CN1220995A - 总rna提取试剂及其制造方法以及提取总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核糖核酸(RNA)技术领域,涉及一种总RNA提取试剂及其制造方法以及提取总RNA的方法。该提取试剂以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料,以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂,柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节pH值,以消毒双蒸水和苯酚作为溶剂来制取。用本发明的总RNA提取试剂提取RNA操作过程简单、操作时间短、提取的RNA质量略优于进口的TRIzol试剂,生产成本低。
Description
本发明属于核糖核酸(RNA)技术领域，涉及一种总RNA提取试剂及其制造方法以及提取总RNA的方法。
核糖核酸即RNA是细胞内基因表达的产物，细胞RNA的提取是目前分子生物学研究方法之一。由于自然界和实验室都存在大量的RNA酶，因此RNA的提取产物极易降解，给实验带来较大困难。因此如何快速提取RNA并防止RNA的降解而使之储存较长的时间，一直是分子生物学研究人员要解决一个难题。现有的提取RNA的技术有：1、氯化铯硫氰酸胍法：该方法操作复杂，要求超速离心24小时(十万转/分钟)，且时间太长，现已淘汰不用。2、氯化锂硫氰酸胍法：该方法操作时间长达24小时，时间太长，也已淘汰不用。3、酸性硫氰酸胍法(一步法)：该方法操作简化，时间缩短到4小时，在时间上大大缩短了，但对于提取多个样本，时间还太长，故现大部分已被TRI zol RNA试剂法取代。4、TRIzol RNA试剂法：这是美国生命技术公司在酸性硫氰酸胍法(一步法)基础上开发的产品，以苯酚硫氰酸胍混合而成的一种提取试剂。采用该试剂提取时间由4小时缩短到1小时左右。但采用该方法还存在以下不足：RNA的提取产量偏低，有时RNA部分降解，操作时间仍然偏长。《国外医学·遗传学分册》杂志在95年第18期上登载一篇文章“TRI zol：一种适于一步分离RNA的新试剂”，对TRI zol试剂和使用情况作了介绍。
本发明的目的是要提供一种能使提取总RNA(同时含rRNA、tRNA、mRNA)的时间更短、制作简单、提取效率更高的总RNA提取试剂及其制造方法以及操作更简单快速的提取总RNA的方法。
本发明的目的是用以下方式来实现的。本发明的总RNA提取试剂含有RNA酶的高效抑制剂、去垢剂、PH调节剂、溶剂，高效抑制有异硫氰酸胍、溶剂为双蒸水和苯酚，还有盐酸胍作为高效抑制剂，所含原料的比例(重量百分比)为：异硫氰酸胍15-45％、盐酸胍1-20％、去垢剂0.2-0.7％、双蒸水10-35％、苯酚12-46％、PH调节剂0.005-0.02％。去垢剂可采用十二烷基肌胺酸钠和十二烷硫酸钠，其用量分别为十二烷基肌胺酸钠0.12-0.35％、十二烷基硫酸钠0.1-0.31％。PH调节剂为柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸，其用量为柠檬酸三钠0.001-0.005％、醋酸钠0.005-0.01％、适量冰醋酸。另外，本提取试剂中，还含有巯基乙醇作为抗氧化剂。
本发明用于总RNA提取试剂的制造方法，是以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料，辅以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂，柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节PH值，以巯基乙醇作为抗氧化剂，以消毒双蒸水(经焦碳酸二乙酯预处理)为溶剂之一，先按以下比例(重量百分比)：异硫氰酸胍15-45％、盐酸胍1-20％、去垢剂0.2-0.7％、十二烷基胺酸钠0.12-0.35％、十二烷基硫酸钠0.1-0.31％、柠檬酸三钠0.001-0.005％、醋酸钠0.005-0.01％、消毒双蒸水10-35％，在45℃温度下混合溶解平衡0.1-2小时，再加入12-46％(或以上原料体积的0.5-1.5倍)的重蒸苯酚，室温冷却至2℃-30℃，用适量冰醋酸调至PH3.5-6.5，此即为总RNA提取试剂成品，储存于-70℃-+25℃，有效期长达1-3年。下面为用本发明制造总RNA提取试剂的非限定实施例：
实施例1：取异硫氰酸胍45份、盐酸胍20份、十二烷基肌胺酸钠0.35份、十二烷基硫酸钠0.31份、柠檬酸三钠0.005份、醋酸钠0.01份、消毒双蒸水10份(都为重量份)，在70℃温度下溶解平衡2小时，加入1.5倍体积的重蒸苯酚，室温冷却至30℃，用冰醋酸调至PH6.5。此即为总RNA提取试剂成品。储存于+25℃中，有效期可长达1年。
实施例2：取硫氰酸胍15份、盐酸胍1份、十二烷基肌胺酸钠0.12份、十二烷基硫酸钠0.1份、柠檬酸三钠0.001份、醋酸钠0.005份、消毒双蒸水35份(都为重量份)，在45℃温度下混合溶解平衡0.1小时，加入0.5倍体积的重蒸苯酚，室温冷却至2℃，用冰醋酸调至PH3.5。此即得到总RNA提取试剂成品。储存于-70中，有效期可长达三年。
