CN107840873B - 一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法，经过分离纯化获得了一个分子量为36.8 kDa、等电点为6.6的黄芩蛋白，该黄芩蛋白的N‑端一级结构序列为SAVXSKSPEY。该黄芩蛋白的盐溶液在蛋白浓度为1 mg/mL，pH7.5条件下，经过80‑100℃加热60 min后，制备得到黄芩蛋白纳米颗粒，其平均粒径为85.6±2.8 nm。黄芩蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，复溶性好，易于稳定保存。本发明涉及的黄芩蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望作为载体应用于多种药物的体内递送。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
纳米颗粒被大量应用于药物运输体系的开发研究中，其中包括金属聚集体、无机颗粒、超支化聚合物、聚合物胶束等各种不同材料制备的纳米药物载体。各种纳米药物载体有其优点，但也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质（光学、电学、表面活性等）均会呈现与原始材料截然不同的性质。目前应用于纳米药物载体研究的生物大分子（如血清白蛋白、丝蛋白等）皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。而人民多年服用的汤剂的煎煮过程中自组装形成的纳米颗粒的研究可以解决现阶段纳米药物载体研究缺乏研究原型和对安全性担忧方面的问题。
黄芩在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。黄芩性寒、味苦，清热燥湿、泻火解毒、止血安胎，可清肺火，药理作用广泛；黄芩还具有抗氧化、清除自由基作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒、抗炎抗过敏作用和对中枢神经系统的保护等生物学效应，其重要的应用价值，不断引起国内外广泛研究者的重视。但是到目前为止，有关黄芩蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的黄芩蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒存在于各种熬制的“汤”中被广泛服用。本发明得到的黄芩蛋白纳米颗粒体外细胞实验显示了其极低毒性，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好等特点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黄芩蛋白，其N-端一级结构序列为SEQ ID NO:1：SAVXSKSPEY。
所述的黄芩蛋白分子量为36.8 kDa、等电点为6.6。
一种黄芩蛋白的提取方法，经过磷酸盐缓冲液水相抽提，离子交换色谱DEAE、High-S，从黄芩中药饮片中分离得到一个电泳纯的黄芩蛋白。
其具体包括以下步骤：
1）黄芩蛋白粗提液的制备：黄芩饮片经高速粉碎机粉碎，以质量比1:10将黄芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提12 h；用3层纱布过滤得到黄芩浸提液，随后弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经12000g离心15min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向黄芩蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置1 h，以12000rpm离心15min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后， 4 ℃下放置1 h，12000rpm离心15 min，收集沉淀。沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-盐酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0Tris-盐酸缓冲液透析12h，将透析液在12000 rpm，4℃条件下，离心10 min，收集上清液，得到的溶液即为黄芩蛋白粗提液。
2）黄芩蛋白的离子交换色谱二步分离：
a.将50 mL黄芩蛋白初提液加至以0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液平衡常压液相弱阴离子交换色谱DEAE色谱柱以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.01 mol/L、pH7.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。
b.将经DEAE分离且透析过的蛋白组分进一步用Macro-Prep® High-S色谱柱进行分离，60ml加至以0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液平衡Macro-Prep® High-S色谱柱以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH5.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。
3）黄芩蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的黄芩蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该黄芩蛋白的等电点，以Edman degradation测定该黄芩蛋白的N-端一级结构序列。
一种黄芩蛋白纳米颗粒，由所述黄芩蛋白组成，19个黄芩蛋白单体形成一个类球状体的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为85.6±2.8 nm，表面电荷呈负性，范围在-21±3mV。
所述的黄芩蛋白纳米颗粒的制备方法包括：将该黄芩蛋白配制为1 mg/mL的pH7.5盐溶液，经过80-100℃加热1小时，利用分子截留量为100 kDa的超滤离心管进行超滤去除未反应的黄芩蛋白，即获得黄芩蛋白纳米颗粒。应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对黄芩蛋白纳米颗粒进行性质研究，本发明制备得到的黄芩蛋白纳米颗粒平均粒径为85.6±2.8 nm，表面电荷呈负性，zeta电位值为-21±3 mV。自组装率为78.4%。
黄芩蛋白纳米颗粒在体外显示了较低的细胞毒性，并对不同细胞株，如Hep-G2，L02和MDCK、Caco-2显示了不同的细胞亲和性。
所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。
本发明的优点在于：本发明涉及的黄芩蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用黄芩制作的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的黄芩蛋白纳米颗粒除安全高效发挥自身功效外，还有望作为载体应用于多种药物的体内递送。
附图说明
图1黄芩蛋白粗提液离子交换色谱DEAE色谱图。
图2黄芩蛋白粗提液离子交换色谱DEAE各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。
图3黄芩蛋白离子交换色谱High-S色谱图。
图4黄芩蛋白离子交换色谱High-S各色谱峰的SDS-PAGE电泳图，其中M表示为蛋白Maker。
图5黄芩蛋白纳米颗粒的电镜观察图。
图6黄芩蛋白纳米颗粒粒径分布图。
图7黄芩蛋白纳米颗粒细胞毒性，其中L-02为正常肝细胞、Hep-G2人肝癌细胞、MDCK为狗肾上皮细胞、Caco-2为人结肠癌上皮细胞。
具体实施方式
实施例1 ：黄芩蛋白的提取
