KR101021645B1 - 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

오징어에 함유된 콜라겐은 축산 동물로부터 추출한 콜라겐과는 다른 생물학적 특성을 가짐에 따라 의약품 등 산업용 소재로 유용하게 사용될 것으로 사료된다. 하지만 이들 오징어 콜라겐의 추출에 있어 기존의 산 또는 알칼리 추출방법으로 콜라겐을 추출할 경우 체벽에 존재하는 골편(탄산칼슘)이 용해되어 혼입됨에 따라 콜라겐의 순도를 저하시키는 문제가 발생할 수 있다. 따라서 오징어 유래 콜라겐을 산업적으로 생산, 활용하기 위해서는 이러한 문제의 해결이 가능한 콜라겐 추출방법이 요구되고 있다. 특히 추출만으로는 콜라겐 자체의 큰 분자량으로 인한 피부 투과성 및 생리활성이 저조함에 따라 이의 활용성을 증진할 수 있는 가공 공정의 개발이 절실하다. 펩타이드란 단백질의 분해과정에서 생기는 물질로서 단백질은 체내에서 소화관을 통하는 사이 소화효소에 의해 아미노산으로 분해되어 소장에서 흡수된다. 그러나 모든 단백질이 아미노산까지 분해되지 않고 일부는 아미노산이 여러개 결합된 펩타이드 상태로 흡수된다. 또한 특정 잔기를 갖는 펩타이드들은 체내 티로시나아제에 결합하여 그 활성을 낮춤으로써 미백활성을 나타낸다. 펩타이드는 단백질이 아미노산으로 분해되는 과정의 중간산물로, 다양한 조합의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 중합물을 형성하고 있는 것으로 일반적으로 분자량 10,000 달톤 이하의 것을 말한다. 본 발명은 오징어껍질에 존재하는 콜라겐을 활용하는 방법에 관한 것으로써 다양한 주파수의 초음파를 병행하여 복잡한 콜라겐 분리공정의 최적 및 간소화하고 기존의 오징어 콜라겐의 단점인 피부흡수도를 개선하며 새로운 향장 소재로서의 기능을 부가하는 미백 소재 펩타이드 제조방법에 관한 것이다.

오징어, 콜라겐, 미백, 초음파, 오징어껍질.

Description

미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 제조방법{The making methode of whitened peptide from squid collagen}

본 발명은 오징어를 수산화나트륨 용액에 넣고 진탕하여 얻어진 오징어 콜라겐을 미백화하고 초음파처리하여 펩타이드화 함으로서 미백 활성을 갖는 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드를 제공하는 제조방법에 관한 것이다.

현재 새로운 콜라겐 획득원인 어피 부산물의 이용은 폐기물처리나 자원의 개발이라는 측면과 축산 돼지의 질병에 대한 인간 면역의 위협 등으로 콜라겐의 급원이 부족한 상황에서 오징어 콜라겐의 활용이 절실한 상황이다. 우리나라의 오징어의 연간 어획량은 세계 2위인 30~40만 톤으로 그 중 15%가 동해안에서 어획이 되고 있다. 오징어 껍질의 콜라겐 함량은 15%이상으로 오징어의 가공 시 발생하는 부산물을 이용할 필요가 있으며 이 오징어 껍질의 콜라겐을 정제한 활용이 최근 들어 증가하는 추세이다.

정제한 콜라겐의 직접적인 향장 소재로의 활용은 큰 분자량으로 인하여 경피 흡수율이 효율적이지 않고 대부분이 비수.지용성 물질로서 보습이외의 향장.생리학적 증진 효과는 높지 않아 이의 개선이 필요한 상황이다.

따라서 보습 이외의 활성을 갖게 하는 기술이 필요하며 이를 통한 오징어 부산물로부터 유래된 콜라겐의 부가가치를 높이며 큰 분자량으로 인한 흡수도를 개선하여 향장활성의 극대화를 이뤄야하는 과제가 남아있다.

피부 표면의 각질은 일정한 재생주기에 따라 각질층 바깥에서부터 탈락이 이뤄지는데 피부 수분이 부족하거나 각질층 내 지질합성에 이상이 생겨 생리활성 인자들의 활성이 원활하지 못할 경우 각질이 탈락되지 않아 각질세포가 쌓이게 된다.

따라서 피부 표면의 각질들이 감소하였다는 증거는 피부 보습 및 장벽기능이 정상화 되었다는 것을 의미하게 된다.

