CN1480531A - 一种质粒提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的质粒提纯方法，其特征为使用经除DNA酶处理的粗制胰蛋白酶和阳离子交换树脂柱层析纯化质粒；本发明的提纯方法得到的质粒无RNA和DNA污染；由于提纯过程不使用酚、氯仿、异戊醇等有毒有害物品，提取过程中所产生的副产物全部可以加工为产品，完全没有环境污染问题；经过简单放大即可达到工业生产的规模。

Description

一种质粒提纯方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的能适合工业生产规模的质粒提纯方法。

背景技术

随着疾病的基因治疗研究的进展，以质粒作为载体将基因药物导入患者体内的方法受到了广泛的关注。质粒是一类经过人工改造的能在生物体内复制增殖的环状DNA。它们可以通过用限制性内切酶酶解和连接酶连接的方法，将各种外源的基因或cDNA加载(克隆)上去，而这些克隆的基因当随质粒进入生物体后，就可表达出所编码的蛋白质，释放入生物细胞而发挥功能。因此，在治疗遗传病或带遗传倾向的疾病如癌时，就可利用克隆了适当基因的质粒，作为治疗药物，补充细胞所缺少的基因，从而起到治疗作用。因此，大规模生产质粒，就成为将来医药工业所可能面临的任务。

目前国外的几家大制药公司已经发展出了工业规模的质粒生产能力，最高可达到一次从3500升细菌培养物中提取100克纯质粒(Breul A，MüllerM et al.，治療藥としてのブラスミド DNAの開發：大量生産の視点からの考察，细胞33(6)：28-31，2001)。但这些公司为了自己的商业利益，对这些方法严格保密，只对外招揽纯化质粒的服务；当然，价格非常昂贵。

而目前已知的质粒生产方法的工艺流程大致如图1所示，由于生产过程中使用的十二烷基硫酸钠(SDS)、异丙醇、酚、氯仿、氯化铯、溴乙锭(EB)均为有毒有害物质，EB还是致癌物，因而往往会带来比较严重的环境污染问题；且生产过程中细菌培养液、细菌残体等也因含有有毒有害物质而不能再利用，这显然是一种资源的浪费。因此，我们有必要研究自己的具有自主知识产权的质粒大规模提纯方法。

发明内容

本发明的目的在于改进现有的质粒提纯方法，使其能够放大到工业生产的规模。

为达到这一目的，本发明的质粒提纯方法采用如下步骤：1、用经去除DNA酶的胰酶除去质粒粗制剂中的蛋白和降解RNA；2、用阳离子交换树脂柱层析纯化质粒。

更具体的，本发明的质粒提纯方法包括：1、用离心或过滤的方法除去培养物的液体，得到膏状的菌体；在4℃冷室中，将菌体悬浮于2.5升预冷至4℃的20mmol/L pH8的Na₂HPO₄缓冲液中，加2.5升的0.2mol/LNaOH/0.5％吐温-20，搅拌使成半透明的粘稠液，放置10min，再加10升7.5mol/L NH₄Ac，缓缓搅拌20min，过滤，弃去沉淀，合并上清；加2倍体积的无水乙醇，在冷室过夜；次日，吸出并离心除去上清，沉淀溶于500mlTE，加去除DNA酶的胰酶溶液至0.1mg/ml，再加EDTA溶液至10mmol/L，在搅拌下加热到37℃，保温2hr；然后离心弃去沉淀，上清加NaCl至0.3mol/L，加1200ml无水乙醇，在冰中或冷室放置2hr后离心，弃去上清，沉淀溶于400ml冰冷的TE，4℃存放；

2、将上述步骤最后得到的质粒粗制品溶液用2N NaOH调pH到12-13，室温放置30min，再用1mol/L Tris-HCl缓冲液调pH至7-8；上样后，用柱平衡液洗脱；分部收集各紫外吸收峰，取样浓缩。

用本发明的提纯方法得到的质粒经凝胶电泳分析无RNA和DNA污染。此外，本发明的质粒提纯方法没有采用如实验室所用的酚、氯仿等有毒有害试剂，且本法所产生的废液和废渣等全部可以再利用，创造附加产值，因此本法完全没有环境污染问题。本发明的质粒提纯方法所产生的废物和废水可综合利用：本法步骤(1)中所产生的细菌培养上清液无毒，并含有丰富的含氮、磷、钾、钠等元素的化合物，经适当浓缩和灭菌后可做肥料；本法步骤(2)中所产生的细菌固体废物，是细菌的残体，无毒，含丰富的蛋白质、DNA和类脂等营养物，经加热灭菌、用水浸泡除去过多的盐类、干燥、粉碎后，可作为高效的饲料添加剂，也可用作肥料；本法各步产生的含乙醇的废液，不含有毒有害物质，经过适当稀释，即可达到国家规定的排放标准；本法中产生的浸泡液，主要含乙酸铵等无机物，无毒，可单独或与上述细菌培养废液混合后用作肥料。