黄芩蛋白粗提液的制备：黄芩饮片经台式高速粉碎机粉碎，以质量比1:10将黄芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，置于4 ℃，搅拌浸提12 h；用3层纱布过滤得到黄芩浸提液，随后弃去滤渣，将滤液在4 ℃下经12000g离心15min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向黄芩蛋白抽提液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%,待完全溶解后，4℃下静置1 h，以12000rpm离心15min，收集上清液;继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后， 4 ℃下放置1 h，12000rpm离心15 min，收集沉淀。沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-盐酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0Tris-盐酸缓冲液透析12h，将透析液在12000 rpm，4℃条件下，离心10 min，收集上清液，得到的溶液即为黄芩蛋白粗提液。
黄芩蛋白的离子交换色谱分离：
a.将50 mL黄芩蛋白初提液加至以0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液平衡常压液相弱阴离子交换色谱DEAE色谱柱以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.01 mol/L、pH7.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定，见图1和2。
b.将经DEAE分离且透析过的蛋白组分P0进一步用Macro-Prep® High-S色谱柱进行分离，60ml加至以0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液平衡Macro-Prep® High-S色谱柱以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02mol/L、pH5.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定，见图3和4。
黄芩蛋白基本理化性质，其特征为分子量36.8 kDa、等电点为6.6，N-端一级结构序列为SAVXSKSPEY。
实施例2 ：黄芩蛋白纳米颗粒的制备
将该黄芩蛋白配制为1 mg/mL的pH 7.5盐溶液，经过80-100℃加热1小时，利用分子截留量为100 kDa的超滤离心管进行超滤去除未反应的黄芩蛋白，即获得黄芩蛋白纳米颗粒。见图5。
用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其粒径为85.6±2.8 nm，表面电位为-21±3 mV。黄芩蛋白纳米颗粒粒度分布图见图6。
实施例3 ：黄芩蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性测定
采用了正常肝细胞（L-02）、人肝癌细胞（Hep-G2）、人结肠癌上皮细胞（Caco-2）及狗肾上皮细胞（MDCK）测定黄芩蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性。细胞皆使用含20%小牛血清RPMI1640培养液，于37℃，5% CO2培养环境中培养。测定时，细胞按4×104个/mL接于96孔板，200 µL /孔，每组设6个平行孔。培养24小时，弃去培养基，将已倍比稀释后的样品以每孔100 μL量加入。同时加不含血清的培养基100 µL，用做空白对照。继续培养24 h后以MTT法测定细胞增殖率，计算公式如下：
存活率=（A590加样组-A590空白组）/A590空白组×100%。
黄芩蛋白纳米颗粒细胞毒性试验表明，纳米颗粒浓度低于250 ug/mL并不会抑制细胞的增值，并对不同细胞有不同亲和性。仅在浓度250 μg/mL下对L-02、Caco-2有轻微抑制作用，可能是高浓度的纳米颗粒抑制了吸收代谢所致。黄芩蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性见附图7。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工商大学
<120> 一种黄芩蛋白纳米颗粒及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 1
Ser Ala Val Xaa Ser Lys Ser Pro Glu Tyr
1 5 10
Claims (4)
1.一种黄芩蛋白，其特征在于：所述黄芩蛋白的N-端一级结构序列为SAVXSKSPEY；
所述蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
1）黄芩蛋白粗提液的制备：黄芩饮片经高速粉碎机粉碎，以质量比1:10将黄芩粉末和0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，置于4℃，搅拌浸提12h；用3层纱布过滤得到黄芩浸提液，随后弃去滤渣，将滤液在4℃下经12000g离心15min，收集上清液；在4℃磁力搅拌条件下，向上清液中缓慢加入无水硫酸铵，使溶液盐浓度达到20%，待完全溶解后，4℃下静置1h，以12000rpm离心15min，收集上清液；继续向收集的上清液中缓慢加入无水硫酸铵至饱和度为40%，待完全溶解后，于之前同样步骤收集上清液；继续向上清液加入硫酸铵至饱和度为60%，待固体全溶后，4 ℃下放置1 h，12000rpm离心15 min，收集沉淀；沉淀用0.1 mol/L、pH7.5Tris-盐酸缓冲液充分溶解后以相同浓度pH7.0 Tris-盐酸缓冲液透析12h，将透析液在12000 rpm，4℃条件下，离心10 min，收集上清液，得到的溶液即为黄芩蛋白粗提液；
2）黄芩蛋白离子交换色谱二步分离：
a.将50 mL黄芩蛋白粗提液加至以0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液平衡常压液相弱阴离子交换色谱DEAE色谱柱，以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.01 mol/L、pH7.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L、pH7.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；
b.将经DEAE分离且透析过的蛋白组分进一步用Macro-Prep® High-S色谱柱进行分离，取60ml经DEAE分离且透析过的蛋白组分加至以0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液平衡Macro-Prep® High-S色谱柱，以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～1 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH5.0Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱250 mL，最后用含1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L、pH5.0 Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定；
3）黄芩蛋白的基本性质表征：以SDS-PAGE测定该经纯化得到的黄芩蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该黄芩蛋白的等电点，以Edman degradation测定该黄芩蛋白的N-端一级结构序列，所述的黄芩蛋白分子量为36.8kDa、等电点为6.6。
2.一种黄芩蛋白纳米颗粒，其特征在于：所述黄芩蛋白纳米颗粒由权利要求1中所述黄芩蛋白组成，19个黄芩蛋白单体形成一个类球状体的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为85.6±2.8 nm，表面电荷呈负性，范围在-21±3mV。
3.一种如权利要求2所述的一种黄芩蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：将该黄芩蛋白配制为1 mg/mL的pH 7.5盐溶液，经过80-100℃加热1小时，利用分子截留量为100 kDa的超滤离心管进行超滤去除未反应的黄芩蛋白，即获得黄芩蛋白纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种黄芩蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的盐溶液为Tris-盐酸溶液或磷酸盐溶液。
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