이외에도 피부 노화가 진행됨에 따라 피부 두께가 얇아지고, 자외선 조사에 의해 피부색이 검게 변하며 주름이 생긴다. 이러한 변화를 통해 피부의 연령 및 노화의 정도를 유추할 수 있으므로 피부의 생리학적 관찰을 하는데 중요한 지표가 될 수 있다.

펩타이드는 지질대사 촉진 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 들어 다이어트 식품 등에 응용되고 있는 실정이다. 지질 대사 개선기능을 가진 기능성 펩타이드의 원료 단백으로 우유, 어육, 대두 글루텐 등이 사용되고 있다. 누에고치의 가수분해물인 실크 펩타이드는 18종의 amino acids와 peptide로 항산화 효과 및 면역 관련 작용을 하며 우유중의 casein 단백질의 가수분해물이나 펩타이드 등은 칼슘 흡수촉진인자, 혈압강하에 대한 효과 및 면역기능과 위액분비 촉진, 정서 기능, 마취 및 스트레스 감소 등의 opioid peptide로서 작용, 성장 촉진인자 및 항산화인자로 활용되고 있으며 최근에 이러한 성인질환에 대한 생체 조절 기능을 갖는 펩타 이드를 다양한 식품원료의 분해물로부터 분리하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데 특히 우유, 소의 혈액, 돼지고기, 소고기, 명태, 고등어, 대두, 밀, 보리 등과 같은 식품 단백질에 존재하는 펩타이드는 In vitro에서 효소처리에 의해 생성된 것이 대부분이며 상대적으로 간단한 아미노산 결합으로 구성되지만 뛰어난 생체 조절 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 여러 생리활성을 갖는 다양한 펩타이드들을 이용하여 미백에 활성을 갖는 물질 정제에 관한 연구가 이뤄지고 있으며 그 결과 특정 잔기를 갖는 펩타이드가 미백 활성에 영향을 미치는 티로시나아제 효소와 결합하여 그 활성을 낮춤으로써 미백효가를 갖게 된다는 것이 밝혀졌다.

기존의 콜라겐을 추출할 때 낮은 추출 효율과 이로 인한 에너지 소비가 많으며 열로 인한 많은 유용성분의 파괴, 단백질의 변이, 성분의 손실, 가용성분 위주의 추출, 열에 대하여 불안정한 것 등의 단점을 드러내고 있다. 이에 반해 초음파 추출의 병행 방법은 추출공정의 효율을 높이고, 생물 활성율과 성분의 용매 용출 동안 초음파를 이용하는 것이 효과가 있다고 보고된 바 있다.

용매 내에서 초음파(ultrasound)의 공동(cavitation)효과에 의해 유발된 분자운동이 활성화 에너지로 작용하여 세척이나 반응성 향상, 특정성분의 추출 공정에 도입되어 공정의 효율을 높이는 효과가 있다.

이러한 경향을 반영하고 우리나라 동해 주요 수산물인 오징어의 폐기물의 활용을 목적으로 하여 콜라겐 단백질보다 부가가치를 높은 활용이 필요한 실정이다.

본 발명은 동해산 오징어로부터 폐기물인 껍질에서의 펩타이드 추출 공정에 편의를 주고 그로 인해 만들어진 펩타이드에 미백 향장소재로서의 활용을 늘리는데 목적이 있다.

산.알카리처리는 공정상의 위험성을 지니며 외피조직의 용출이 있어서 사용이 제한적이며 오징어 콜라겐의 열적 안정성이 23 이하로 매우 민감하여 열공정도 도입이 불가능하다. 또한 껍질에 붙은 콜라겐 분리 공정이 수월하지 못하다.

용매 내에서 초음파(ultrasound)의 공동(cavitation)효과에 의해 유발된 분자운동이 활성화 에너지로 작용하여 세척이나 반응성 향상, 특정성분의 추출 공정에 도입되어 공정의 효율을 높이는 효과가 있다.

또한 펩타이드는 상대적으로 간단한 아미노산 결합으로 구성되지만 뛰어난 생체 조절 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 여러 생리활성을 갖는 다양한 펩타이드들을 이용하여 미백에 활성을 갖는 물질 정제에 관한 연구가 이루어지고 있으며 그 결과 특정 잔기를 갖는 펩타이드가 미백 활성에 영향을 미치는 티로시나아제 효소와 결합하여 그 활성을 낮춤으로써 미백 효과를 갖게 된다는 것이 밝혀졌다.