本发明使用以上制造出的总RNA提取试剂来提取总RNA的方法，其提取步骤如下：
1、按1ml总RNA提取试剂加入到用于提取总RNA的组织如50-100mg组织块(冰上匀浆)或10cm2的贴壁培养细胞或105-107的悬浮细胞中的比例混合，然后转入Eppendorf管，
2、加0.1ml氯仿、异戊醇的混合液〔氯仿∶异戊醇=(24-49)∶1〕振荡10秒种，进行翠取，
3、10000g离心，10分钟，在4℃温度。
4、取上层水相转入新的Eppendorf管(注意不要吸取界面)，
5、加等体积的-20--80℃预冷的异丙醇颠摇10秒钟，
6、10000g离心、10分钟、在4℃温度，
7、去上清液，得白色沉淀即总RNA，
8、加1ml75％酒精冲洗RNA沉淀，
9、弃酒精，气干或真空干燥5分钟，
10、加适量RNA保护剂溶解RNA，低温储藏备用。
下面为本发明使用总RNA提取试剂提取总RNA的非限定实施例：
实施例3：取本发明的总RNA提取试剂成品0.1毫升，加入10毫克组织或105个细胞中，破碎组织细胞，保护RNA，以氯仿、异戊醇按24∶1比例进行翠取分离RNA、以-70℃预先冷却的异丙醇沉淀RNA。加1ml75％酒精冲洗RNA沉淀(去掉盐分和残留的异丙醇)弃酒精，气干(自然干燥)，加适量RNA保护剂溶解RNA，低温储藏备用。
实施例4：取本发明的总RNA提取试剂成品1.5毫升，加入1克组织或107个细胞中，破碎组织细胞，保护RNA，以氯仿、异戊醇按49∶1比例进行翠取分离RNA。以-20℃预先冷却的异丙醇沉淀RNA。加0.5ml75％酒精冲洗RNA沉淀，弃酒精，真空干燥5分钟，加适量RNA保护剂溶解RNA，低温储藏备用。
用本发明的总RNA提取试剂来提取总RNA操作过程简单，操作时间短(约30-40分钟)，提取的RNA质量略优于进口的TRI zol试剂，生产成本低。
Claims (6)
1、一种总RNA提取试剂，含有RNA酶的高效抑制剂、去垢剂、抗氧化剂、PH调节剂、溶剂，高效抑制剂有异硫氰酸胍、溶剂为双蒸水和苯酚，其特征在于还有盐酸胍作为高效抑制剂，所含原料的比例(重量百分比)为：异硫氰酸胍15-45％、盐酸胍1-20％、去垢剂0.2-0.7％、消毒双蒸水10-35％、苯酚12％-46％、PH调节剂0.005-0.02％。
2、根据权利要求1所述的总RNA提取试剂，其特征在于去垢剂为十二烷基肌胺酸钠和十二烷硫酸钠，其用量分别为十二烷基肌胺酸钠0.12-0.35％、十二烷基硫酸钠0.1-0.31％。
3、根据权利要求1或2所述的总RNA提取试剂，其特征在于PH调节剂为柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸，其用量为柠檬酸三钠0.001-0.005％、醋酸钠0.005-0.01％，适量冰醋酸。
4、根据权利要求3所述的总RNA提取试剂，其特征在于用巯基乙醇作为抗氧化剂，用量为0.2-0.5％。
5、一种用于权利要求1所述的总RNA提取试剂的制造方法，是以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料，辅以十二烷基肌胺酸钠、十二烷基硫酸钠两种去垢剂，柠檬酸三钠、醋酸钠和冰醋酸提供盐分和调节PH值，以巯基乙醇作为抗氧化剂，以消毒双蒸水(经焦碳酸二乙酯预处理)为溶剂之一，先按以下比例(重量百分比)：异硫氰酸胍15-45％、盐酸胍1-20％、去垢剂0.2-0.7％、十二烷基胺酸钠0.12-0.35％、十二烷基硫酸钠0.1-0.31％、柠檬酸三钠0.001-0.005％、醋酸钠0.005-0.01％、消毒双蒸水10-35％，在45℃温度下混合溶解平衡0.1-2小时，再加入12-46％(或以上原料体积的0.5-1.5倍)的重蒸苯酚，室温冷却至2℃-30℃，用适量冰醋酸调至PH3.5-6.5，此即为总RNA提取试剂成品，储存于-70℃-+25℃。
6、一种使用权利要求1所述的总RNA提取试剂来提取总RNA的方法，其提取步骤如下：
①、按1ml总RNA提取试剂加入到用于提取总RNA的组织如50-100mg组织块(冰上匀浆)或10cm2的贴壁培养细胞或105-107的悬浮细胞中的比例混合，然后转入Eppendorf管，
②、加0.1ml氯仿、异戊醇的混合液〔氯仿∶异戊醇=(24-49)∶1〕振荡10秒种，进行翠取，
③、10000g离心，10分钟，在4℃温度，
④、取上层水相转入新的Eppendorf管(注意不要吸取界面)，
⑤、加等体积的-20--80℃预冷的异丙醇颠摇10秒钟，
⑥、10000g离心、10分钟、在4℃温度，
⑦、去上清液，得白色沉淀即总RNA，
⑧、加1ml75％酒精冲法RNA沉淀，
⑨、弃酒精，气干或真空干燥5分钟。
⑩、加适量RNA保护剂溶解RNA，低温储藏备用。
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| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |