KR100844386B1 - 오징어 콜라겐으로부터 피부주름 억제활성을 갖는펩타이드를 제조하는 방법 및 그 제조물 - Google Patents

Abstract

우리나라의 오징어의 연간 어획량은 세계 2위인 30~40만톤이며 오징어 껍질의 콜라겐 함량은 15%이상으로 오징어의 가공시 발생하는 부산물을 이용할 필요가 있으며 이 오징어 껍질의 콜라겐을 정제한 활용이 최근 들어 증가하는 추세이다. 하지만 정제한 콜라겐의 직접적인 향장 소재로의 활용은 큰 분자량으로 인하여 경피 흡수율이 효율적이지 않고 대부분이 비수·지용성 물질로서 보습 이외의 향장·생리학적 증진 효과는 높지 않아 이의 개선이 필요한 상황이다.

본 발명은 오징어 콜라겐으로부터 피부주름 억제활성을 갖는 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 종래 산 및 염기에 의한 가수분해시 단점인 장치의 부식문제, 폐수 발생 문제, 효소에 의한 가수분해시 단점인 염의 다량 발생 문제 등을 해결하고 또한 간단한 효소 처리 후 초음파를 병행하여 빠른 시간내에 고수율로 주름억제용 향장소제 펩타이드를 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

오징어 콜라겐으로부터 피부주름 억제활성을 갖는 펩타이드를 제조하는 방법 및 그 제조물{The method of preparing peptide which have activity of repressing skin wrinkles from cuttlefish collagen}

도 1은 피부세포 CCD-986sk에 오징어 유래 펩타이드의 비처리군(A)과 처리군(B)의 형태학적 관찰도이다.

도 2는 오징어 유래 콜라겐과 펩타이드를 첨가한 피부세포에서의 MMP-1의 발현 비교도이다.

도 3은 피부세포에서의 오징어 유래 콜라겐과 펩타이드 첨가에 따른 콜라겐 합성능 비교도이다.

본 발명은 오징어에서 추출한 콜라겐을 초음파처리 및 가수분해하여 주름억제활성 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 오징어 껍질의 콜라겐 함량은 15%이상으로 오징어의 가공 시 발생하는 부산물을 이용할 필요가 있으며 이 오징어 껍질의 콜라겐을 정제한 활용이 최근 들어 증가하는 추세이다. 하지만 정제한 콜라겐의 직접적인 향장 소재로의 활용은 큰 분자량으로 인하여 경피 흡수율이 효율적이지 않고 대부분이 비수·지용성 물질로서 보습 이외의 향장·생리학적 증진 효과는 높지 않아 이의 개선이 필요한 상황이다.

피부 표면의 각질은 일정한 재생주기에 따라 각질층 바깥에서부터 탈락이 이뤄지는데 피부 수분이 부족하거나 각질층 내 지질합성에 이상이 생겨 생리활성 인자들의 활성이 원활하지 못할 경우 각질이 탈락되지 않아 각질세포가 쌓이게 된다. 따라서 피부 표면의 각질들이 감소하였다는 증거는 피부 보습 및 장벽기능이 정상화되었다는 것을 의미하게 된다.

이외에도 피부 노화가 진행됨에 따라 피부 두께가 얇아지고, 자외선 조사에 의해 피부색이 검게 변하며 주름이 생긴다. 이러한 변화를 통해 피부의 연령 및 노화의 정도를 유추할 수 있으므로 피부의 생리학적 관찰을 하는데 중요한 지표가 될 수 있다.

또한 자외선에 노출이 심하게 되면 멜라닌 색소가 피부에 과다하게 침착되어 피부주름이나 피부손상을 초래하게 된다. 최근 이러한 피부 노화 방지와 억제를 위해 또는 손상된 피부를 회복시키기 위해 진피내의 콜라겐의 합성을 촉진하는 물질에 대하여 관심이 증가되고 있다.

피부 노화는 세월이 흘러감에 따라 피할 수 없는 노화 현상이 내인성 노화(intrinsic aging)와 외적 노화(extrinsic aging)로 구분되는데 외적노화는 자외선 같은 여러 가지 환경 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이 하다.

일반적으로 진피증의 약 90%를 차지하고 있는 콜라겐은 피부에 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 따라서 피부내 콜라겐의 감소는 피부의 노화와 매우 밀접한 관계를 가지고 있다.

피부는 자외선 등 외부의 스트레스나 내부의 산화적 손상에 의해 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라겐이 분해가 된다. 콜라겐 분해가 진행됨에 따라 주름이 깊어지고 탄력이 감소되어 피부가 처지거나 표면이 거칠어지는 양상을 보인다. 따라서 콜라겐을 분해하는 효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 생합성을 억제하거나 활성을 저해하는 방식 혹은 항산화, 항노화 물질을 이용하여 피부 세포를 보호하려는 노력을 하고 있다.