따라서 위에서 언급한 공정상의 제약을 모두 회피하며 긍극적으로 향장소재로서의 활성성도 높일 수 있는 동해산 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 초음파병행 제조 공정의 최적화를 확립하고자 하며 또한 정제된 물질의 미백화를 통한 제품성 증진을 목표로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 의한 본 발명의 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 제조방법은 (1) 오징어를 수산화나트륨 용액에 넣고 진탕하여 오징어 콜라겐의 제조공정 (2) 획득한 콜라겐의 중량대비 1% 과산화수소로 15에서 12시간 진탕하는 콜라겐의 미백화공정 (3) 미백화된 콜라겐을 20에서 60-130KHz,에서 초음파처리하는 펩타이드화 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한 상기한 펩타이드화 공정에서 90Hz의 초음파를 사용하여 미백효과를 극대화 하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명의 동해산 오징어의 어업폐기물인 껍질을 이용하여 순수하고 제품성이 증진된 콜라겐을 제조후 초음파 공정을 최적화로 펩타이드 제조하는 방법과 그 제조물에 관한 것으로서 효소처리 전에 초음파의 공동화 현상을 이용하여 콜라겐 분자의 최소화하여 효소 처리 단계에서의 효과를 극대화 시켜 단시간에 저분자 펩타이드의 제조가 가능하다. 또한 미백 활성이 90kHz로 제조한 펩타이드의 경우 티로시나아제의 저해활성이 최고농도 1.0 mg/ml의 농도에서 74.1%로 가장 높게 나타나 초음파 공정의 최적화를 이루었다.

이로서 동해산 오징어의 폐기물인 껍질 활용할 수 있으며 또한, 본 발명에 의한 미백화된 콜라겐을 통하여 펩타이드를 제조할 경우 하얗고 제품성이 뛰어난 향장품을 얻을 수 있다. 또한 초음파 공정을 최적화로 인하여 그 미백 활성의 증진으로 인한 제품의 기능성의 향상을 기대할 수 있다. 또한 이 제조방법을 활용할 경우 산 등의 화학물질에 의한 장치의 부식 문제가 전혀 발생하지 않을 뿐만 아니라 제품의 세포 독성에 영향을 미치는 pH, 독성물질 등의 문제를 해결 할 수 있으며 중성과정이 필요가 없으며 따라서 중성염의 발생으로 인한 후 처리 문제가 없다.

또한, 이 발명으로 만들어진 펩타이드는 미백활성의 증진을 꾀할 수 있어 오징어 콜라겐의 향장 소재로서의 활용성을 증대 시킨다.

본 발명의 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 구체적인 제조방법 (1) 오징어를 수산화나트륨 용액에 넣고 진탕하여 오징어유래 콜라겐의 제조공정 (2) 획득한 콜라겐의 중량대비 1% 과산화수소 15에서 12시간 진탕하는 콜라겐의 미백화공정 (3) 미백화된 콜라겐을 20에서 60-130KHz,DPTJ 초음파처리하는 펩타이드화 공정으로 이루어진다.

본 발명에서 콜라겐 획득까지의 과정은 동해에서 가장 많은 어획량을 자랑하는 오징어를 재료로 한 일반적인 방법으로 수산화나트륨을 이용하여 비단백질 물질들을 제거하여 순수한 콜라겐만을 남겨 그 순도를 높였으며, 과산화수소로 미백화 시켜 하얀 콜라겐을 획득할 뿐만 아니라 콜라겐을 제외한 성분을 완전히 제거하였다. 이 시료에 다양한 Hz의 초음파를 1시간씩 처리하고 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 2시간 가수분해를 병행하였다. 액의 부피를 줄이기 위하여 진공 동결 건조하여 오징어 유래 펩타이드 분말을 제조하였다. 이후 초음파 공정별 비교로 서 In vitro 피부투과 실험 및 세포독성 실험, 미백활성 실험을 시행하였다.

본 발명의 구체적인 실시 예는 다음과 같다.

실시 예 1. 동해산 오징어 유래 콜라겐의 제조

1) 콜라겐은 국내 어획한 오징어를 채집하자마자 동결하여 사용하였다.

2) 1차로 시료를 5 크기로 나눠 내피부위가 잘 드러나도록 자른 다음 찬물로 침수시켜 부피대비 3%의 과산화수소와 0.1N 수산화 나트륨 용액에 중량 대비 20%의 시료를 넣고 12시간씩 진탕한 후 비콜라겐 물질을 없애주는 과정을 3번 반복하였다.

이후 상층액을 모두 버리고 다시 증류수에 중량대비 0.5%의 구연산과 비타민 C를 가용화 하여 변성점 이하인 23에서 콜라겐을 획득하였다.

