CN106831938B

CN106831938B - 一种制备阿胶小分子低肽的方法

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Publication number: CN106831938B
Application number: CN201710144390.3A
Authority: CN
Inventors: 张凡; 黄艳红; 王莹莹; 卢敏
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Dongru donkey hide gelatin pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: CN106831938A

Abstract

本发明公开了一种制备阿胶小分子低肽的方法，包括以下步骤：（1）将阿胶溶解，配置成设定浓度的阿胶水溶液；（2）加酸高压水解：将步骤（1）中的阿胶溶液与草酸混合，调节pH至1.5~2.5，高压酸性水解；（3）回调pH：调节高压水解后的产物的pH至3.5~4.5；（4）脱色和除杂：加入活性炭进行脱色和除杂，然后去除活性炭，即得阿胶小分子低肽。本发明采用有机酸来制成酸性环境，草酸是一种弱酸，能够充分打破阿胶蛋白质之间的肽键，将其分解为小分子低肽；采用高压蒸煮的方法则是快速将蛋白质变性，将肽键断裂。本发明采用两者相结合的方法，有利于得到分子量较小和均匀的小分子低肽。小分子量低肽可以被人体很好的吸收和利用。

Description

一种制备阿胶小分子低肽的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种制备阿胶小分子低肽的方法。

背景技术

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水形成的共价键被称为肽键，两个或两个以上氨基酸通过肽键相互连接形成的生物活性分子叫做肽，肽链经过折叠修饰形成蛋白质。其中，由2～4个氨基酸组成的寡肽被称为小分子低肽或小肽。

研究证明阿胶中的蛋白质含量约为60～80％左右，主要是胶原蛋白及其降解后的多肽类物质。阿胶对人体健康大有裨益，然而人体不能直接吸收大分子的蛋白质，需要经过人体内的蛋白酶水解成小分子低肽才能被吸收。而对于消化系统功能薄弱的人群来说，服用阿胶后需要大量的蛋白酶参与水解从而加重了消化系统的负担，严重影响了阿胶有效成分的吸收，导致无法发挥疗效，甚至还会加重病情。因此，将阿胶中的蛋白质大分子裂解为小分子肽，则有助于帮助人体快速吸收，发挥阿胶的最大营养滋补疗效。在蛋白质水解的方法中，有酸水解法、碱水解法以及现代的生物酶解法和真空干燥法。目前，针对胶原蛋白水解主要是生物酶解工艺，酶解法是利用酶的作用将动植物细胞壁或细胞膜或对某些成分水解或降解，使有效成分充分地暴露出来，溶解、混悬、胶溶于溶剂中，以提高活性成分的提取率。生物酶解工艺已普遍应用于水解蛋白质、多糖、脂肪、纤维素等多个领域。例如，(1)一种制备阿胶小分子低肽的复合酶水解法：胶原蛋白酶解产物采用由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶进行了胶原小分子肽酶解研究；最佳酶解条件为：pH值为9.5，温度为50℃，时间为3h，其存在的缺点是：生物酶解法水解阿胶中的大分子蛋白反应时间较久、对反应所需要的设备要求较高，胶原蛋白酶解产物分子量分布较广，分子质量较大，酶解产物中大分子胶原肽含量高，导致活性较低。(2)一种制备阿胶小分子低肽的真空干燥法：阿胶丁放置到真空器中，待真空度达到0.06mPa时，打开夹层蒸气阀，加热使蒸气压保持在0.1MPa干燥，见胶珠鼓起成球状后打开真空阀；其存在的缺点是：真空环境难以制造，并且小分子肽的分子量分布不均匀。目前采用酸性高压水解的方法还未在阿胶产业中使用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种制备阿胶小分子低肽的方法，该方法采用有机酸来制成酸性环境，利用高压蒸煮将阿胶原料水解，解决了阿胶胶原蛋白难水解，酶解产物分子量不集中等问题。

