KR100906170B1 - 초음파를 이용한 굴 미백 활성 펩타이드 제조방법 - Google Patents

Abstract

우리나라에서는 10월부터 3월까지는 가공하지 않은 생굴의 형태로 고가에 주로 유통은 있으나 이후 산란기에 해당하는 4월부터 7월 사이에는 동결 굴, 건조 굴 및 통조림용 자숙 굴 등의 형태로 재조되어 국외로 수출되고 있고 일부만 건조 굴 및 기타 저차 가공 천연 조미료 등의 개발에 불과하여 양식산 굴의 소비에 획기적으로 기여하지 못하고 향장 소재로의 활용이 전무하며 또한 이의 연구도 전무한 상황이다.

본 발명은 굴을 주재로 하여 초음파를 이용한 펩타이드 제조 공정에 관한 것이다. 종래의 굴은 자체 가수분해 효소가 많으며 수분활성도가 높은 식품으로 쉽게 상하는 결점이 있어 유통, 가공 상에 많은 결점을 가지고 있는 식품이었다. 또한 우리나라에서의 마비성 패류독(paralytic shellfish poison, PSP) 발생은 주로 남해안 일원의 폐쇄 내만에서 2월부터 6월 사이에 발생하는 것으로 나타나며 주 양식 대상 품종인 굴의 수확기와 일부 중복됨에 따라 독성 검사를 거쳐야 하는 까다로운 공정을 가지고 있다.

가수분해된 단백질 분해산물은 소화흡수가 용이하며 물에 녹아 조미료 및 향장품등에 응용이 가능하다. 또한 기존 연구에 의하면 펩타이드는 면역조절 작용에 유용할 뿐만 아니라 이들을 동물 또는 인체에 투여 시 시험관내 및 생체내 모두에서 효소에 의해 급속히 파괴되는 것으로 나타나서 흡수가 더욱 용이하게 되는 것으로 나타났다.. 굴은 기존 식품 재료이므로 독성이 전무하며 최근 펩타이드의 항산 화, 미백등의 연구가 진행되고 있어 펩타이드에 관한 관심이 높아져 있다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 인체의 피부에 존재하며 자외선에 대항하는 기능을 수행하고 아민, 유리기, 금속이온 등과 같은 세포 독성 물질에 대한 제거제로 작용하여 세포를 보호하는 작용을 한다. 반면에 체내, 외적인 여러 요인에 의한 멜라닌 생성이 증가되어 다량의 멜라닌이 각질 형성 세포에 전달되고 피부 상피층에 축적되어 과색소 침착 현상이 나타나며 이런 멜라닌의 과잉생산은 인체의 기미, 주근깨를 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암의 유발에 관여하는 것으로 알려졌다. 이처럼 멜라닌의 색소침착은 인체의 병리적 무제의 원인이 되기도 하지만 미용적인 측면의 문제로 인식되고 있다.

본 발명은 이러한 펩타이드를 환경적, 경제적, 시간적으로 최적의 추출할 수 있는 가공공정에 관한 것으로 기존의 식품으로만 이용되던 굴의 활용성을 극대화 할 수 있다. 또한 기존에 다양한 펩타이드들이 탁월한 항산화제능을 갖추고 있어 이의 공급을 통한 세포손상방지효과까지 갖추어 피부노화 억제 효과가 우수하며, 또한 손상된 피부 조직의 콜라겐 생성을 촉진함으로써 피부 재생에 있어서도 탁월한 효과를 갖는 향장 소재의 활용도 가능한 공정이 될 것이며 펩타이드를 함유하는 치료학적 조성물, 및 이들 펩타이드 및 조성물의 투여에 의한 인체 및 동물의 치료방법도 제공할 수 있는 폭넓은 활용분야를 갖고 있는 효율적인 펩타이드 제조 공정을 포함하는 미백활성물질에 관한 것이다.

