CN101831423A - 一种提取动物组织总rna的试剂和提取方法 - Google Patents

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高爱保
王兰
袁慧
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Abstract

本发明提供了一种提取动物组织总RNA的试剂，其组分按重量份数计：胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸钠0.1-0.3份，苯酚5-10份，灭菌蒸馏水100份；冰醋酸调节pH至5-6。本发明提供了一种提取动物组织总RNA的方法，使用Li离子和异丙醇沉淀总RNA。整个过程操作简单，成本低，获得RNA纯度高，稳定性好。

Description

一种提取动物组织总RNA的试剂和提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术，具体涉及一种提取动物组织总RNA的试剂和提取方法。
背景技术
RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学研究技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。许多分子生物技术包括RNA作图，Northern印迹、核酸酶保护试验、PT-PCR(reversetranscription polymerase chain reaction)、real time PCR、cDNA文库构建等实验的成效在很大程度上取决于RNA的质量。由于RNA不稳定，所以提取时比DNA面临更多的困难。实验成功与否的关键是有无RNA酶的污染。在提取RNA时，最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力，因此，创造一个无RNA酶的环境，严格防止RNA酶污染是成功提取RNA的关键。
生物组织、细胞RNA的提取是目前分子生物学研究的基本方法之一。由于自然界大量存在RNA酶，RNA的提取产物极易降解。因此，如何快速提取RNA并防止RNA降解一直是分子生物学研究要解决的难题。有的动物组织如螃蟹肝胰腺组织中含大量内源酶，极易使RNA降解，用本试剂提取的RNA产量高、稳定性好、纯度高。市场上的RNA提取试剂盒(如TRIzol)极其昂贵，给普通分子实验带来了巨大的成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、稳定性好的提取动物组织总RNA的试剂和提取方法。
本发明提供的一种提取动物组织总RNA的试剂，组分按重量份数计：胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸钠0.1-0.3份，苯酚5-10份，灭菌蒸馏水100份；冰醋酸调节pH至5-6。-20℃-4℃保存，有效期为1-2年。
本发明提供的一种动物组织总RNA提取方法，包括如下步骤：
将上述试剂加入高温灭菌离心管，按组织与试剂重量比1∶8-10，将组织加入离心管中，冰浴匀浆，直至无颗粒透明状，室温静置5-20分钟；10000-13000rmp离心2-5min，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3以上体积的氯仿，震荡混匀；10000-13000rmp离心2-5min，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的10M LiCL(或20％Li2SO4)和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，静置10-20min；10000-13000rmp离心2-5min，回收沉淀，用75％的乙醇洗涤得总RNA，-80℃保存。
用本发明试剂提取动物组织总RNA操作过程简单，时间短，成本低，总RNA产品纯度高，稳定性好。
附图说明
图1用本试剂提取长江华溪蟹组织总RNA琼脂糖电泳图
具体实施方式
实施例1：
将胍乙酸40g、十二烷基硫酸钠0.1g、苯酚5g和灭菌蒸馏水100g混合均匀，用冰醋酸调节PH值至5.5。
实施例2：
将胍乙酸350g，十二烷基硫酸钠2g、苯酚60g和灭菌蒸馏水1000g混合均匀，用冰醋酸调节PH值至5。
下面为使用本发明提取试剂提取总RNA的实施例：
实施例3：
将实施例1的试剂450μl加入经高温灭菌的离心管，将螃蟹鳃组织50mg加入离心管中，冰浴匀浆，直至无颗粒透明状，室温静置10分钟；10000rmp离心2min，吸出上清，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3体积的氯仿，震荡混匀；10000rmp离心3min，吸出上清，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的20％Li2SO4和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-80℃静置10min。10000rmp离心2min，回收沉淀，用75％的乙醇洗涤沉淀得总RNA。
上述总RNA沉淀溶于100μl无RNA酶的水中。
电泳检测：电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液1L中加入3g乙酸胍，取5μl总RNA溶液，加6×RNA上样缓冲液1.5μl，1％琼脂糖甲醛凝胶80V电泳检测，见图1。
用分光光度计检测总RNA溶液，测得的OD260/OD280的比值在1.8～2.0，RNA的浓度＝(OD260-OD280)×40μg/ml×稀释倍数，计算得出每克组织中提取出总RNA 1.2mg。
实施例4：
取实施例2的试剂100μl，加入10mg螃蟹肝胰腺组织匀浆，室温静置10分钟；13000rmp离心2min，吸出上清，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3体积的氯仿，震荡混匀；13000rmp离心3min，吸出上清，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的20％Li2SO4和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-80℃静置15min。10000rmp离心2min，回收沉淀；用75％的乙醇洗涤沉淀。用分光光度计检测，每克组织中提取出总RNA 0.9mg。
实施例5：
取实施例1的试剂100μl，加入10mg鲤鱼肌肉组织匀浆，室温静置10分钟；13000rmp离心2min，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3体积的氯仿，震荡混匀；13000rmp离心2min，吸出上清，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的10M LiCL和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-80℃静置15min。10000rmp离心3min，回收沉淀；用75％的乙醇洗涤沉淀。用分光光度计检测，每克组织中提取出总RNA 1mg。
实施例6：
取实施例1的试剂100μl，加入10mg绵羊耳组织匀浆，室温静置10分钟；13000rmp离心2min，吸出上清，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3体积的氯仿，震荡混匀；13000rmp离心2min，吸出上清，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的10MLiCL和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-80℃静置15min。10000rmp离心3min，回收沉淀；用75％的乙醇洗涤沉淀。用分光光度计检测，每克组织中提取出总RNA 0.9mg。

Claims (3)

1.一种提取动物组织总RNA的试剂，其特征在于，组分按重量份数计：胍乙酸30-40份，十二烷基硫酸钠0.1-0.3份，苯酚5-10份，灭菌蒸馏水100份；冰醋酸调节pH至5-6。
2.一种动物组织总RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的试剂加入高温灭菌离心管，按组织与试剂重量比1∶8-10，将组织加入离心管中，冰浴匀浆，直至无颗粒透明状，室温静置5-20分钟；10000-13000rmp离心2-5min，将上清液转移至另一离心管中；加入上清液1/3以上体积的氯仿，震荡混匀；10000-13000rmp离心2-5min，将上清液转移至第三离心管中；加入上清液1/2体积的10M LiCL和1/2体积的冰冻异丙醇，充分混匀，-20℃静置10-20min；10000-13000rmp离心2-5min，回收沉淀，用75％的乙醇洗涤得总RNA，-80℃保存。
3.权利要求2所述的动物组织总RNA提取方法，其特征在于，所述的10M LiCL用20％Li2SO4代替。
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