本发明采用的技术方案是：

一种制备阿胶小分子低肽的方法，包括以下步骤：

(1)将阿胶溶解，配置成设定浓度的阿胶水溶液；

(2)加酸高压水解：将步骤(1)中的阿胶溶液与草酸混合，调节pH至1.5～2.5，高压酸性水解；

(3)回调pH：调节高压水解后的产物的pH至3.5～4.5；

(4)脱色和除杂：加入活性炭进行脱色和除杂，然后去除活性炭，即得阿胶小分子低肽。

步骤(1)中，所述阿胶可以为纯阿胶或各种商业途径得到的阿胶，所述纯阿胶的制备方法可以为：将驴皮漂泡去毛，切块洗净，分次水煎，滤过，合并滤液，浓缩(可加适量黄酒、冰糖、豆油)至稠膏状，冷凝，切块，晾干，即得。

具体步骤为：阿胶和水加热溶解，使阿胶溶于水中制成质量浓度为25～35％的阿胶水溶液；阿胶水溶液浓度的大小对后续高压酸性水解有一定的影响，浓度过高影响高压酸性水解的程度，最终得到的阿胶小分子低肽的分子量大小不均匀；浓度过低，降低阿胶小分子低肽的生产效率；综合考虑，将阿胶水溶液的浓度设定为25～35％。优选的，所述阿胶水溶液的质量浓度为30％。

步骤(2)中，采用高压灭菌器进行高压酸性水解，条件为：温度为110～125℃，表压为150～200KPa，时间为1.5～2.5h；当表压高于200KPa、温度高于125℃时，对阿胶中蛋白质的破坏程度较大，得到较多的降解后的氨基酸而并不是小分子低肽，活性较低；当表压低于150KPa、110℃温度低于时，对阿胶的破坏程度较低，因而得到的阿胶小分子低肽的含量较低。优选的，所述水解时间为2h，表压为180KPa，温度为115℃。

步骤(2)的目的是将大分子蛋白在高压酸性条件下水解为小分子低肽，高压可通过改变生物大分子的结构而改善食品的功能特性。高压处理使蛋白质的疏水基团暴露、去分子折叠以及聚集而改变蛋白质的功能性质，从而能够快速的将蛋白质的大分子结构破坏，加速水解。结合草酸所提供的酸性环境，既能使得阿胶大分子快速的降解成为分子量均一的小分子低肽，又由于采用有机酸草酸作为酸性水解介质，苦味轻，进而得到的阿胶小分子低肽的苦味轻，无机酸苦味重不适合作为水解介质，经实验验证，采用草酸能够使得阿胶小分子低肽的口感较好。

步骤(3)中，采用碳酸钙作为碱性pH调节剂，因为溶液中的草酸会和碳酸钙反应中和酸性，生成草酸钙，通过离心去除草酸钙；优选的，调节高压水解后的产物的pH至4，为后续脱色作好准备工作。

步骤(4)中，活性炭吸附温度为75～85℃，吸附时间为20～40min；优选的，所述吸附温度为80℃，吸附时间为30min。此步目的是进行杂质吸附和脱色，使得低肽的纯度更高。

进一步的，在步骤(4)后，将得到的阿胶小分子低肽加入甜味剂掩盖苦味；所述甜味剂并没有特别限定，可以是蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉糖和乳糖等。

本发明还提供一种上述方法制备得到的阿胶小分子低肽，该阿胶小分子低肽可呈液体或固态形式，当为固态形式时，可在液体的基础上进一步浓缩、干燥得固态小分子低肽。得到的固态小分子低肽呈浅棕色，分子量小于500道尔顿，其中，分子量在250～500道尔顿之间的低肽占70～75％。

分子量的测定参照多糖的分子量测定法(凝胶过滤法)测定，该方法为本领域技术人员公知。

本发明还保护包含上述阿胶小分子低肽的阿胶产品，所述阿胶小分子低肽可以与常规辅料相配合按照常规工艺制备得到阿胶产品，产品形式可以为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、缓释制剂、控释制剂、口服液体制剂等。