기존의 열수 추출 방법과 초음파 추출을 병행하여 참굴 추출물의 미백 활성 물질 용출의 최적화 공정을 추구하였다. 본 연구에서는 기존의 열수 추출 방법과 저온 복합 추출을 비교하여 참굴 추출물의 향장 미백활성을 비교하였다. 기존의 열수 추출방법은 추출할 때 낮은 추출 효율과 이로 인한 에너지 소비가 많으며 열로 인한 많은 유용성분의 파괴, 단백질의 변이, 성분의 손실, 가용성분 위주의 추출, 열에 대하여 불안정한 것 등의 단점을 드러내고 있다. 이에 반해 초음파 추출의 병행 방법은 추출공정의 효율을 높이고, 생물 활성율과 식물 성분의 용매 추출동안 초음파를 이용하는 것이 효과가 있다고 보고된 바 있다. 용매 내에서 초음파(ultrasound)의 공동(cavitation)효과에 의해 유발된 분자운동이 활성화 에너지로 작용하여 세척이나 반응성 향상, 특정성분의 추출 공정에 도입되어 공정의 효율을 높이는 효과가 있다. 즉, 초음파 추출의 병행 방법은 추출공정의 효율을 높이고, 생물 활성율과 굴 성분의 용매 추출동안 초음파를 이용하여 미백활성물질의 용출량 증가와 미백활성의 증진을 추구하였다.

굴, 초음파 분쇄기, 단백질, 펩타이드, 미백활성

Description

초음파를 이용한 굴 미백 활성 펩타이드 제조방법{Skin beautifier of oyster peptide using ultrasonic}

한국 전 연안에 분포하는 참굴(Crassostrea gigas)은 양식의 주요 종으로 난생형이며 만 1년이면 숙성할 정도로 성장이 빠르다. 우리나라 참굴의 상업적 이용 잠재성을 보자면 미국 식품의약품안전청(FDA)에서 그 우수성을 인정받고 있고, 냉동굴은 2001년 수산물로서는 처음으로 산업자원부로부터 세계 일류 상품에 선정되었고 또한 굴은 천해양식 수산물 중에서 2005년 기준으로 생산량과 수출량 모두 2위를 차지할 만큼 우리나라 수산물 중에서도 대표적인 비교우위 품목이다.

굴은 타우린, 글리코겐, 셀레늄 및 아연 등과 같은 건강 기능에 아주 우수한 식품 재자원이다. 다른 패류와 달리 조직이 부드럽고 단백질 및 기타 영양분의 소화 흡수율이 높아서 유아나 어린이, 노인 및 병약자에 이르기까지 이용이 가능하므로 완전한 영양식품으로 우유에 비견되고 있다. 이러한 굴은 비타민 E와 A가 다량 함유되어 있으며 고혈압, 동맥경화, 심장병 등의 예방에 좋은 식품이라고 전해지고 있다.

우리나라에서는 10월부터 3월까지는 가공하지 않은 생굴의 형태로 고가에 주 로 유통은 있으나 이후 산란기에 해당하는 4월부터 7월 사이에는 동결 굴, 건조 굴 및 통조림용 자숙 굴 등의 형태로 재조되어 국외로 수출되고 있고 일부만 건조 굴 및 기타 저차 가공 천연 조미료 등의 개발에 불과하여 양식산 굴의 소비에 획기적으로 기여하지 못하고 향장 소재로의 활용이 전무하며 또한 이의 연구도 전무한 상황이다.

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 인체의 피부에 존재하며 자외선에 대항하는 기능을 수행하고 아민, 유리기, 금속이온 등과 같은 세포 독성 물질에 대한 제거제로 작용하여 세포를 보호하는 작용을 한다. 반면에 체내, 외적인 여러 요인에 의한 멜라닌 생성이 증가되어 다량의 멜라닌이 각질 형성 세포에 전달되고 피부 상피층에 축적되어 과색소 침착 현상이 나타나며 이런 맬라닌의 과잉생산은 인체의 기미, 주근깨를 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암의 유발에 관여하는 것으로 알려졌다. 이처럼 멜라닌의 색소침착은 인체의 병리적 무제의 원인이 되기도 하지만 미용적인 측면의 문제로 인식되고 있다. 따라서 천연물질의 멜라닌 형성 억제에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.

