CN114539387B - 一种海洋源抗冻肽制备物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海洋源抗冻肽制备物，该抗冻肽制备物包含多肽His‑Val‑Arg‑Gly‑Ala‑Phe‑Ser‑Glu‑Glu，其占所述抗冻肽制备物总含量的60‑70％，UPLC‑MS检测其分子离子峰为[M]+1052m/z，该抗冻肽制备物能够对大肠杆菌及过氧化氢酶起到良好的低温保护作用。本发明还涉及上述海洋源抗冻肽制备物的制备方法，该方法采用蛋白酶酶解技术和凝胶柱层析技术联用，操作简单、成本低廉、酶解过程效率高，分离纯化所得的抗冻肽制备物具有高抗冻活性；本发明采用的原料为加工副产物的鱿鱼皮，能有效地提高了资源的利用度并减少了环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及抗冻肽，尤其涉及一种海洋源抗冻肽制备物及其制备方法与应用。
背景技术
抗冻肽，是生物体为适应极端寒冷环境而产生的一类特异性多肽或糖肽。它能够以非依数的方式降低冰晶生长点，而不影响其熔点来抑制冰晶生长和重结晶。1969年Devries在南极鱼的血液中首次发现了AFPs的存在，之后相继在其他物种中发现了AFP。目前，已在极区生物、越冬生物、耐寒植物及细菌、真菌、动物等生物体中发现了AFP的存在。
胶原蛋白具有独特的三螺旋结构，已有大量研究证明胶原蛋白含有具抗冻活性的多肽。胶原蛋白多肽链由Gly-X-Y氨基酸序列重复而成，X、Y代表除了甘氨酸之外的其他氨基酸残基，X、Y往往是脯氨酸和羟脯氨酸，这一重复单元与Graham等从雪蚤中提取的两种AFP的重复序列-Gly-X-X-非常相似。其次，胶原三肽重复序列中富含的亲、疏水氨基酸可能通过羟基或疏水相互作用与冰晶棱面结合，从而抑制其生长。再次，胶原多肽的螺旋结构可能通过形成独特的肽平面在冰晶棱面上发生堆积，从而影响冰晶的生长。
鱿鱼是海洋头足类动物，因其蛋白质含量丰富且脂肪含量低，深受人们喜爱。鱿鱼鲜食口感佳，鱿鱼制品丰富多样。我国鱿鱼产业发展迅速，在2016年鱿鱼捕捞量为38.01万吨，占世界总捕捞量的40％左右，2017年捕捞量为32万吨，加上进口鱿鱼我国每年加工鱿鱼总量在50万吨左右。鱿鱼可食用部分约占胴体的80％，在加工过程中产生的下脚料皮、骨、内脏、眼睛及墨鱼汁中含有丰富的蛋白、脂肪、多糖、氨基酸等营养物质。鱿鱼皮占鱿鱼加工副产物中最大比例，鱿鱼皮富含胶原蛋白，约占其干重的70％左右，是良好的胶原蛋白来源，研究表明鱿鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化、抗癌、抗衰、降糖、将血压等功能，但现有的技术中未见以鱿鱼皮为原料制备胶原蛋白抗冻肽的工艺报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状而提供一种海洋源抗冻肽制备物。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状而提供一种海洋源抗冻肽制备物的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术的现状而提供一种海洋源抗冻肽制备物的应用。
为解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种海洋源抗冻肽制备物，其特征在于：该抗冻肽制备物包含多肽His-Val-Arg-Gly-Ala-Phe-Ser-Glu-Glu，其占所述抗冻肽制备物总含量的60-70％，UPLC-MS检测其分子离子峰为[M]+1052m/z。
为解决上述第二个技术问题，本发明还提供一种上述海洋源抗冻肽制备物的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱿鱼皮的前处理
对鱿鱼皮进行脱杂脱脂处理，并将鱿鱼皮上的处理液清洗干净；
(2)鱿鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)中清洗后的鱿鱼皮绞碎，再加入缓冲液配制为悬浊液，将悬浊液置于水浴中提取胶原蛋白，提取完成后过滤取滤液，所述滤液冻干得鱿鱼皮胶原蛋白；
(3)鱿鱼皮胶原蛋白酶解
取步骤(2)所得鱿鱼皮胶原蛋白溶于酸性缓冲液中得到胶原蛋白溶液，在所得胶原蛋白溶液中加入酸性蛋白酶进行酶解得酶解液，将酶解液进行灭酶处理后，再离心取上清液；
(4)鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的分离
步骤(3)所得上清液通过凝胶柱进行分离纯化。
优选地，步骤(1)的具体过程为：
A:将鱿鱼皮上的杂质剥除，再清洗沥干；
B:称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:20～30加入1～5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡12～36h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
