处多次测其吸光值，取平均值A，ABTS清除率的计算公式为：ABTS清除率（%）=（1-A/0.700）×100，检测结果如表2所示：

表2 不同浓度的实施例1～3和对比例1、2高抗氧化活性肽产品对ABTS自由基的清除率

（3）羟自由基的清除能力测定：

将干燥的高抗氧化活性肽分别溶解在4mL蒸馏水中，制得浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL和4 mg/mL的高抗氧化活性肽溶液；通过Fenton 反应测高抗氧化活性肽清除·OH 的能力：取1mL 浓度5mmol/L 的邻二氮菲乙醇溶液于试管中依次加入2mL pH7.40 的0.2mol/L 磷酸缓冲溶液和1mL 高抗氧化活性肽溶液充分混匀后，加入1mL 5mmol/L 硫酸亚铁溶液，混匀后加入1mL 双氧水，于 37℃水浴 60min 后，在波长 536nm处测其吸光度（A_损）。未损伤管以 1mL 蒸馏水代替损伤管中1mL 0.1% 的双氧水，样品管以1mL 样品溶液代替损伤管中的 1 mL 样品溶剂，其他同损伤管，测得未损伤管的吸光度（A_未）及样品管的吸光度（A_样），·O H清除率的计算公式为：·O H清除率（%）=（A_样-A_损）/（A_未-A_损）×100，检测结果如表3所示：

表3 不同浓度的实施例1～3和对比例1、2高抗氧化活性肽产品对羟基自由基的清除率

对DPPH自由基、ABTS自由基或羟基自由基的清除率越高，表明抗氧化能力越强，说明原料处理方式对米渣蛋白结构的破环更强，才导致在酶解时释放出更多的小肽分子，而小肽分子恰好是自由基清除的有效作用成分。由于超声波的空化作用，使得蛋白质内部活性部位暴露出来，有利于底物更好地与酶结合，但超声功率过大时，蛋白质的结构被破坏程度加大，且超声对蛋白质化学键的断裂缺乏选择性，有可能造成米渣蛋白中具有抑制抗氧化活性的多肽片段被断开，从而影响酶解液的抗氧化活性。由表1～3可知，米渣蛋白用超声处理后的酶解液抗氧化活性优于常规酶解；而超高压对食品中生物大分子的作用主要是由于压力所产生的体积变化，与物质组分在结构上产生差异而导致在超高压下压缩变形不同，当这一变形足够大时，可能会影响物质分子间结合形式，导致键的破坏和重组，从而使食品中的生物大分子功能特性发生变化，许多经高静压变性的蛋白质在压力撤消后，分子构象会有所改变，并随之带来功能特性的改善，由表1～3可知，超高压所得的米渣蛋白酶解液的抗氧化活性远大于超声处理。

Claims

1.一种利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）米渣预处理：将米渣磨碎，过60～100目筛，得米渣粉；

（3）超高压处理：将步骤（2）所得米渣蛋白在300～500MPa压力下，处理5～15min，冷冻干燥，得超高压米渣蛋白粉；

2.根据权利要求1所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述搅拌反应的温度为30～50℃，搅拌反应的转速为500～900r/min。

3.根据权利要求1或2所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心的转速为3000～5000r/min，离心的时间为10～20min。

4.根据权利要求1～3之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述静置沉淀的时间为1～3h。

5.根据权利要求1～4之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述中性蛋白酶的酶活为40000～60000U/g。

6.根据权利要求1～5之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述酶解的pH值为7，温度为40～50℃。

7.根据权利要求1～6之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述灭酶的温度为75～95℃，时间为8～15min。

8.根据权利要求1～7之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述离心的转速为4000～6000r/min，离心的时间为10～20min。

9.根据权利要求1～8之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述真空浓缩的真空度为0.08～0.10MPa，温度为45～50℃。

10.根据权利要求1～9之一所述利用超高压处理米渣蛋白制备高抗氧化活性肽的方法，其特征在于：步骤（3）、（6）中，所述冷冻干燥是指在真空度10～30MPa，温度-20～-40℃下，冷冻干燥24～48h至水分含量为5～10%。