附图说明

图1为常用的质粒生产方法的流程图；

图2为本发明的质粒生产方法的流程图；

图3为用本发明的提纯方法得到的质粒的凝胶电泳照片，其中0为DNA分子量标准，即λ噬菌体DNA的Hind III酶切片段；1、2为pBR322质粒DNA，分子量为4.3kb；3为p14-6质粒DNA，分子量为5.6kb。

具体实施方式

以下通过具体实施方式，对本发明的质粒提纯方法作进一步说明。质粒提取的实验室规模通常为200～400ml，本发明以15升培养物为例，以使其适应工业生产的规模。实施例1、质粒从细菌体内的提取

用离心或过滤的方法除去培养物的液体，得到膏状的菌体；在4℃冷室中，将菌体悬浮于2.5升预冷至4℃的20mmol/L pH8的Na₂HPO₄缓冲液中，加2.5升的0.2mol/L NaOH/0.5％吐温-20，搅拌使成半透明的粘稠液，放置10min，再加10升7.5mol/L NH₄Ac，缓缓搅拌20min，过滤，弃去沉淀，合并上清。加2倍体积的无水乙醇(约25升)，在冷室过夜。次日，吸出并离心除去上清，沉淀溶于500ml 10mmol/L Tris-HCl/1mmol/L EDTA(TE)，加去除DNA酶(将酶液pH调至3，100℃水浴加热20min，再将pH调到7)的胰酶溶液至0.1mg/ml，再加EDTA溶液至10mmol/L，在搅拌下加热到37℃，保温2hr。然后离心弃去沉淀，上清加NaCl至0.3mol/L，加1200ml无水乙醇，在冰中或冷室放置2hr后离心，弃去上清，沉淀溶于约400ml冰冷的TE，存放4℃，尽快上柱层析。实施例2、质粒的柱层析纯化

在室温进行。采用国产D001或相当型号的大孔阳离子交换树脂。  按生产厂说明进行预处理，然后用TE或加有同样浓度EDTA的Na₂HPO₄缓冲液平衡。柱体积应为质粒粗抽提液的10倍左右。在柱出口处连接紫外检测仪，可通过平行支管连接。步骤(2)最后得到的质粒粗制品溶液用2 N NaOH调pH到12-13，室温放置30min，再用1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7)调pH至7-8。如出现沉淀，过滤除去。上样后，用柱平衡液洗脱。分部收集各紫外吸收峰，取样浓缩，上1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。质粒通常位于第一峰。如此时质粒不够纯，可用2倍体积的无水乙醇和0.3mol/L NaCl(最终浓度)沉淀后溶于较小体积(40ml)的上柱缓冲液，用较小体积、较长长度(柱体积400ml，柱长1m)的同样柱再提纯一次。实施例3、质粒凝胶电泳

提取的质粒溶于TE至约500μg/ml，用1％含1μg/ml溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×Tris硼酸缓冲液，电压100V，电泳半小时。结果如图3所示，由图可知，用本发明的提纯方法得到的质粒为单带，无RNA和DNA污染。

Claims (5)

1、一种质粒提纯方法，其特征在于包括以下步骤：(1)、用经去除DNA酶的胰酶除去质粒粗制剂中的蛋白和降解RNA；(2)、用阳离子交换树脂柱层析纯化质粒。

2、如权利要求1所述的质粒提纯方法，其特征在于步骤(1)包括：

用离心或过滤的方法除去培养物的液体，得到膏状的菌体；在4℃冷室中，将菌体悬浮于2.5升预冷至4℃的20mmol/L pH8的Na₂HBO₄缓冲液中，加2.5升的0.2mol/L NaOH/0.5％吐温-20，搅拌使成半透明的粘稠液，放置10min，再加10升7.5mol/L NH₄Ac，缓缓搅拌20min，过滤，弃去沉淀，合并上清；加2倍体积的无水乙醇，在冷室过夜；次日，吸出并离心除去上清，沉淀溶于500ml TE，加去除DNA酶的胰酶溶液至0.1mg/ml，再加EDTA溶液至10mmol/L，在搅拌下加热到37℃，保温2 hr；然后离心弃去沉淀，上清加NaCl至0.3mol/L，加1200ml无水乙醇，在冰中或冷室放置2hr后离心，弃去上清，沉淀溶于400ml冰冷的TE，4℃存放。

3、如权利要求1所述的质粒提纯方法，其特征在于步骤(2)包括：

将步骤(1)最后得到的质粒粗制品溶液用2N NaOH调pH到12-13，室温放置30min，再用1mol/L Tris-HCl缓冲液调pH至7-8；上样后，用柱平衡液洗脱；分部收集各紫外吸收峰，取样浓缩。

4、如权利要求3所述的质粒提纯方法，其特征在于如得到的质粒不够纯，可用2倍体积的无水乙醇和0.3mol/L NaCl沉淀后溶于上柱缓冲液再提纯一次。

5、如权利要求3所述的质粒提纯方法，其特征在于阳离子交换树脂柱采用国产D001或相当型号的大孔阳离子交换树脂，先预处理，然后用TE或加有同样浓度EDTA的Na₂HPO₄缓冲液平衡；柱体积应为质粒粗抽提液的10倍左右；在柱出口处连接紫外检测仪。

Images