C:称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:10～25加入10～25％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18～24h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
优选地，步骤(B)的具体过程为：称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:25加入2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡24h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；步骤(C)的具体过程为：称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:15加入15％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
优选地，步骤(2)中，所述缓冲液为pH3-5的柠檬酸缓冲液，所述悬浊液的料液比为1:100～200，所述水浴的温度为60～80℃，时长为6～8h。
优选地，步骤(2)中，所述缓冲液为pH4的柠檬酸缓冲液，所述悬浊液的料液比为1:100，所述水浴的温度为60℃，时长为8h。水浴法提取胶原蛋白的效率高，可处理的底物量大。
优选地，步骤(3)中，所述酸性缓冲液为pH2-4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述酶解的条件为：所述鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度为2～4w/v％，所述酸性蛋白酶的酶加入量为2000～8000U/g，酶解温度为35-45℃，酶解时长为2～5h；所述灭酶条件为沸水浴20～30min；所述离心条件是8000-12000r/min离心15～25min。
优选地，步骤(3)中，所述酸性缓冲液为pH3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述酶解的条件为：所述鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度为4％(w/v)，所述酸性蛋白酶的酶加入量为6000U/g，酶解温度为40℃，酶解时长为3h；所述灭酶条件为沸水浴25min；所述离心条件是10000r/min离心20min。本发明采用单酶一步酶解技术，所涉及的操作步骤少，成本低。
优选地，步骤(4)中，将所述上清液上样到Sephadex G-25凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为0.1～0.5mL/min，在220nm波长处检测，收集各级分。经过Sephadex G-25凝胶柱分离后，蛋白回收率为93.15％。
同样为解决上述第三个技术问题，本发明还提供一种海洋源抗冻肽制备物在制备抗冻剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的抗冻肽制备物的热滞活性为4℃，抗冻肽制备物对大肠杆菌和过氧化氢酶均具有低温保护作用；
(2)本发明将酶解发酵法与柱层析技术联用，工艺原料成本低廉，整个制备过程简单易控；
(3)本发明采用的原料为加工副产物的鱿鱼皮，能有效地提高了资源的利用度并减少了环境污染。
附图说明
图1为本发明中Sephadex G-25凝胶柱层析的洗脱曲线图；
图2为本发明中抗冻肽粗提物和F1、F2级分的抗冻活性结果图；
图3为本发明中F2级分的高效液相谱图；
图4为本发明中抗冻肽His-Val-Arg-Gly-Ala-Phe-Ser-Glu-Glu的质谱图
图5为本发明中不同温度下所得酶解产物对过氧化氢酶活力的影响；
图6为本发明中不同底物浓度下所得酶解产物对过氧化氢酶活力的影响；
图7为本发明中不同加酶量下所得酶解产物对过氧化氢酶活力的影响；
图8为本发明中不同酶解时间下所得酶解产物对过氧化氢酶活力的影响。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
(1)鱿鱼皮的前处理
A:将鱿鱼皮上的杂质剥除，反复清洗并沥干；
B:称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:20加入1mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡12h，每6h更换一次氯化钠溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
C:称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:10加入10％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18h，每6h更换一次异丙醇溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
(2)鱿鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)所得的鱿鱼皮绞碎，向绞碎的鱿鱼皮中按料液比1:100加入pH3柠檬酸缓冲液配成悬浊液，再将悬浊液置于60℃水浴下提取6h，待提取结束，悬浊液冷却后真空抽滤取滤液，将滤液冻干得鱿鱼皮胶原蛋白。
