CN103462865A - 从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物及其提取方法和用途 - Google Patents
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Abstract
从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物及其提取方法和用途，涉及从动物胚胎，特别是从羊、猪和狗等动物胚胎皮肤及肌肉中提取胚胎素的工艺技术领域。将于从冷冻保存的动物胚胎中取得的胚胎皮肤及肌肉采用双蒸水浸泡后机械粉碎，再经反复冷冻和解冻后，以冷冻离心机处理10～15分钟，取得水提溶液，将水提溶液的Ph值调至2～4后采用冷冻离心去除沉淀物，取上清再调Ph值至4～6，再经冷冻离心去除沉淀物，取得水提溶液经超滤，分离出分子量为5000D以下的水溶性胚胎素。本发明可利用的胚胎原量广泛，易得，利于工业化大批量生产，可确保提取液中物质易被人体皮肤和粘膜组织吸收。
Description
技术领域
本发明涉及从动物胚胎，特别是从羊、猪和狗等动物胚胎皮肤及肌肉中提取胚胎素的工艺技术领域。
背景技术
1912年瑞士科学家卡尔教授因首次发现羊胚胎细胞中有一种能使人体细胞恢复活力的神奇物质，即羊胚胎素而获得诺贝尔医学奖，找到可以延缓人类衰老的纯天然动物制品羊胚胎素，从而使人们追求年轻和延年益寿的梦想成为现实。
据科学考证，生物细胞分裂的次数与寿命有相关性，比如，寿命为30年的鸡，细胞分裂为25次；而寿命仅为3年的小白鼠，只分裂12次。而导致人体衰老的根本原因是构成生命肌体最基本的单位细胞出现了老化；随着年龄的增大，细胞分裂越来越慢，老化细胞使器官机能不断下降，甚至引起病变，人也随之衰老。卡尔教授在羊胚胎中发现的羊胚胎素可以使动物机体细胞分裂次数增加，能使已衰退或老化的细胞重新活化或使其发生凋亡，从而使老化的组织机能得到恢复。
1931年，瑞士保罗.尼翰教授首次通过注射的方式将小羊的甲状旁腺提取物用于一位甲状旁腺受损的临危病人并成功地挽救了其生命，这项具有里程碑式意义的发现为人类日后羊胚胎素在生物医学和抗衰老领域的应用奠定了基础，罗马教皇为了表示对他的敬意，授封其为梵蒂冈科学院院士。1950年，瑞士Dr.Alfred Pfister与尼翰教授经过多年的合作与努力，发现羊胚胎细胞的提取物是活性细胞物质的最佳载体。
1952年， Dr.Alfred Pfister成立了瑞士雷曼纳健康医疗中心，推广羊胚胎素活细胞疗法。1955年，在瑞士Batelle研究院的支持下他解决了细胞提取时(冻干或冻结)造成的损伤和恶化过程，以及保存时存在的技术缺陷，此成果被命名为Cellvital。1956年，研究成果Cellvital又得到曾在1931年获诺贝尔医学奖的奥托.海因里希.瓦尔堡细胞生物学家的论证。
70多年来，全球数十万人进行过羊胚胎素的相关治疗，其中包括前罗马教皇保罗十二世、英国女王及皇室成员、菲律宾马克斯总统、沙特阿拉伯和也门国王们、日本裕仁天皇、丘吉尔首相、法国戴高乐总统、查理·卓别林，以及玛丽莲梦露、黛德丽、嘉宝，球星马拉多纳等等。
羊胚胎素含有多种能够调节人体组织器官机能的活性成分，其中包括表皮生长因子（EGF）、透明质酸刺激因子（HASF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等具有美化肌肤功效的成分。特别是羊胚胎素中的EGF,作为一种新兴的美容护肤因子正成为时尚；最新研究表明人的角质层细胞和纤维细胞等均有特异性EGF受体存在，为人体皮肤细胞具有吸收EGF的能力提供了理论依据。