펩타이드는 지질대사 촉진 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 들어 다이어트 식품 등에 응용되고 있는 실정이다. 지질 대사 개선기능을 가진 기능성 펩타이드의 원료 단백으로 우유, 어육, 대두 글루텐 등이 사용되고 있다. 누에고치의 가수분해물인 실크 펩타이드는 18종의 아미노산과 펩타이드로 항산화 효과 및 면역 관련 작용을 하며 우유중의 카세인 단백질의 가수분해물이나 펩타이드 등은 칼슘 흡수촉진인자, 혈압강하에 대한 효과 및 면역기능과 위액분비 촉진, 정서 기능, 마취 및 스트레스 감소 등의 opioid peptide로서 작용, 성장 촉진인자 및 항산화인자로 보고 되어왔다.

최근에 이러한 성인질환에 대한 생체 조절 기능을 갖는 펩타이드를 다양한 식품원료의 분해물로부터 분리하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데 특히 우 유, 소의 혈액, 돼지고기, 소고기, 명태, 고등어, 대두, 밀, 보리 등과 같은 식품 단백질에 존재하는 펩타이드는 In vitro에서 효소처리에 의해 생성된 것이 대부분이며 상대적으로 간단한 아미노산 결합으로 구성되지만 뛰어난 생체 조절 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.

그러나, 통상의 펩타이드 제조방법을 활용할 경우, 산 등의 화학물질에 의한 장치의 부식문제가 전혀 발생하지 않으며 중성화과정이 필요없어 중성염 발생으로 인한 후처리 문제가 발생하는 단점이 있다.

이러한 경향을 반영하여 우리나라 주요 수산물인 오징어의 폐기물의 활용하여 콜라겐 단백질보다 부가가치가 높은 제품을 개발하기 위함에 본 발명의 목적이 있다. 오징어 껍질에서 콜라겐 추출 후 이를 저분자화하여 그 생리활성증진을 위한 특성을 비교 검토하여 기초자료로 활용하였다.

본 발명은 상기와 같은 단점을 개선하기 위해 안출된 것으로, 오징어에서 추출한 콜라겐을 초음파처리한 후 콜라겐아제에 의해 가수분해하여 수득된 펩타이드가 콜라겐보다 피부주름 억제 활성이 뛰어나다는 것을 밝혀내었고, 또한 효소처리 전 초음파처리과정을 통해 기존의 펩타이드 제조방법의 단점을 없애고, 빠른 시간에 저분자의 펩타이드 제조가 가능하다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 기존의 펩타이드 제조상 공정에 편의를 주고 그로인해 만들어진 펩타이드에 피부주름 억제로 향장소재로서의 활용을 늘리는데 목적이 있다.

즉, 본 발명은 산 등 장치 부식 물질을 사용하지 않고 공정을 단순화 시키고, 중성염 및 투석 공정을 필요하지 않고 간단히 주름억제 활성을 갖는 펩타이드를 제조할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.

본 발명은 오징어에서 추출한 콜라겐을 초음파추출기를 이용하여 20℃에서 40KHz 초음파로 30분간 처리한 후, 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 상온에서 1시간 가수분해하는 것을 특징으로 하는 피부주름 억제활성을 갖는 펩타이드의 제조방법과 그 방법으로 제조되는 펩타이드로 구성된다.

본 발명에서 콜라겐의 획득 과정은 국내 오징어인 Todarodes pacificus를 재료로 한 일반적인 방법으로 수산화나트륨을 이용하여 비단백질 물질들을 제거하고 과산화수소로 미백화 시켜 순수 콜라겐을 얻었다. 이 시료에 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 1시간 가수분해를 행하고 초음파를 1시간 병행하였다. 그리고 효소를 불활성화 시키기 위하여 5분간 가열하여 여과하였다. 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축 후 진공 동결 건조하여 오징어의 유래 펩타이드 분말을 제조하였다. 이후 기존의 콜라겐과의 비교로서 피부주름 효과를 입증하였다.

본 발명의 구체적인 실시 예는 다음과 같다.

실시예 1. 오징어 유래 콜라겐의 제조

1) 수용성 콜라겐은 국내 어획한 오징어를 살아있는 상태에서 속살을 제거하고 남은 부분인 피부을 채취하였다.

2) 1차로 시료를 찬물로 침수시켜 부피대비 3%의 과산화수소와 0.1N 수산화 나트륨 용액에 중량 대비 20%의 시료를 넣고 12시간씩 진탕한 후 비콜라겐 물질을 없애주는 과정을 3번 반복하였다. 이후 상층액을 모두 버리고 다시 증류수에 중량대비 0.5%의 구연산과 비타민 C를 가용화 하여 변성점 이하인 18℃에서 콜라겐 액을 제조한다.

실시예 2. 실시예 1에서 얻어진 콜라겐의 저분자 펩타이드화

1) 상기에서 얻어진 콜라겐 시료에 초음파 추출기(Asia industry, Kor.)를 이용하여 20℃에서 40KHz의 초음파로 30분간 처리하여 콜라겐 분자들을 물리적 최소 크기로 분해 하였다.

2) 상기에서 얻어진 단일화 된 콜라겐 시료에 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 상온에서 1시간 가수분해를 행하였다.