(3)鱿鱼皮胶原蛋白酶解
取步骤(2)所得鱿鱼皮胶原蛋白溶于pH2的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，再加入酸性蛋白酶进行酶解，蛋白酶酶解的条件如下：酶解温度为35℃，底物浓度为2％，加酶量为2000U/g，酶解时长为2h；酶解结束后对酶解系统进行沸水浴灭酶20min，冷却后于8000r/min离心15min取上清，所得上清液为抗冻肽粗提液，将上清液冻干备用。
(4)鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的分离
用Sephadex G-25(1cm×100cm I.D.)凝胶柱对步骤(3)所得抗冻肽粗提液进行分离：平衡柱子后上样2mL，上样浓度为50mg/mL；以蒸馏水为洗脱液，流速为0.1mL/min，在220nm波长处检测，收集各级分；对各级分的抗冻活性进行分析。
实施例2
(1)鱿鱼皮的前处理
A:将鱿鱼皮上的杂质剥除，反复清洗并沥干；
B:称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:30加入5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡36h，每6h更换一次氯化钠溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
C:称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:25加入25％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡24h，每6h更换一次异丙醇溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
(2)鱿鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)所得的鱿鱼皮绞碎，向绞碎的鱿鱼皮中按料液比1:200加入pH5柠檬酸缓冲液配成悬浊液，再将悬浊液置于80℃水浴下提取8h，待提取结束，悬浊液冷却后真空抽滤取滤液，将滤液冻干得鱿鱼皮胶原蛋白。
(3)鱿鱼皮胶原蛋白酶解
取步骤(2)所得鱿鱼皮胶原蛋白溶于pH4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，再加入酸性蛋白酶进行酶解，蛋白酶酶解的条件如下：酶解温度为45℃，底物浓度为4％，加酶量为8000U/g，酶解时长为5h；酶解结束后对酶解系统进行沸水浴灭酶30min，冷却后于12000r/min离心25min取上清，所得上清液为抗冻肽粗提液，将上清液冻干备用。
(4)鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的分离
用Sephadex G-25(1cm×100cm I.D.)凝胶柱对步骤(3)所得抗冻肽粗提液进行分离：平衡柱子后上样2mL，上样浓度为50mg/mL；以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5mL/min，在220nm波长处检测，收集各级分；对各级分的抗冻活性进行分析。
实施例3
(1)鱿鱼皮的前处理
A:将鱿鱼皮上的杂质剥除，反复清洗并沥干；
B:称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:25加入2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡24h，每6h更换一次氯化钠溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
C:称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:15加入15％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18h，每6h更换一次异丙醇溶液，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
(2)鱿鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)所得的鱿鱼皮绞碎，向绞碎的鱿鱼皮中按料液比1:100加入pH4柠檬酸缓冲液配成悬浊液，再将悬浊液置于60℃水浴下提取8h，待提取结束，悬浊液冷却后真空抽滤取滤液，将滤液冻干得鱿鱼皮胶原蛋白。
(3)鱿鱼皮胶原蛋白酶解
取步骤(2)所得鱿鱼皮胶原蛋白溶于pH3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，再加入酸性蛋白酶进行酶解，蛋白酶酶解的条件如下：酶解温度为45℃，底物浓度为4％，加酶量为6000U/g，酶解时长为3h；酶解结束后对酶解系统进行沸水浴灭酶25min，冷却后于10000r/min离心20min取上清，所得上清液为抗冻肽粗提液，将上清液冻干备用。
