CN103408625B - 一种纯化dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纯化DNA的方法。本发明提供了从粗品DNA中精制DNA的方法，包括如下步骤：（1）取粗品DNA，用水溶解并调pH至2.5-5.0，得到质量百分含量为0.5-6.0g/100mL的DNA溶液；（2）将DNA溶液上样于阳离子交换树脂柱并收集流出液；（3）取流出液，加入无机钠盐并使其浓度为0.5-1.5mol/L，调pH至6.5-7.5；（4）取溶液，加入等体积的无水乙醇以沉淀DNA；（5）将DNA沉淀烘干，然后用水溶解，得到质量百分含量为1.0-6.0g/100mL的DNA溶液；（6）将DNA溶液进行干燥，得到DNA精制品。本发明方法简单，成本较低，无有害溶剂，最终可获得纯度>98%、无有机溶剂及小分子核酸片断残留、分子量分布较均一的DNA样品。

Description

一种纯化DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种纯化DNA的方法。

背景技术

目前国内开发的核酸类产品以保健品为主，但颇受争议。大连珍奥核酸（CN1169434），为由豆类提取的小分子核酸（DNA+RNA），辅以维生素、微量元素。安泰核酸（CN1225210），为以猪胰脏酶解制成的小分子DNA及肽类的混合物。正分子核酸，为鲑鱼精DNA，辅以花粉、维生素。日本在核酸功能性食品方面的研发则更为活跃。核酸作为营养保健食品的生产用原料，对纯度要求并不高，目前采用的制备方法多以生物酶解、物理、化学方法为主。

针对多个药物靶点筛选的核酸适体药物已被FDA批准上市。欧美的研究重点集中在采用生化方法制备核酸及其降解产物上：15,000-30,000Da的单链寡DNA（去纤苷）在溶血及内皮细胞保护上表现出了广阔的开发前景，针对肝小静脉闭塞症的临床试验已经开展到Ⅲ期；4,000-10,000Da的单链寡DNA表现了良好的局部抗缺血活性（CN1073448）；最近的研究表明4,000-10,000Da的单链寡DNA和去纤苷在抗恶性肿瘤血管新生方面极具开发潜力，辅助治疗多发性骨髓瘤已进行到Ⅱ期临床试验。这类寡脱氧核苷酸药用分子多采用注射给药，制备原料为动物组织及脏器来源的DNA，对蛋白质残留及分子量分布有较严格的要求。分子量分布在1500-550,000Da的动物来源DNA钠盐的等张溶液可以作为血浆代用品，要求异源蛋白质残留少于1.5%，用于治疗人体严重的急性和慢性损伤，并具有免疫调节作用。哺乳动物脏器提取RNA生产注射剂可用于恶性肿瘤、重症肝炎的辅助治疗。动物脏器经组织匀浆粗提后，为保证蛋白质的去除效果，一般需经苯酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂抽提，毒性较大且不易去除，难以保证终产品安全性。酚仿抽提是分子生物学实验中提纯DNA的主要方法，但并不适用于大规模纯化药用级DNA。工业生产中大规模抽提DNA的通常步骤为：细胞组织匀浆后，用1mol/L氯化钠高盐提取核蛋白、通过碱裂解、生物酶解去杂蛋白，制备的DNA产品可满足保健食品的质量需求，但仍残留有微量杂蛋白及小分子寡核苷酸，不能直接用于制备寡核苷酸药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化DNA的方法。

本发明提供了一种从粗品DNA中精制DNA的方法，包括如下步骤：

（1）取粗品DNA，用水溶解并调pH至2.5-5.0，得到质量百分含量为0.5-6.0g/100mL的DNA溶液；

（2）将步骤（1）得到的DNA溶液上样于阳离子交换树脂柱并收集流出液；

（3）取步骤（2）得到的流出液，加入无机钠盐并使其浓度为0.5-1.5mol/L，调pH至6.5-7.5；

（4）取步骤（3）得到的溶液，加入等体积的无水乙醇以沉淀DNA；

（5）将步骤（4）得到的DNA沉淀烘干，然后用水溶解，得到质量百分含量为1.0-6.0g/100mL的DNA溶液；

（6）将步骤（5）得到的DNA溶液进行干燥，得到DNA精制品（药用级DNA产品）。

所述步骤（1）中，可采用40-70℃（如60℃）搅拌的方式促进粗品DNA的溶解。所述步骤（1）中，具体可用0.5mol/LHCl水溶液调节pH。所述步骤（1）中，所述pH具体可为3.0。所述步骤（1）中具体可将60g粗品DNA用1L去离子水溶解。市售粗品DNA多提取自动物脏器，组织匀浆后，高盐提取、碱裂解等物理、化学方法及生物酶解法虽可以保证去除大多数蛋白质，但仍残留有少量蛋白，尤其是与DNA结合的富含碱性氨基酸的组蛋白及其降解产物。绝大多数蛋白质等电点均高于4.0，调节pH值至3.0，一方面可保证杂蛋白带正电荷，另一方面可保证DNA的稳定性。