另外,羊胚胎素中还含有多种小分子活性肽、核酸、维生素、多种矿物元素和丰富的氨基酸等活性成分,在促进皮肤细胞更新的同时,还能增加其内源性生长因子的含量,促进细胞分泌透明质酸和糖蛋白，具有调整皮肤结构,延缓衰老，减少皱纹,抑制粉刺和防治青春痘生长的作用。因此，羊胚胎素作为一种具有独特生物学效应的化妆品添加剂将具有越来越强的生命力和良好的发展前景。
经过百年的研究可见，羊胎素在延缓机体衰老方面的作用是肯定的；而其所含的小分子活性物质在提高机体免疫力方面作用也是十分显著的；另外，在调节和平衡机体激素水平、改善贫血、增强新陈代谢和促进机体活力等方面也具有显著效果，羊胚胎素是一种既可以内用，也可以外用的活性小分子多肽类物质，其被机体吸收和利用的方式也是多种多样的，其对人类的美容和健康事业必将发挥越来越大的作用。
目前羊胎素的提取过程大约可分为三个阶段：首先从小羊胚胎组织细胞中提取活性成分，去除杂质、热敏感蛋白质及过敏因子；其次通过分离技术，得到具有不同功效的活性物质，如胚胎胸腺素、各种生长因子等不同类型的活性肽，最后采用冻干技术进行冷冻干燥，保证其活性。值得注意的是羊胎素的提取是一项非常复杂的生物技术过程，如今只能在实验室中完成，很难进行大量工业化生产和长期保存。在我国有实验室采用蛋白水解酶酶解的方法提取羊胚胎素，虽然这种方法可以大幅度提高水解液中总蛋白含量，但经过研究发现所检测到的蛋白质中主要增加的是没有生物调节活性的氨基酸和活性肽的碎片，而真正能够发挥调节作用的胚胎素含量却不高，说明通过蛋白水解酶的酶解处理后所提取出的羊胚胎素活性较低，蛋白水解酶对羊胚胎素具有一定的破坏作用，现在这种提取方法逐渐被新的提取方法所淘汰。
发明内容
本发明第一目的在于提出一种从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物。
本发明所述胚胎素水提取物为从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的分子量小于5000D的水溶性胚胎素。
本发明所指动物不仅是羊，还可以扩大至猪和狗等动物，本发明可利用的胚胎原量广泛，易得，利于工业化大批量生产。本发明水溶性胚胎素的分子量小于5000D可确保提取液中物质易被人体皮肤和粘膜组织吸收。
本发明第二目的在于发明一种利于规模化生产、提高利用率、降低生产成本的从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的分子量小于5000D的水溶性胚胎素的方法。
本发明包括以下步骤：
1）将于-15～-25℃温度条件下冷冻保存的动物胚胎用双蒸水洗净后，取得胚胎皮肤及肌肉；
2）在常压条件下，采用温度为0～5℃的双蒸水浸泡经过机械粉碎的胚胎皮肤及肌肉20～30分钟，所述双蒸水与所述胚胎皮肤及肌肉的混合重量比1～4︰1；
3）将由双蒸水与胚胎皮肤及肌肉混合形成的混合液反复冷冻和解冻2～4次，每次冷冻的环境温度为-15～-30℃，每次冷冻时间为24～48小时，每次解冻温度至≤10℃；
4）以4000～15000转/分的冷冻离心机对上述混合液处理10～15分钟，取得水提溶液A；
5）将水提溶液A的Ph值调至2～4，采用冷冻离心的方法去除沉淀物，取上清再调Ph值至4～6，再经冷冻离心的方法去除沉淀物，取得水提溶液B；
6）在1～5℃的环境温度下超滤水提B溶液，分离出分子量为5000D以下的水溶性胚胎素。
本发明原料采用冷冻保存的动物胚胎，最大程度地保持胚胎中胚胎素的活性；采用双蒸水浸泡的目的是提高提取胚胎素时的纯度，减少水中杂质带来的污染，双蒸水温度保持0～5℃，有利于保护提取液中胚胎素的活性；经过反复冷冻和解冻的处理方法，使混合液呈肉糜状，目的都是为了提高提取效率，增加提取液中胚胎素的含量，并最大程度地保证提取过程中胚胎素的活性，利于后续的分离；采用先调水提溶液A的Ph值调至2～4、再调Ph值至4～6的两次冷冻离心方法，可高效去除去除水提液A中的大蛋白，利于后续的超滤提取；在1～5℃的环境温度下对水提溶液B进行超滤，目的是确保提取胚胎素的活性不受温度的影响，利于高效地提取活性有效成分。最终产品PH值与胚胎素存在的自然条件相近，能够充分保证提取出的胚胎素的天然活性。
发明无需蛋白水解酶的酶解就能够提取出天然结构的高活性胚胎素，提高胚胎素含量，利于工业化规模生产，提高生产效率、提高原料的利用率，以降低生产成本，能够满足化妆品和食品生产。
为了使原料胚胎中所含的胚胎素较多，本发明所述步骤1）的动物胚胎日龄为30～145天。
所述步骤5）中将0～5℃的水提溶液A进行Ph值调整，也是更有利地保持水提溶液A中的有效成分的活性。
本发明所述步骤5）中冷冻离心时采用4000～10000转/分的冷冻离心机处理10～15分钟。目的是有效去除水提混合液中固体杂质，使提取液澄清，透明，使提取液得到进一步提纯，得到水提溶液A。
本发明的第三个目的是提出以上分子量小于5000D的水溶性胚胎素的用途。
用途之一：从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在化妆品生产中的用途，其特点是：在生产化妆品时，将分子量小于5000D的水溶性胚胎素按投料质量占5～50%的比例代替化妆品中原有的水。
用途之二：从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在化妆品生产中的用途，其特点是：在生产化妆品时，将分子量小于5000D的水溶性胚胎素经过冷冻干燥后，密封包装制成化妆品。
经试用，以上两类化妆品对美容效果显著，且无副作用，而且费用低廉，简单易行。
用途之三：从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在食品生产的用途，其特点是：将5000D的水溶性胚胎素用于制备保健口服液和胶囊。
本发明作为保健口服液和胶囊的优点是使用方便、吸收效果好、价格低廉，可作为一般保健品和免疫增强剂使用。
具体实施方式
一、分子量小于5000的水溶性胚胎素的提取方法：
1、将取出30～145日龄的新鲜动物胚胎置于-15～-25℃温度条件下冷冻保存。
2、将冷冻保存的动物胚胎用双蒸水洗净，并分离取得胚胎皮肤及肌肉。再将分离后的胚胎皮肤及肌肉采用机械粉碎，待用。
3、在常压条件下，采用温度为0～5℃的双蒸水浸泡经过机械粉碎的胚胎皮肤及肌肉20～30分钟。双蒸水与胚胎内脏器的混合重量比1～4︰1。
4、将由双蒸水与胚胎皮肤及肌肉混合形成的混合液反复冷冻和解冻2～4次，每次冷冻的环境温度为-15～-30℃，每次冷冻时间为24～48小时，每次解冻温度至≤10℃。
5、以4000～15000转/分的冷冻离心机对经过上述反复循环冷冻和解冻的混合液处理10～15分钟，除去固体杂质，得到水提溶液A。
6、将0～5℃的水提溶液A以1～2N盐酸调整Ph值至2～4，采用冷冻离心的方法去除沉淀物，取上清，将0～5℃的上清以1～2N氢氧化钠调整Ph值至4～6，再经冷冻离心的方法去除沉淀物，取得水提溶液B。
7、在1～5℃的环境温度下对水提溶液B采用5000D的超滤器，超滤水提B溶液，分离出分子量为5000D以下的水溶性胚胎素。
二、分子量为5000D以下的水溶性胚胎素水溶性胚胎素的鉴定：
采用nanodrop2000紫外分光法测定超滤后的上清中胚胎素含量，经测定本发明胚胎素含量可以达到为0.4%～4%，是传统胚胎素提取方法含量的2～10倍，能够大幅度提高胚胎素的提取效率和活性。
三、制备化妆品：
1、化妆品一：
如化妆水的生产配方：
分别称取分子量小于5000D的水溶性胚胎素5kg、净化水95kg将以上原料混合均匀，进行瓶装，即制成化妆水。
2、化妆品之二：
如胚胎素水提取物的冷冻干燥制剂：
将分子量小于5000D的水溶性胚胎素经过冷冻干燥后，密封包装制成冷冻干燥制剂。