(4)鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的分离
用Sephadex G-25(1cm×100cm I.D.)凝胶柱对步骤(3)所得抗冻肽粗提液进行分离：平衡柱子后上样2mL，上样浓度为50mg/mL；以蒸馏水为洗脱液，流速为0.5mL/min，在220nm波长处检测，收集各级分；对各级分的抗冻活性进行分析。
将制备的鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽粗提物通过Sephadex G-25凝胶柱进行分离，蛋白回收率为93.15％。洗脱曲线如图1所示，得到F1和F2两个级分，其中F2级分为抗冻肽制备物，F2级分占酶解产物总含量的71.35％。
实施例4
抗冻肽粗提物和F1、F2级分抗冻活性检测
(1)对过氧化氢酶的低温保护活性
称取一定量过氧化氢酶，溶于pH7.0、0.05mol/L KH2PO4-NaOH缓冲液中，配制成浓度为0.5mg/mL的过氧化氢酶溶液。将过氧化氢酶溶液和2mg/mL的抗冻肽粗提物等体积混合，测定冻融前初始酶活力。将过氧化氢酶和抗冻肽粗提物的混合液于-33℃冷冻24h，然后在25℃下解冻，再放入-33℃冷冻6h；以上操作重复4次。再测定经过反复冻融后的过氧化氢酶活力。以缓冲液代替抗冻肽粗提物，测定对照组在反复冻融后的过氧化氢酶活力。
过氧化氢酶活力的测定方法如下：在石英比色皿中加入1.9mL蒸馏水，再加入0.1mL过氧化氢酶与抗冻肽粗提物混合液和1mL 0.1mol/mL过氧化氢溶液，立即摇匀，放入分光光度计样品池中，并记录初始吸光值，每隔1min记录下吸光值，计时5min，实验结果计算：以1min内A240nm减少0.1为一个酶活力单位(U)。
用冻融后酶活力和冻融前酶活力比值(过氧化氢酶残余活力)来表示抗冻活力，酶残余活力越大，表明待测样品的抗冻活性越大。用相同的方法测定F1和F2两个级分对过氧化氢酶活的低温保护活性。
(2)对大肠杆菌的低温保护活性
将大肠杆菌一级菌液在37℃下培养至OD600为0.8左右，将培养后的菌液用培养液稀释105倍；取100μL稀释菌液于Eppendorf离心管中，再加入900μL 1mg/mL抗冻肽粗提物，振荡混匀后，取100μL混合液于LB培养基中涂布，在37℃下倒置培养20h后计数。剩余菌液在-33℃冰箱放置24h后，再解冻，取100μL解冻后的菌液于LB培养基中涂布，37℃下倒置培养20h后计数。以培养液代替抗冻肽粗提物，测定对照组大肠杆菌的存活数。并用无菌水进行空白对照实验。
用冻融后的大肠杆菌数量与冻融前大肠杆菌数量的比值来表示大肠杆菌存活率。大肠杆菌存活率高则样品对大肠杆菌的低温保护活性高，用相同的方法测定F1和F2两个级分对大肠杆菌的低温保护活性。
(3)热滞活性(THA)的测定
称取5mg冻干的抗冻肽粗提物密封于铝制坩埚内，以空坩埚为参照，以5℃/min的速度从室温降至-40℃，保温1min，再以1℃/min升温至10℃，然后以5℃/min降温至-40℃，保温1min，再以1℃/min升温至样品半熔融状态，此时温度称为保留温度(Th)，以1℃/min降温至-25℃，记录在保留温度下样品开始结晶的温度(T0)。计算样品的热滞活性，计算公式如下：
THA＝Th-T0
用相同的方法测定F1和F2两个级分的热滞活性(THA)。
对过氧化氢酶的低温保护活性测定时，对照组过氧化氢酶活为初始酶活的28.24％，对大肠杆菌的低温保护活性测定时，对照组的大肠杆菌的存活率为0。三种抗冻活性检测方法的实验结果如图2所示：抗冻肽粗提物和凝胶分离所得的F1和F2级分都具有抗冻活性；其中凝胶柱分离所得的各级分抗冻活性差异较大，F2对过氧化氢酶及大肠杆菌的低温保护活性和热滞活性均显著(P<0.05)高于酶解粗产物，而F1的抗冻活性较低。
实施例5
采用UPLC-MS进一步分析F2级分。所采用的色谱实验参数如下：色谱柱为WatersAcquity UPLC BEH C18colum(50×2.1mm,1.7μm)；洗脱的流动相A为去离子水(含0.1％甲酸)，洗脱的流动相B为乙腈；(B)相洗脱程序：0～40min为0～40％，40～42min为40～0％；洗脱流速为0.3mL/min；样品上样量为5μL。
所采用的质谱实验参数如下：电喷雾电离源，正离子模式，扫描分子量范围为100～2000Da；毛细管电压为3000V，锥孔电压为40V，喷雾35psi，脱气温度为350℃，离子源温度为120℃，N2流速为900L/h。
图3为F2级分的高效液相谱图，图中H5峰为抗冻肽His-Val-Arg-Gly-Ala-Phe-Ser-Glu-Glu，His-Val-Arg-Gly-Ala-Phe-Ser-Glu-Glu占F2级分的65.15％。图4为抗冻肽Hi s-Val-Arg-Gly-Ala-Phe-Ser-Glu-Glu的质谱图，其分子离子峰为[M]+1052m/z。
实施例6
鱿鱼皮除杂条件的优化
(1)单因素分析
称取一定量的沥干鱿鱼皮，分别按1:10、1:20、1:30、1:40和1:50的料液比加入2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡24h，每6h更换一次氯化钠溶液，测定不同料液比下杂蛋白和胶原蛋白的溶出率；