펩타이드 (peptide)는 모든 단백질의 구성 성분으로서, 피부에 대한 부작용이 없이 피부 재생을 활성화시키며, '세계 피부과학회 학술대회'에서 발표된 연구에 의하면, 이러한 펩타이드 화장품이 레티놀에 비해서 효과가 2개월 정도는 빠르며, 단백질의 구성 성분으로서 다량 사용한다 하더라도 부작용이 없어서, 눈가와 같은 민감한 부위에도 안심하고 사용될 수 있다고 보고된 바 있다. 따라서, 현재 특정 미용 효과들을 개선한 다양한 펩타이드 화장용 조성물들이 연구 및 개발되고 있는 실정이지만, 주름 개선 효과, 보습 효과, 노화 억제 효과, 및 피부 재생 효과와 같은 다양한 미용 효과들을 골고루 만족시키는 펩타이드 화장용 조성물에 대해서는 그 연구 개발이 시급한 실정이다.

본 특허에서는 기존의 열수 추출 방법과 저온 복합 추출을 비교하여 참굴 추출물의 향장활성을 비교하였다. 기존의 열수 추출방법은 추출할 때 낮은 추출 효율과 이로 인한 에너지 소비가 많으며 열로 인한 많은 유용성분의 파괴, 단백질의 변이, 성분의 손실, 가용성분 위주의 추출, 열에 대하여 불안정한 것 등의 단점을 드러내고 있다. 이에 반해 초음파 추출의 병행 방법은 추출공정의 효율을 높이고, 생물 활성율과 식물 성분의 용매 추출동안 초음파를 이용하는 것이 효과가 있다고 보고된 바 있다. 용매 내에서 초음파(ultrasound)의 공동(cavitation)효과에 의해 유발된 분자운동이 활성화 에너지로 작용하여 세척이나 반응성 향상, 특정성분의 추출 공정에 도입되어 공정의 효율을 높이는 효과가 있다.

굴의 예로부터 피부를 하얗게 한다는 구전이 많이 전해지고 있어 굴을 소재로 하여 초음파 병행 추출공정을 통한 미백활성 증진을 추구하는 것이 본원의 목적이며 특징이다.

이에 본 발명자는 상기 언급한 미백활성 효과를 갖춘 향장품 소제를 개발하고자 연구를 거듭한 결과 굴의 특정 펩타이드 성분이 미백 효과를 만족시킬 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

우리가 초음파라고 말하는 것은 일반적으로 인간이 듣는 것을 목적으로 하지 않고 또 귀에 들리지도 않는 음을 말한다. 그러나 한마디로 인간의 귀에는 들리지 않는다 해도 들리고 안 들리는 것은 사람에 따라 차이가 난다. 그러므로 한계 주파수를 얼마에서부터 얼마까지 정한다는 것은 여간 어려운 것이 아니다. 그러나 보통 크게 구분하여 약 30HZ 의 낮은 쪽에서 20KHZ 의 높은 쪽까지 한정시키고 있다. 따라서 이 범위의 음은 들리고 이외의 음은 들리지 않는다고도 한다. 30HZ 이하의 음을 초저주파, 20KHZ 이상을 초음파로 구별하고 있다.

기존의 초음파의 활용을 생체 적합성 소재에 활용한 경우는 드믈었다. 식기세척기 등의 작용을 예를 들면 물 속에서 초음파를 발생시키면 음파의 진동에 의해 수많은 기포들이 발생한다. 이때 기포가 진공청소기 같은 역할을 해서 물체 표면에 붙어 있는 이물질을 떼어낸다. 또한 음파가 1초에 수만 번 물을 진동시키기 때문에 마치 빨래방망이로 두드려서 세탁하는 효과를 나타내기도 한다. 또 모기 같은 해충의 퇴치에 이용한다. 사람의 피를 빠는 모기의 암컷은 여름철 알을 낳을 때가 되면 수컷 모기를 피한다. 그러므로 수컷 모기가 내는 초음파를 방안에서 발생시키면 암컷 모기가 접근하지 않는다. 임신했을 때 태아의 형상을 보기 위해서도 초음파를 사용한다. 초음파를 복부에 발생시키고 태아로부터 반사되어 온 음파를 분석하여 아기의 모습을 영상으로 보여준다. 또한 건축물의 안정성이나 수명 등을 조사할 때 초음파를 이용한 비파괴검사를 한다.

기존의 펩타이드 제조공정은 아미노산으로 이루어진 단백질을 산을 이용하여 가수분해하여 만들었다. 이는 매우 비 특이적으로서 기질 절단 부위를 비특이적으로 인식하여 잔기의 구조를 불규칙하게 만들고 효소의 작용에 영향을 미치지 못하는 단점이 있었으며 또한 그 활용이 단순 소화 증진만을 위한 경우가 대부분이다.

초음파 추출의 병행 방법은 추출공정의 효율을 높이고자하며 이 발명근원은 생물 활성율과 식물 성분의 용매 추출동안 초음파를 이용하는 것이 효과가 있다고 보고된 바 있기 때문이다. 용매 내에서 초음파(ultrasound)의 공동(cavitation)효과에 의해 유발된 분자운동이 활성화 에너지로 작용하여 세척이나 반응성 향상, 특정성분의 추출 공정에 도입되어 공정의 효율을 높이는 효과가 있어 여러분야에 활용되어 왔으나 단백질의 펩타이드화 공정에 도입된 적이 없어 펩타이드 공정에의 활용이 기대되고 있는 신기술이다.

따라서 본 발명은 고온에서의 열수 추출을 완전 배제하고 저온 추출 후 초음파 분쇄기만을 이용함으로서 펩타이드의 제조 시간과 단가를 크게 절감 할 수 제조공정에 관한 것이다.

펩타이드 (peptide)는 모든 단백질의 구성 성분으로서, 피부에 대한 부작용이 없이 피부 재생을 활성화시키며, '세계 피부과학회 학술대회'에서 발표된 연구에 의하면, 이러한 펩타이드 화장품이 레티놀에 비해서 효과가 2개월 정도는 빠르며, 단백질의 구성 성분으로서 다량 사용한다 하더라도 부작용이 없어서, 눈가와 같은 민감한 부위에도 안심하고 사용될 수 있다고 보고된 바 있다. 따라서, 현재 특정 미용 효과들을 개선한 다양한 펩타이드 화장용 조성물들이 연구 및 개발되고 있는 실정이지만, 주름 개선 효과, 보습 효과, 노화 억제 효과, 및 피부 재생 효과와 같은 다양한 미용 효과들을 골고루 만족시키는 펩타이드 화장용 조성물에 대해서는 그 연구 개발이 시급한 실정이다.

본 발명은 굴로부터 추출 공정에 편의를 주며 효율을 극대화 하여 그로인해 만들어진 추출물에 미백 향장소재로서의 활용을 늘리는데 목적이 있다. 또한 독성 안정성이 뛰어난 펩타이드의 장점을 활용하여 기존 미백제들의 부작용을 최소화 하며 식용 이외의 활용이 지극히 낮았던 풍부한 해산물 소재인 굴에 대하여 활용성을 높이는데 그 목적이 있다고 할 수 있다.

산·알카리 처리는 사용이 제한적이며 굴 활성물질의 열적 안정성이 문제가 되던 기준 천연 추출공정의 단점을 보완 하였다.

따라서 위에서 언급한 공정상의 제약을 모두 회피하며 국내 최초로 굴 추출공정에 초음파를 도입하여 그 추출시간을 줄이며 효율을 높이고 미백 향장 활성의 극대화를 이룩하고자 하며 궁극적으로 미백활성 물질의 제조를 이룩하고자 한다.

본 발명은 참굴분말을 40℃로 열수추출한 후, 초음파추출기로 90KHZ로 10분간 초음파 처리한 후, 37℃에서 2시간 펩신처리하여 굴 펩타이드군을 제조하는 공정 및 상기 굴 펩타이드군 으로부터 50-100KDa 분자량 범위에 있는 미백활성 펩타 이드를 분리하는 공정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 것이다.

기존의 펩타이드 제조 공정은 조건이 까다로우며 산처리등을 이용하여 장치의 부식을 일으켜 단점이 많았다. 또한 그 산물의 안정성 문제로 인한 향장제품으로의 활용에 세포독성 검사, 임상검사등을 필수로 거쳐야 했으며 이의 결과 또한 부정적으로 나왔다.