所述常规辅料为海藻糖、微晶纤维素、硬脂酸镁、淀粉等中的一种或多种。

上述技术方案中的其中一个技术方案的有益效果是：

(1)相比于传统的生物酶解阿胶方法，本发明采用高压酸水解阿胶制备得到阿胶小分子低肽的方法，其得到的水解产物分子量较小，分布集中，并且该方法投资少，成本低，产量大。

(2)本发明采用有机酸来制成酸性环境，草酸是一种弱酸，能够充分打破阿胶蛋白质之间的肽键，将其分解为小分子低肽；采用高压蒸煮的方法则是快速将蛋白质变性，将肽键断裂。本发明采用两者相结合的方法，有利于得到分子量较小和均匀的小分子低肽。小分子量低肽可以被人体很好的吸收和利用。

附图说明

图1是本发明方法的流程图。

图2是实施例1和对比例1中的产品的溶解性图。

图3是实施例1和对比例1中的产品的热稳定性图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种制备阿胶小分子低肽的方法，包括以下步骤，流程如图1所示：

将阿胶与去离子水混合加热，水浴温度为65℃，加热时间为15min，使阿胶溶于水中，制成质量浓度为30％的阿胶混合液。向溶解后的阿胶混合液加入有机酸草酸调整其pH值为2，放入高压蒸汽灭菌器内，高压酸性水解2h，表压为180KPa，温度为115℃，其目的是将大分子的蛋白在高压酸性条件下水解为小分子的低肽。然后用碳酸钙回调至pH＝4，离心去除草酸钙，加入活性炭吸附30min，此步的目的是进行杂质吸附和脱色。将脱色后得溶液至于离心机中在6500r/min的转速下离心10min，将活性炭去除，得到阿胶小分子低肽溶液，然后加入约为阿胶质量1/3的蔗糖来掩盖苦味，最后进行喷雾干燥，得到浅棕色的阿胶小分子低肽粉末，均匀适度，没有结块，无异味，经测定，该小分子低肽的分子量小于500道尔顿，其中，分子量在250～500道尔顿之间的低肽占73％。

实施例2

一种制备阿胶小分子低肽的方法，包括以下步骤：

将阿胶与去离子水混合加热，水浴温度为70℃，加热时间为15min，使阿胶溶于水中，制成质量浓度为25％的阿胶混合液。向溶解后的阿胶混合液加入有机酸草酸调整其pH值为2.5，放入高压蒸汽灭菌器内，高压酸性水解1.5h，表压为200KPa，温度为110℃，其目的是将大分子的蛋白在高压酸性条件下水解为小分子的低肽。然后用碳酸钙回调至pH＝3.5，离心去除草酸钙，加入活性炭吸附25min，此步的目的是进行杂质吸附和脱色。将脱色后得溶液至于离心机中在6000r/min的转速下离心15min，将活性炭去除，得到阿胶小分子低肽溶液，然后加入约为阿胶质量1/4的蔗糖来掩盖苦味，最后进行喷雾干燥，得到浅棕色的阿胶小分子低肽，经测定，该小分子低肽的分子量小于500道尔顿，其中，分子量在250～500道尔顿之间的低肽占70％。

实施例3

一种制备阿胶小分子低肽的方法，包括以下步骤：

将阿胶与去离子水混合加热，水浴温度为85℃，加热时间为15min，使阿胶溶于水中，制成质量浓度为25％的阿胶混合液。向溶解后的阿胶混合液加入有机酸草酸调整其pH值为1.5，放入高压蒸汽灭菌锅内，高压酸性水解2.5h，表压为200KPa，温度为120℃，其目的是将大分子的蛋白在高压酸性条件下水解为小分子的低肽。然后用碳酸钙回调至pH＝3.5，离心去除草酸钙，加入活性炭吸附35min，此步的目的是进行杂质吸附和脱色。将脱色后得溶液至于离心机中在7000r/min的转速下离心8min，将活性炭去除，得到阿胶小分子低肽溶液，然后加入约为阿胶质量1/2的蔗糖来掩盖苦味，最后进行喷雾干燥，得到浅棕色的阿胶小分子低肽，经测定，该小分子低肽的分子量小于500道尔顿，其中，分子量在250～500道尔顿之间的低肽占71％。