称取一定量的沥干鱿鱼皮，按料液比1:20分别加入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡24h，每6h更换一次氯化钠溶液，测定不同氯化钠溶液浓度下杂蛋白和胶原蛋白的溶出率；
称取一定量的沥干鱿鱼皮，按料液比1:20加入2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中分别浸泡6、12、18、24和30h，每6h更换一次氯化钠溶液，测定不同浸泡时间下杂蛋白和胶原蛋白的溶出率；
实验结果表明，杂蛋白溶出率随NaCl浓度的增大而上升；随料液比增大呈先上升后下降的趋势，在料液比为1:20时最高；随时间的延长而上升，在24h后趋于平缓。胶原蛋白溶出率随NaCl浓度和料液比的增大呈先上升后下降的趋势，分别在浓度1mol/L和料液比1:20时达到最高；随处理时间的延长而上升。
(2)正交试验
根据上述的单因素实验结果，综合考虑除杂效果和胶原蛋白损失，选取浸泡时间12、18、24h，NaCl浓度1.5、2、2.5mol/L和料液比1:15、1:20、1:25，进行三因素三水平L9(33)正交试验，优化鱿鱼皮杂蛋白脱除工艺。
表1正交试验结果分析
表2正交试验方差分析
注：*表示在P<0.05差异显著。
实验结果及方差分析见表1、2，各因素对鱿鱼皮中杂蛋白脱除的影响大小依次为：A(时间)>C(料液比)>B(NaCl浓度)，其中A和C对脱除杂蛋白有显著性影响(P<0.05)。根据K值大小，最优除杂条件为A3B3C3，即时间24h，NaCl浓度2.5mol/L，料液比1:25。
实施例7
鱿鱼皮脱脂条件的优化
称取一定量脱杂后的鱿鱼皮，加入异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡，测定鱿鱼皮的脱脂率。根据实验室前期的单因素实验结果，选取浸泡时间12、18、24h，异丙醇浓度5、10、15mol/L和料液比1:10、1:15、1:20，进行三因素三水平L9(33)正交试验，优化鱿鱼皮脱脂工艺。
表3正交试验结果分析
表4正交试验方差分析
注：*表示在P<0.05差异显著。
由表3、4可知，各因素对脱脂效果的影响大小依次为：A(时间)>B(料液比)>C(异丙醇浓度)。由表2-9可知，因素A和B对脱脂率有显著性影响(P<0.05)，C的影响不显著(P>0.05)。根据K值大小，脱脂的最佳条件为A2B2C3，即脱脂时间18h，料液比1:15，异丙醇浓度15％。在此条件下重复试验，脱脂达51.86％。
实施例8
酶解条件的优化
(1)单因素分析
在鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度为1％、加酶量为4000U/g的条件下，分别于30、35、40、45、50℃酶解2h，灭酶，8000r/min离心取上清，测定其对过氧化氢酶的低温保护活性。
在鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度分别为1、2、3、4、5％、加酶量为4000U/g的条件下，于40℃酶解2h，灭酶，8000r/min离心取上清，测定其对过氧化氢酶的低温保护活性。
在鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度分别为1％、加酶量分别为2000、4000、6000、8000、10000U/g的条件下，于40℃酶解2h，灭酶，8000r/min离心取上清，测定其对过氧化氢酶的低温保护活性。
在鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度分别为1％、加酶量为4000U/g的条件下，于40℃分别酶解1、2、3、4、5h，灭酶，离心8000r/min取上清，测定其对过氧化氢酶的低温保护活性。
在不同温度、不同底物浓度、不同加酶量和不同酶解时间下，鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物对过氧化氢酶的低温保护活性的测定结果，如图5-8所示。过氧化氢酶残余活力在酶解温度为40℃时最高，当温度高于40℃后呈下降趋势。随着底物浓度增加，鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽活性呈先上升后下降的趋势，在底物浓度为3％时过氧化氢酶残余活率最高。加酶量和酶解时间对过氧化氢酶残余活力的影响较小，都呈先上升后略有下降的趋势，在酶添加为8000U/g和酶解3h时有最大值。
(2)正交试验
以对过氧化氢酶的低温保护活性高低为指标的单因素实验，并综合考虑水解度，固定酶解温度为40℃，选取底物浓度(A)2、3、4％，加酶量(B)2000、4000、6000U/g和酶解时间(C)2、3、4h，进行三因素三水平L9(33)正交试验优化鱿鱼皮胶原蛋白酶解工艺，正交试验方案见表5。
表5鱿鱼皮胶原蛋白酶解工艺正交实验方案
正交试验结果见表6，方差分析见表7，各因素对大肠杆菌存活率的影响大小依次为：A(底物浓度)>C(酶解时间)>B(加酶量)，其中A底物浓度对大肠杆菌存活率影响最为显著(P<0.05)。根据K值大小，最优条件为A3B3C2，即底物浓度为4％，加酶量为6000U/g，酶解时间为3h。
表6正交试验结果分析
表7正交试验方差分析表