所述步骤（2）中，阳离子交换树脂可为氢型阳离子交换树脂或钠型阳离子交换树脂，优选钠型强阳离子交换树脂，更加优选为AmberliteIR-120钠型强阳离子交换树脂。强阳离子交换树脂的交换基团是磺酸基，其离解和交换能力均不随pH变化而变化，故pH值对交换基团的影响基本上不予考虑，弱阳离子交换树脂的工作pH值范围只有5-14。蛋白质色谱行为随pH值变化主要是pH值对蛋白质电荷的影响，即随pH值的降低，蛋白质所带正电荷不断增加。pH值维持在3.0，可保证杂蛋白带大量正电荷，与树脂紧密结合而保证纯化效果。市售粗品DNA含有少量的蛋白质，为此本发明的方法选择性地吸附极少量的杂质，而非目标DNA，可以大大减少树脂用量，降低生产成本。柱床体积/核酸溶液体积≥1/10，核酸溶液与树脂作用时间≥10min。所述阳离子交换层析的相关参数具体如下：填充介质为AmberliteIR-120钠型强阳离子交换树脂，柱子直径为2.6cm，柱床体积为100mL；先用pH3.0、100mmol/L醋酸盐缓冲液平衡柱子至pH稳定，然后以10mL/min的流速上样步骤（1）得到的DNA溶液，收集流出液。

所述步骤（3）中，所述无机钠盐具体可为醋酸钠，所述无机钠盐的浓度具体可为1.0mol/L，所述pH具体可为6.8。醋酸钠浓度为1.0mol/L，即可保证DNA被完全转换为钠盐形式，又可保证后续乙醇沉淀DNA的效果。pH值6.8，可保证沉淀后的DNA再次复溶时pH值接近中性。

所述步骤（4）中，沉淀DNA的条件具体可为室温静置8小时。所述步骤（4）中，还可包括将沉淀获得的DNA进行洗涤的步骤，所述洗涤的步骤具体如下：依次用70%乙醇水溶液洗涤（除盐）和无水乙醇洗涤（脱水）。二倍体积醇沉是常用的DNA沉淀方法，可保证DNA沉淀完全。本发明中选择一倍体积醇沉，可保证大分子DNA完全沉淀，而小分子寡DNA仍存在于上清中而被去除，否则残留的寡DNA将会严重影响血浆代用品的效果及药用寡核苷酸分子的制备。

所述步骤（5）中，还可包括如下步骤：将所述DNA溶液加热至60℃后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。所述步骤（5）中，根据待处理DNA分子量的大小，溶解时选择适宜的DNA浓度。大分子DNA溶液宜降低浓度至1-3%，以保证溶液粘度不至于过高，利于后续干燥工序的传质；小分子DNA溶液则可适当提高浓度至3-6%。

所述步骤（6）中，所述干燥的方法可为冷冻干燥或喷雾干燥。冷冻或喷雾干燥可保证最终产品无乙醇残留，而DNA经醇沉直接烘干，乙醇残留大于3%。

所述粗品DNA可为DNA纯度低于95%的DNA产品。所述粗品DNA具体可为食品级DNA产品。所述食品级DNA产品可为提取自动物、植物或微生物组织的DNA产品，优选提取自动物组织的DNA产品。所述粗品DNA更具体可为DNA纯度低于92%（如91.2%）的鲑鱼精DNA。

本发明的方法可以制备得到可供药用的高纯度、分子量分布均一的大分子DNA钠盐原料，满足其作为血浆代用品及可控降解制备寡核苷酸活性分子的质量要求。本发明提供的方法工艺简单、成本低廉、不涉及有害溶剂，非常适用于市售粗品DNA的精制纯化，制备可供药用的DNA原料。本发明方法简单，成本较低，无有害溶剂，最终可获得纯度>98%、无有机溶剂及小分子核酸片断残留、分子量分布较均一的高纯度DNA样品，满足药用标准要求。

附图说明

图1为两种DNA样品的层析图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。鲑鱼精DNA（食品级）：香港诺瑞可有限公司，Lot#0911191，分子量范围500-80000Da。

实施例1、

1、称取鲑鱼精DNA60g，搅拌状态下加入1L去离子水中，加热至60℃促使DNA完全溶解，然后用0.5mol/LHCl水溶液调节pH值至3.0。

2、将步骤1得到的DNA溶液进行阳离子交换层析。

阳离子交换层析的相关参数：填充介质为AmberliteIR-120钠型强阳离子交换树脂，柱子直径为2.6cm，柱床体积为100mL；先用pH3.0、100mmol/L醋酸盐缓冲液平衡柱子至pH稳定，然后以10mL/min的流速上样步骤1得到的DNA溶液，收集流出液。