실시 예 2. 제조된 콜라겐의 미백화

1) 획득한 콜라겐의 중량 대비 1% 과산화수소로 15에서 12시간 진탕하여 미백화 시켜 하얀 콜라겐을 획득할 뿐만 아니라 콜라겐을 제외한 성분을 완전히 제거하였다.

실시 예 3. 상기에서 얻어진 콜라겐의 초음파 병행 저분자 펩타이드화

1) 상기에서 얻어진 콜라겐 시료에 초음파 추출기(Asia industry, Kor.)를 이용하여 20에서 60, 90, 130 KHz, 의 초음파로 1시간 처리하여 콜라겐 분자들을 물리적 최소 크기로 분해 하였다.

2) 상기에서 얻어진 단일화 된 콜라겐 시료에 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 상온에서 1시간 가수분해를 행하였다.

3) 상층액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축 후 진공 동결 건조하여 오징어 껍질 유래 펩타이드 분말을 제조하였다.

실시 예 4. 상기에서 얻어진 저분자 펩타이드의 독성 실험

1) In vitro 세포 독성 측정HEL 299 정상 세포에 오징어 껍질 유래 콜라겐과 펩타이드를 0.2mg/ml에서 1.0mg/ml까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 배양한 후 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다.

실시 예 5. 상기에서 얻어진 저분자 펩타이드의 티로시나아제 억제활성

1) 시료를 에탄올이나 적당한 용매에 녹여 희석하여 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 와 시료액 20 그리고 머쉬룸 타이로시나제(1500U/mL~2000U/mL)액 20 를 순서대로 넣는다.

2) 이 용액에 1.5 mM Tyrosin 액 40 를 넣고 37에서 10~15분 동안 반응시킨후 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한다.

a : 대조군의 반응 후의 흡광도

b : 시료액의 반응 후의 흡광도

a', b' : 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

표 1. 오징어 껍질 유래 펩타이드의 세포 독성

농도 (mg/ml)	세포 생존률(% of control)
	콜라겐	펩타이드 60kHz	펩타이드 90kHz	펩타이드 130kHz
0.2	100	101.2	100.1	99.41
0.4	101.1	99	98.98	99.51
0.6	101.6	101.06	99.26	99.41
0.8	99.7	99.3	99.1	99.12
1.0	96.5	100.2	99.18	100.2

오징어 콜라겐과 펩타이드를 0.2mg/ml의 농도에서부터 1.0mg/ml의 농도까지 처리하였을 경우 정상 세포인 HEL-299세포의 성장은 모든 공정별로 제조된 펩타이드 모두에서 전혀 저해되지 않았으며 이는 인체의 세포에 독성이 없음을 나타낸다.

표 2. Tyrosinase 저해활성

시료	저해율 (%)
	0.2mg/ml	0.4mg/ml	0.6mg/ml	0.8mg/ml	1.0mg/ml
콜라겐	61.5±0.40	64.8±0.10	70.0±0.50	71.7±0.06	72.1±0.06
펩타이드 60kHz	51.5±0.21	58.7±0.20	66.4±0.40	68.4±0.06	69.4±0.60
펩타이드 90kHz	52.1±0.26	58.9±0.31	67.1±0.12	69.8±0.40	74.1±2.10
펩타이드 130kHz	53.5±0.31	56.7±0.40	64.4±1.40	61.4±1.00	61.2±1.10
ascorbic acid	68.1±0.30	68.7±0.21	69.4±0.30	70.1±0.30	70.8±0.30

오징어 콜라겐 유래 펩타이드와 SIGMA사에서 구입한 commercial 콜라겐을 같은 공정으로 펩타이드화하여 tyrosinase 활성을 측정하였다. 이는 L-DOPA로 전환되게 하는 효소로서 이는 최종 멜라닌을 생성하여 피부미백효과를 실험하는데 인증된 실험을 시행한 것으로써 실시 최고 농도인 1.0mg/ml에서 90 kHz의 펩타이드가 가장높은 74.1%의 tyrosinase 저해활성을 보여 미백 소재로서의 활용성을 보여주었다.

Claims (2)

1. (1) 오징어를 수산화나트륨 용액에 넣고 진탕하여 오징어 콜라겐을 제조하는 공정 (2) 획득한 콜라겐의 중량대비 1% 과산화수소로 15에서 12시간 진탕하는 콜라겐의 미백화공정 (3) 미백화된 콜라겐을 60-130KHz,에서 초음파처리하는 펩타이드화 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드 제조방법
2. 제1항에 있어서;

   상기한 펩타이드화 공정에서 90Hz의 초음파를 사용하여 미백효과를 극대화 하는 것을 특징으로 하는 미백화된 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 제조방법