对比例1复合酶水解法

将阿胶与去离子水混合加热，水浴温度为65℃，加热时间为15min，使阿胶溶于水中，制成质量浓度为30％的阿胶混合液。调整pH值至2；加入胃蛋白酶，酶的使用量为阿胶混合液质量的0.2％，在42℃酶解2小时；调整pH至8，加入0.35％的胰蛋白酶，在42℃酶解3小时，终止酶解反应；升温至85℃灭酶4分钟，冷却，过滤，喷雾干燥，即得阿胶多肽粉。

对比例2其他有机酸对产品的影响

将阿胶与去离子水混合加热，水浴温度为65℃，加热时间为15min，使阿胶溶于水中，制成质量浓度为30％的阿胶混合液。向溶解后的阿胶混合液加入有机酸乙酸调整其pH值为2，放入高压蒸汽灭菌器内，高压酸性水解2h，表压为180KPa，温度为115℃。然后用碱液回调至pH＝4，加入活性炭吸附30min，此步的目的是进行杂质吸附和脱色。将脱色后得溶液至于离心机中在6500r/min的转速下离心10min，将活性炭去除，得到阿胶小分子低肽溶液，然后加入约为阿胶质量1/3的蔗糖来掩盖苦味，最后进行喷雾干燥，得到浅棕色的阿胶多肽粉末。当加入与实施例1相同质量的蔗糖时，该对比例得到的多肽粉的苦味较重。

实验例1

1、低肽和氨基酸的测定：凯氏定氮法。

测定结果如表1：

表1多肽和氨基酸含量

样品	低肽和氨基酸含量(％)	250～500道尔顿之间的低肽含量(％)
			实施例1	88.5	73.8
实施例2	86.8	70.3
			实施例3	85.9	71.4
对比例1	82.3	20.4
			对比例2	75.6	32.2

由表1可得，本发明制备得到的产品中的纯度较高，低肽和氨基酸含量高达88.5％，250～500道尔顿之间的低肽含量高达73％。对比例1和对比例2中的多肽粉虽然纯度均能达到75％以上，但是其分子量较大，主要集中分布在1000～5000道尔顿，250～500道尔顿之间的低肽含量很低。

2、溶解性测定：

称取阿胶小分子低肽粉1g，配制成50mg/mL的溶液，搅拌均匀，将低肽溶液的pH值分别调节为1～9，通过pH计测定pH稳定后再不停的搅拌，然后在3500rpm离心10min，用凯氏定氮法测1g低肽粉和离心上清液中的含氮量，两者氮的比例即为氮溶解指数值(NSI)，绘制出NSI-曲线，并与同等质量的对比例1中的阿胶多肽粉作对照。

测定结果如图2所示，本发明实施例1中的阿胶小分子低肽的NSI在95％左右波动，溶解性优异，由于实施例1中高压酸性条件将阿胶水解成小分子低肽，因此，将氨基、羧基和酰胺基团暴露出，溶解性增强，良好的溶解性为以后加工为其他阿胶产品提供了一定优势。而对比例1中的多肽分子量较大，部分多肽折叠成一定的空间结构，无法暴露出亲水性基团，所以溶解性较低，尤其是pH在4～6(等电点附近)之间时，溶解性最小。

3、热稳定性的测定：

将实施例1中的阿胶小分子低肽和对比例1中的多肽分别配制成50mg/mL的溶液，沸水浴20min，待冷却后测NSI，对照为取未加热处理的样品。

测定结果如图3所示，沸水浴加热后，对比例1中的多肽NSI下降了47％，加热后其变性溶解度显著降低，而本发明中的阿胶小分子低肽仍然具有较好的溶解性，良好的热稳定性为以后的加工为其他阿胶产品提供了一定优势。