기질 특이적으로 작용하는 효소를 사용할 경우 그 부산물의 절편 분자량이 다양하여 새로운 활성을 기대할 수 있다. 본 특허의 기술을 활용한 펩타이드의 공정은 장치의 부식을 일으키지 않으며 공정이 간단하고 열처리를 하지 않을뿐더러 보편적 단백질 분해 효소인 pepsin을 활용하여 매우 광범위한 펩타이드 제조에 활용할 수 있다. 또한 산, 알카리 처리를 하지 않고 생화학적 작용만을 실시하여 향장소재와 같은 생체적합소재를 만들 경우에 세포독성이 전무한 물질을 제조할 수 있어 코스메슈티컬 분야에 두루 사용할 수 있다. 그리하여 단순 식품가공공정에서의 단백질 분해의 소화증진 효과를 넘어 향장 활성, 간독성, 에이즈, 등의 의약 및 식품 분야에 사용할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 공정상의 문제점을 해결하고 그간 식품으로만 활용해오던 굴의 다양한 소재로의 활용에 적합한 펩타이드를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 또한 기초적인 공정만으로 이루어져 대단위 공정 또한 가능하여 산업화에 적극 활용이 가능하다.

본 발명은 피부를 하얗게 한다는 구전이 전해오는 참굴을 원료로 하여 활용성의 다양화를 이루는 것이다. 이전에는 식품으로서의 활용만 있던 참굴의 미백 향장 소재로서의 활용을 할 수 있게 한다. 또한 기존 열수 추출에 의한 공정을 초음파 공정을 도입하여 굴의 향장 소재로서의 활성을 증진시켜 그 활용성을 높였다.

활성에 관한 구체적 자료로서 상기에 멜라닌 저해 활성능을 보였으므로 향장소재활성 중 피부미백효과의 활용을 모색할 수 있다. 또한 활성 단백질의 분리 공정으로 인한 미백소재의 순도를 높일 수 있다. 제조방법을 활용할 경우 산 등의 화학물질에 의한 장치의 부식 문제가 전혀 발생하지 않을 뿐만 아니라 제품의 세포 독성에 영향을 미치는 pH, 독성물질 등의 문제를 해결 할 수 있으며 중성과정이 필요가 없으며 따라서 중성염의 발생으로 인한 후 처리 문제가 없다.

본 발명은 초음파를 이용한 굴 미백활성 펩타이드 제조방법에 관한 것으로,

굴 분말을 40℃로 열수추출한 후, 초음파추출기로 90KHZ로 10분간 초음파 처리한 후, 37℃에서 2시간 펩신처리하여 굴 펩타이드군을 제조하는 공정 및 상기 굴 펩타이드군으로부터 50-100KDa 분자량범위에 있는 미백화성 펩타이드를 분리하는 공정으로 구성된다.

본 발명에서는 참굴을 이용하여 40℃로 열수 추출한 것을 다시 초음파 추출기(Asia industry, Kor.)를 통하여 60 kHz, 90 kHz, 120 kHz 공정을 병행하고 최정 pepsin의 처리 후 그 가수분해도를 측정하였다.

이후 얻어진 물질을 Broad-range pre-stained marker(DokDo-MarkTM, EBM-1032)를 이용하여 SDS-PAGE로 분자량을 측정하여 분자량의 검정 후, 10³-10⁵의 분자량 부근을 용출할 수 있는 Sephadex G-75에 의한 분획물 별로 구분하여 spectrophotometer을 이용하여 O.D.값이 증가하는 시점을 기준으로 주피크를 모아 tyrosinase 활성을 탐색하였으며 최고 활성을 보인 분획물을 대상으로 다시 MalDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 확인하여 분리하여 세포독성, 멜라닌 생성량 측정 하여 최종 미백활성이 우수한 물질을 검정하였다.

본 발명의 구체적인 실시 예는 다음과 같다.

실시 예 1. 굴 시료의 준비 단계

굴 100g을 증류수 300ml에 넣어 10분간 비등한 후, 호모게나이져로 균질화 하였다.

실시 예 2. 초음파를 이용한 복합 추출공정

본 특허에 사용한 시료는 동해안 참굴(Crassostrea gigas) 분말로서 국내 동해산 양식 참굴을 이용하여 추출하였다. 추출 방법으로는 물을 이용하여 추출온도는 40℃에서 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 용매를 이용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다.