将以上化妆水分别直接用于清洁后的脸部，将冷冻干燥制剂直接或采用导入器用于清洁后的脸部，吸收快于普通产品。
应用于皮肤老化人群，皮肤恢复弹性效果显著，且无副作用。
四、制备保健品：
1、制备胚胎素口服制剂A：
将分子量小于5000D的水溶性胚胎素与蜂蜜或其他食品添加剂调匀，经超滤和巴氏消毒灭菌后，灌装瓶装口服液备用。
2、制备胚胎素口服制剂B：
将分子量小于5000D的水溶性胚胎素冷冻干燥后得到冻干粉作为生产各种胶囊的原料，待用。
3、制备胚胎素胶囊：
将分子量为5000D以下的本发明水溶性胚胎素冷冻干燥后得到冻干粉5公斤，茶花粉冷冻干燥后的冻干粉95公斤，二者混合后制粒，灌装每粒净含量250毫克的硬胶囊即可。
4、应用：
服用对象：身体虚弱者。
服用剂量：口服液使用时按照每人每天4～10毫升，连接服用20～30天。口服胶囊，如胶囊含量为冻干粉10～50毫克/粒，每人按照1～4粒/天，连续服用20～30天。
经常易感冒者和高血脂症患者，服用本发明产品20天左右，身体免疫力提高不易感冒，高血脂指标能够恢复正常。
Claims (8)
1.从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物，其特征在于所述胚胎素水提取物为从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的分子量小于5000D的水溶性胚胎素。
2.如权利要求1所述从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将于-15～-25℃温度条件下冷冻保存的动物胚胎用双蒸水洗净后，取得胚胎皮肤及肌肉；
2）在常压条件下，采用温度为0～5℃的双蒸水浸泡经过机械粉碎的胚胎皮肤及肌肉20～30分钟，所述双蒸水与所述胚胎皮肤及肌肉的混合重量比1～4︰1；
3）将由双蒸水与胚胎皮肤及肌肉混合形成的混合液反复冷冻和解冻2～4次，每次冷冻的环境温度为-15～-30℃，每次冷冻时间为24～48小时，每次解冻至温度≤10℃；
4）以4000～15000转/分的冷冻离心机对上述混合液处理10～15分钟，取得水提溶液A；
5）将水提溶液A的Ph值调至2～4，采用冷冻离心的方法去除沉淀物，取上清再调Ph值至4～6，再经冷冻离心的方法去除沉淀物，取得水提溶液B；
6）在1～5℃的环境温度下超滤水提B溶液，分离出分子量为5000D以下的水溶性胚胎素。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于所述步骤1）的动物胚胎日龄为30～145天。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于所述步骤5）中将0～5℃的水提溶液A进行Ph值调整。
5.根据权利要求2或4所述方法，其特征在于所述步骤5）中冷冻离心时采用4000～10000转/分的冷冻离心机处理10～15分钟。
6.如权利要求1所述从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在化妆品生产中的用途，其特征在于，在生产化妆品时，将分子量小于5000D的水溶性胚胎素按投料质量占5～50%的比例代替化妆品中原有的水。
7.如权利要求1所述从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在化妆品生产中的用途，其特征在于，在生产化妆品时，将分子量小于5000D的水溶性胚胎素经过冷冻干燥后，密封包装制成化妆品。
8.如权利要求1所述从动物胚胎皮肤及肌肉中提取的胚胎素水提取物在食品生产的用途，其特征在于，将5000D的水溶性胚胎素用于制备保健口服液和胶囊。
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