3) 그리고 효소를 불활성화시키기 위하여 5분간 90℃에서 가열하여 여과하였다. 여과액의 부피를 줄이기 위하여 감압 농축 후 진공 동결 건조하여 오징어의 유래 펩타이드 분말을 제조하였다.

실시예 3. 실시예 2에서 얻어진 저분자 펩타이드의 독성 실험

1) 세포 독성 측정 및 형태학적 관찰

HEL 299 정상 세포에 오징어 껍질에서 추출한 콜라겐과 펩타이드를 0.2mg/ml에서 1.0mg/ml까지 다양한 농도로 처리하고, 48시간 배양한 후 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. 형태학적 결과는 총 4번의 계대 이후 관찰하였다. 세포독성의 결과는 표 1에 나타냈으며, 형태학적 관찰결과는 도 1에 나타내었다.

표 1. 오징어 콜라겐과 오징어 콜라겐 유래 펩타이드의 세포독성

농도(mg/ml)	세포 생존률(% of control)
	콜라겐	펩타이드
0.2	100	101.2
0.4	101.1	99
0.6	101.6	101.06
0.8	99.7	99.3
1.0	96.5	100.2

오징어 콜라겐과 펩타이드를 0.2mg/ml의 농도에서부터 1.0mg/ml의 농도까지 처리하였을 경우 정상 세포인 HEL-299세포의 성장은 전혀 저해되지 않았으며 이는 인체의 세포에 독성이 없음을 나타낸다.

피부세포인 CCD-986sk에 오징어 콜라겐의 펩타이드를 최고농도인 1.0mg/ml로 처리하고 20일간 배양한 결과는 도 1에 나타내었으며, 형태학적으로 이상이 나타나지 않아 위의 세포독성이 없다는 결과를 뒷받침해주는 결과이다.

실시예 4. 실시예 2에서 얻어진 저분자 펩타이드의 피부주름 억제 효과 실험

1) UVA 처리를 이용한 주름 발현 저해 효과

피부세포은 CCD-986sk를 이용하여 UV를 조사하고 원배지로 사용한 DMEM 배지를 제거한 후 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 오징어 유래 콜라겐 추출물을 1mg/ml의 농도로 투여하여 24시간 배양한 후 피부 주름에 관여하는 MMP-1의 발현을 측정하였다. MMP-1 피부 기저층 메트릭스를 분해하여 주름을 만드는 원인물질로서 발현도를 비교하여 주름의 생성 억제능을 밝힐 수 있다. 기존의 물질과의 비교를 위하여 양성 대조군으로 비타민 C를 이용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

콜라겐과 펩타이드를 농도별(0.2-1.0mg/ml)로 처리한 후 UVA 처리군과 비처리군과 양상 대조군인 비타민 C와 비교한 결과로서 비처리 군을 100%로 하였을 때 무시료군에서 130%가 넘는 MMP-1의 발현저해가 나타냈으나 펩타이드를 처리하였을 때는 최고 농도인 1.0ml/ml에서 50%까지 그 발현도가 저해되어 콜라겐보다 피부주름에 긍정적인 효과가 있음을 나타냈다.

2) 콜라겐 합성능피부세포인 CCD-986sk를 24시간 배양한 후 오징어 콜라겐과 펩타이드를 농도별(0.2-1.0mg/ml)로 첨가하여 24시간 배양하여 콜라겐 측정용 kit를 이용하여 콜라겐의 양을 정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

콜라겐 합성이 활발할수록 피부의 탄력과 주름 면에서 긍정적인 영향을 준다고 볼 수 있는데 비처리군의 콜라겐 합성능을 100%라고 하였을 때 피부세포인 CCD-986sk에서 펩타이드를 처리하였을 때 1.0mg/ml의 농도에서 최고 116%의 콜라겐 합성능을 보여 콜라겐 합성에 기존의 콜라겐보다 향상된 효과가 있음을 나타냈다.

본 발명의 펩타이드 제조방법에 의하여 효소처리 전에 초음파의 공동화 현상을 이용하여 콜라겐 분자의 최소화하여 효소 처리 단계에서의 효과를 극대화시켜 단시간에 저분자 펩타이드의 제조가 가능하다.

또한, 본 발명에 의한 펩타이드 제조방법을 활용할 경우 산 등의 화학물질에 의한 장치의 부식 문제가 전혀 발생하지 않을 뿐만 아니라 중성과정이 필요가 없으며 따라서 중성염의 발생으로 인한 후 처리 문제가 없다.

또한, 본 발명으로 만들어진 펩타이드는 오징어 콜라겐보다 피부주름 억제활성이 뛰어나 기존에는 폐기물이었던 오징어 콜라겐의 향장 소재로서의 활용성을 높였다.

Claims (2)

1. 오징어에서 추출한 콜라겐을 초음파추출기를 이용하여 20℃에서 40KHz 초음파로 30분간 처리한 후, 콜라겐아제를 중량대비 0.5% 첨가하여 상온에서 1시간 가수분해하는 것을 특징으로 하는 피부주름 억제활성을 갖는 펩타이드의 제조방법.
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