实验例2

1、实验过程：取质量20g左右的小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，为空白组，模型组，对照组，实验组，每组10只，其中后2组每天颈背部注射浓度为50mg/mL的D-半乳糖(用生理盐水配制)，每次注射量为0.025mL/g，连续注射40天，造糖代谢衰老模型。空白组每天注射等量的生理盐水。

从第10天开始，模型组小鼠每天灌服一次2mL的生理盐水，对照组小鼠每天灌服一次2mL用对比例1的产品配制的浓度为50mg/mL的多肽溶液，实验组小鼠每天灌服一次2mL用实施例1的产品配制的浓度为50mg/mL的低肽溶液。连续给30天。每3天称重1次，根据体重调整D-半乳糖和相应药物用量。于最后1次给D-半乳糖和灌药后3h，小鼠眼眶取血，采用肝素抗凝，分别测定血过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽的活力，再取小鼠肝、脑制备肝、脑匀浆，分别测定血浆过氧化脂质、肝匀浆和脑匀浆中过氧化脂质含量，过氧化脂质的测定方法按照常规的TBA法测定。

2、结果：

(1)对衰老模型小鼠血过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽活力的影响：

结果见表2所示，模型组的小鼠血的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽活力均显著低于空白组，P<0.01，说明小鼠糖代谢衰老模型建模成功。与对照组相比，实验组中的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽活力均显著提高，P<0.01，说明本发明中阿胶小分子低肽的活性更高。

表2血过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽活力的测定(单位：U/L)

组别	过氧化氢酶(×10<sup>-4</sup>)	超氧化物歧化酶	谷胱苷肽
				空白组	9.654±0.214	3125±256	8.052±1.254
模型组	6.568±1.245	1589±134	3.254±0.954
				对照组	7.695±0.875	2215±264	5.381±1.324
实验组	8.547±0.693	2931±320	9.645±1.348

(2)对衰老模型小鼠血浆过氧化脂质、肝匀浆和脑匀浆中过氧化脂质含量的影响：

过氧化脂质是氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的产物。在正常情况下，LPO的含量极低，但在病理情况下，脂质过氧化反应增强可导致LPO升高，LPO升高可对细胞及细胞膜的结构和功能造成种种损伤。

结果见表3所示，模型组小鼠血浆、脑匀浆及肝匀浆过氧化脂质均明显高于空白组(P<0.01),说明糖代谢衰老模型建模成功。与对照组相比，实施例1中的产品均可显著降低血浆、肝匀浆和脑匀浆中过氧化脂质水平(P<0.01)。

表3小鼠血浆过氧化脂质、肝匀浆和脑匀浆中过氧化脂质含量

(3)结论：从表2和表3的结果可以看出，与对照组相比，灌服实施例1中的产品的小鼠血的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱苷肽活力均较高，并且能够显著降低血浆、肝匀浆和脑匀浆中过氧化脂质水平，这说明本实施例1中的阿胶小分子低肽抗氧化活性较高，与对照组相比，具有显著差异。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种制备阿胶小分子低肽的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)阿胶和水加热溶解，使阿胶溶于水中制成质量浓度为25～35％的阿胶水溶液；

(2)加酸高压水解：将步骤(1)中的阿胶溶液与草酸混合，调节pH至1.5～2.5，高压酸性水解，采用高压灭菌器进行高压酸性水解，条件为：温度为110～125℃，表压为150～200KPa，时间为1.5～2.5h；

(3)回调pH：调节高压水解后的产物的pH至3.5～4.5；

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述阿胶水溶液的质量浓度为30％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中，所述表压为180KPa，温度为115℃，时间为2h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中，采用碳酸钙作为碱性pH调节剂，调节高压水解后的产物的pH至4。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(4)中，活性炭吸附温度为75～85℃，吸附时间为20～40min。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是：所述吸附温度为80℃，吸附时间为30min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是：在步骤(4)后，将得到的阿胶小分子低肽加入甜味剂掩盖苦味。