액상으로 된 시료를 초음파 분쇄기(Science & materials 社, VCX500)를 이용하여 5초 초음파 노출, 5초 비공정의 반복과 찬물에 중탕으로 열상승을 막으며 시간별로 처리하였다.

2-1. 60 kHz의 초음파로 5, 10, 15분 시간별 초음파 처리

2-2. 90 kHz의 초음파로 5, 10, 15분 시간별 초음파 처리

2-3 120 kHz의 초음파로 5, 10, 15분 시간별 초음파 처리

Pepsin을 효소/기질 비가 1%가 되도록 첨가해 37℃에서 2시간 가수분해한 후 끓는 물에서 10분간 처리하여 반응을 종결 시켰다.

이 중에서 가수분해도를 측정하여 가장 많은 가수분해도를 보인 90KHz의 초음파를 선택하여 시간을 늘려 시간별 효율을 따져 최종 10분의 최종 공정 조건을 확립하였다.

반응혼합액에서 2ml를 취하여 20%(w/v)trichloroacetic acid(TCA) 2ml가 들어 있는 시험관에 넣고, 혼합한 후 원심분리(3,000xg, 10min)를 하였다. 원심분리한 상층액을 일정량 취하여 Lowry법으로 10% TCA 가용성 단백질량을 측정한 후, 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.

가수분해도(%) = 10% TCA가용성 단백질량/총단백질량 x 100

단백질 정량을 위하여 BAC kit로 수율을 측정하였으며 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조하여 사용하였다.

실시 예 3. 활성 펩타이드의 분리

Broad-range pre-stained marker를 이용하여 SDS-PAGE로 분자량을 측정하여 분자량의 검정 후, 10³-10⁵의 분자량 부근을 용출할 수 있는 Sephadex G-75에 의한 fraction No.별로 구분하여 spectrophotometer을 이용하여 340 nm의 O.D값이 증가하는 시점을 기준으로 주피크를 모아 다시 MalDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 확인하여 분리하여 시료로 사용하였다. 분자량을 확인한 SDS-GEL 사진을 도 2.에 나타내었다. 이후 10³-10⁵의 분자량 부근을 용출할 수 있는 Sephadex G-75에 의한 분획물 별로 구분하여 spectrophotometer을 이용하여 O.D.값이 증가하는 시점을 기준으로 주피크를 모아 분리하여 Tyrosinase 저해능을 측정 하여 최종 미백활성이 우수한 물질을 분리하였다.

1. tyrosinase 측정

tyrosinase 활성저해시험( In vitro tyrosinase inhibition assay)-미백효과

타이로시나제는 인체내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 이 시험은 시험관내에서 타이로시나제 효소의 활성을 저해하는 정도를 평가하는 방법입니다. 그리고 실험 방법은 다음과 같습니다.

① 시료를 에탄올이나 적당한 용매에 녹여 희석하여 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 ㎕와 시료액 20 ㎕ 그리고 머쉬룸 타이로시나제(1500U/mL~2000U/mL)액 20 ㎕를 순서대로 넣습니다.

② 이 용액에 1.5 mM Tyrosin 액 40 ㎕를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨후 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정합니다.

대조군은 시료액 대신 0.1 M인산염완충액(pH 6.5)을 사용하며 활성저해율이 50 %일 때의 시료의 농도(IC₅₀)를 구한다. 또한, 양성대조군은 알부틴 또는 에칠아스코빌에텔 등을 사용할 수 있습니다.

·a : 대조군의 반응 후의 흡광도

·b : 시료액의 반응 후의 흡광도

·a', b' : 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

2. fraction 별 분자량 결정

가장 높은 tyrosinase 저해활성을 보인 30대 fraction을 기점으로 SDS-PAGE를 이용하여 분자량을 검정하였다. 또한 이를 확인하기 위하여 MalDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 보다 정밀하게 파악하여 최종 68kDa의 분자량을 알 수 있었습니다.