3、取步骤2得到的流出液，加入醋酸钠并使其浓度为1.0mol/L，然后用0.5mol/LNaOH水溶液调节pH值至6.8，搅拌状态下缓慢加入等体积无水乙醇，室温静置8小时，收集沉淀，用70%乙醇水溶液洗涤（除盐），然后用无水乙醇洗涤（脱水）后烘干。

4、将步骤3得到的粉末溶于600mL纯化水，加热至60℃后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液并进行冷冻干燥，得到36g粉末，即为纯化后的DNA，将其命名为DNA精制品。

鲑鱼精DNA与DNA精制品的质量比对结果见表1。

表1鲑鱼精DNA与DNA精制品的质量比对结果

DNA样品	纯度	颜色	蛋白质残留	寡DNA含量	乙醇残留
						鲑鱼精DNA	91.2%	类白色	5.2%	15%	3.1%
DNA精制品	99.1%	类白色	0.7%	无	无

DNA样品的纯度采用定磷法检测，参考文献：吴春敏,龚蜜.定磷法测定复方制剂中核酸含量[J].中国生化药物杂志,1997,18(1):44-45。结果表明，采用本发明提供的方法进行精制后，DNA纯度大大增加。

DNA样品中的蛋白质残留采用BCA法检测，具体采用碧云天生物技术研究所的试剂盒并按试剂盒说明书进行。结果表明，采用本发明提供的方法进行精制后，蛋白质残留量大大降低。

DNA样品中的寡DNA含量采用凝胶过滤层析检测。色谱柱：TSKG4000SW，300×7.5mm；以刚性的13μm球型硅胶为基质，表面通过共价键偶联亲水基团。采用pH6.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速为0.7ml/min。用于上样的DNA样品液中的DNA浓度为1.0mg/mL，上样体积为20μL。柱温为35℃。检测波长为260nm。两种DNA样品的层析图谱见图1，a为鲑鱼精DNA（虚线框内的为寡DNA），b为DNA精制品。结果表明，采用本发明提供的方法进行精制后，寡DNA被完全去除。

DNA样品中的乙醇残留采用中国药典三部附录ⅥD康卫皿扩散法检测。结果表明，采用本发明提供的方法进行精制后，乙醇被完全去除。

对比例1、

1、同实施例1的步骤1。

2、同实施例1的步骤2。

3、取步骤2得到的流出液，加入醋酸钠并使其浓度为1.0mol/L，然后用0.5mol/LNaOH水溶液调节pH值至6.8，搅拌状态下缓慢加入2倍体积的无水乙醇，室温静置8小时，收集沉淀，用70%乙醇水溶液洗涤（除盐），然后用无水乙醇洗涤（脱水）后烘干。

4、将步骤3得到的粉末溶于600mL纯化水，加热至60℃后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液并进行冷冻干燥，得到粉末，即为纯化后的DNA，将其命名为DNA精制品。鲑鱼精DNA与DNA精制品的质量比对结果见表2。

表2鲑鱼精DNA与DNA精制品的质量比对结果

DNA样品	纯度	颜色	蛋白质残留	寡DNA含量	乙醇残留
						鲑鱼精DNA	91.2%	类白色	5.2%	15%
DNA精制品	99.1%	类白色	0.7%	15%	无

对比例2、

用“80℃烘干24小时”代替实施例1的步骤4中的“冷冻干燥”，其它同实施例1，DNA精制品的乙醇残留为3.1%。

Claims (10)

1.一种从粗品DNA中精制DNA的方法，包括如下步骤：

(1)取粗品DNA，用水溶解并调pH至2.5-5.0，得到质量百分含量为0.5-6.0g/100mL的DNA溶液；

(2)将步骤(1)得到的DNA溶液上样于阳离子交换树脂柱并收集流出液；

(3)取步骤(2)得到的流出液，加入无机钠盐并使其浓度为0.5-1.5mol/L，调pH至6.5-7.5；

(4)取步骤(3)得到的溶液，加入等体积的无水乙醇以沉淀DNA；

(5)将步骤(4)得到的DNA沉淀烘干，然后用水溶解，得到质量百分含量为1.0-6.0g/100mL的DNA溶液；

(6)将步骤(5)得到的DNA溶液进行干燥，得到DNA精制品；

所述粗品DNA提取自动物组织的DNA产品；所述粗品DNA为DNA纯度低于95％的DNA产品；

所述步骤(2)中柱床体积/所述DNA溶液体积≥1/10，DNA溶液与树脂作用时间≥10min；

所述步骤(6)中，所述干燥的方法为冷冻干燥或喷雾干燥。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用40-70℃搅拌的方式促进所述粗品DNA的溶解。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述pH为3.0。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述阳离子交换树脂为氢型阳离子交换树脂或钠型阳离子交换树脂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述钠型阳离子交换树脂为钠型强阳离子交换树脂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述钠型强阳离子交换树脂为AmberliteIR-120钠型强阳离子交换树脂。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述无机钠盐为醋酸钠。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述无机钠盐的浓度为1.0mol/L。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述pH为6.8。

10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，沉淀DNA的条件为室温静置8小时。