注：*表示在P<0.05差异显著。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 一种海洋源抗冻肽及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Val Arg Gly Ala Phe Ser Glu Glu
1 5
Claims (8)
1.一种海洋源抗冻肽制备物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)鱿鱼皮的前处理
对鱿鱼皮进行脱杂脱脂处理，并将鱿鱼皮上的处理液清洗干净；
(2)鱿鱼皮胶原蛋白的制备
将步骤(1)中清洗后的鱿鱼皮绞碎，再加入缓冲液配制为悬浊液，将悬浊液置于水浴中提取胶原蛋白，提取完成后过滤取滤液，所述滤液冻干得鱿鱼皮胶原蛋白；
(3)鱿鱼皮胶原蛋白酶解
取步骤(2)所得鱿鱼皮胶原蛋白溶于酸性缓冲液中得到胶原蛋白溶液，在所得胶原蛋白溶液中加入酸性蛋白酶进行酶解得酶解液，将酶解液进行灭酶处理后，再离心取上清液；所述酸性缓冲液为pH2-4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述酶解的条件为：所述鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度为2～4w/v％，所述酸性蛋白酶的酶加入量为2000～8000U/g，酶解温度为35-45℃，酶解时长为2～5h；所述灭酶条件为沸水浴20～30min；所述离心条件是8000-12000r/min离心15～25min；
(4)鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的分离
步骤(3)所得上清液通过凝胶柱进行分离纯化；将所述上清液上样到Sephadex G-25凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为0.1～0.5mL/min，在220nm波长处检测，收集各级分。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)的具体过程为：
A:将鱿鱼皮上的杂质剥除，再清洗沥干；
B:称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:20～30加入1～5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡12～36h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
C:称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:10～25加入10～25％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18～24h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(B)的具体过程为：称取步骤(A)所得的沥干鱿鱼皮，按料液比1:25加入2.5mol/L氯化钠溶液，使得鱿鱼皮在氯化钠溶液中浸泡24h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗；
步骤(C)的具体过程为：称取步骤(B)所得的鱿鱼皮，按料液比1:15加入15％异丙醇溶液，使得鱿鱼皮在异丙醇溶液中浸泡18h，浸泡后的鱿鱼皮用蒸馏水清洗。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述缓冲液为pH3-5的柠檬酸缓冲液，所述悬浊液的料液比为1:100～200，所述水浴的温度为60～80℃，时长为6～8h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述缓冲液为pH4的柠檬酸缓冲液，所述悬浊液的料液比为1:100，所述水浴的温度为60℃，时长为8h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述酸性缓冲液为pH3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述酶解的条件为：所述鱿鱼皮胶原蛋白的底物浓度为4％(w/v)，所述酸性蛋白酶的酶加入量为6000U/g，酶解温度为40℃，酶解时长为3h；所述灭酶条件为沸水浴25min；所述离心条件是10000r/min离心20min。
7.一种如权利要求1～6任一所述的制备方法制备得到的海洋源抗冻肽制备物。
8.一种如权利要求7所述海洋源抗冻肽制备物在制备抗冻剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111670272.9A CN114539387B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种海洋源抗冻肽制备物及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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