도 4는 MALDI-TOF 결과로서 보다 정밀하게 분자량을 알 수있는 기계를 이용한 결과입니다. 66~68kDa에서 최고 피크가 나왔으며 33과 132kDa의 경우는 분자들이 뭉치거나 붕괴하여 나온 결과이니 모두 66~68kDa인 것과 같은 내용입니다.

실시 예 4. 상기에서 얻어진 활성 단백질별 세포 독성 실험

In vitro 세포 독성 측정HEL 299, Clone M-3, CCD-986sk 등 3가지 정상 세포에 추출물에서 분리한 단백질 별로 0.2mg/ml에서 1.0mg/ml까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 배양한 후 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. 세포독성의 결과는 비처리 대조군과의 비교를 통하여(control %) 도 3에 나타내었다.

최고농도인 1.0mg/ml의 농도에서 HEL-299세포는 40℃ 초음파 추출물과 40℃ 추출물이 각각 14.7%과 11.1%를 보였으며 Melan-a 세포에서는 22.4%, 22,8%를 나타냈고 CCD-986sk세포에서는 모두 13%이하의 낮은 세포독성을 나타내었다.

실시 예 5. 멜라닌 세포를 이용한 멜라닌 생성량 억제 측정

1) Clone-M3 세포 접종 후 3일간 시료 처리 후 배지를 제거한다. 세포를 PBS로 세척 후 각 well 당 1ml의 1N NaOH를 가하고 교반하여 세포막을 융해하여 멜라닌 성분을 녹여 나오게 한다. 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색의 가시광선 영역인 400nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌의 생성량을 비교하였다. 생성량 비교 결는 표 1에 나타내었다.

표 1. Clone-M3 세포에서의 멜라닌 생성량 비교. (공시료의 멜라닌 생성량을 100%로 설정)

시료	시료처리 농도 (mg/ml)	멜라닌 생성(%)
40℃에서 초음파를병행한 조 추출물	0.2	99.6±0.7
	0.4	89.1±1.1
	0.6	86.1±3.5
	0.8	84.1±4.6
	1.0	82.5±0.9
40℃에서 초음파를 병행하지 않은 추출물	0.2	99.7±2.0
	0.4	90.7±4.0
	0.6	87.5±4.0
	0.8	85.1±3.7
	1.0	84.0±2.2
68 kDa 펩타이드	0.2	85.7±0.6
	0.4	70.0±2.5
	0.6	66.5±3.7
	0.8	62.7±2.1
	1.0	62.7±1.8
아스코빅산	0.2	95.7±0.6
	0.4	90.0±2.5
	0.6	86.5±3.7
	0.8	86.7±2.1
	1.0	86.7±1.8

멜라닌 생성률을 40℃ 초음파 병행추출물, 40℃, 분리 peptides, 대조군인 Ascorbic acid 최고농도인 1.0mg/ml까지 각각 82.5%, 84.0%, 62.7%, 86.7%로 농도 의존적으로 감소시켰다. 이 결과는 멜라닌 생성은 줄이면서 세포독성은 낮아야 하는 향장미백제로의 기준에 굴의 추출물이 부합하는 것으로 판단되어진다.

도 1은 초음파별 시간에 따른 가수분해도 측정결과 그래프이다.

도 2는 분획순서에 따른 tyrosinase 저해활성검사 그래프이다.

도 3는 SDS-PAGE를 이용한 참굴 추출물의 분자량확인 사진이다.

도 4는 Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)를 이용한 정제 펩타이드의 분자량 측정결과 그래프이다.

도 5는 초음파처리 공정물과 기존 열수추출물의 세포에 따른 세포독성을 나타내는 그래프이다.

Claims (2)

1. 참굴분말을 40℃로 열수추출한 후, 초음파추출기로 90KHZ로 10분간 초음파 처리한 후, 37℃에서 2시간 펩신처리하여 굴 펩타이드군을 제조하는 공정 및 상기 굴 펩타이드군 으로부터 50-100KDa 분자량 범위에 있는 미백활성 펩타이드를 분리하는 공정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 초음파를 이용한 굴 미백활성 펩타이드 제조방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 초음파처리는 열의 방지를 위해 얼음으로 중탕한 후 5초 초음파노출, 5초 비공정을 반복하는 것을 특징으로 하는 초음파를 이용한 굴 미백활성 펩타이드 제조방법.

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