CN101735297B - 一种植物低分子量rna的快速提取方法 - Google Patents

一种植物低分子量rna的快速提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物低分子量RNA的快速提取方法，在破碎细胞后，基因组DNA和大分子量RNA分别与蛋白质形成DNA-蛋白质复合物和RNA-蛋白复合物，这些DNA-蛋白复合物和RNA-蛋白复合物在酸性、低盐环境中不溶解，可以通过酸酚抽提去除。低分子量RNA则留在上清溶液中，可以通过乙醇或异丙醇沉淀回收。该提取方法快速、高效，经过酚抽提后只需一步沉淀就可以回收低分子量RNA。该方法提取的低分子量RNA纯度高，可用于低分子量RNA的克隆和Northern印迹杂交检测。本发明实验过程简单快速，适合各种植物组织的低分子量RNA提取。

Description

一种植物低分子量RNA的快速提取方法
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取低RNA的方法，具体的说涉及一种低分子量RNA的快速提取方法，适用于绝大多数植物组织的低分子量RNA的提取。
背景技术
目前，低分子量RNA(low molecular weight RNA，LMW RNA)是指细胞中分子量较小、碱基数较少的一类RNA分子，主要包括长度为20-24个核苷酸长度的小干涉RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、转运RNA(tRNA)和5S RNA等。这些RNA在细胞活动过程中扮演了非常重要的作用，特别是siRNA和miRNA对于基因表达的调控是目前的研究热点。
低分子量RNA的提取是其研究的一项基础性工作。常规的低分子量RNA提取方法一般分2步：先分离总RNA，再从总RNA中分离出低分子量RNA。主要有两种策略：经典策略是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)从总RNA中分离纯化低分子量RNA，该方法分离过程繁琐复杂，得率低。第二种策略就是在破碎细胞、去除细胞碎片和蛋白质后，用氯化锂、聚乙二醇(PEG)等沉淀去除大分子量RNA和基因组DNA，再用醇沉淀回收低分子量RNA。但这种方法也需要经过多次的低温沉淀和高速离心，低分子量RNA损失较大，且提取过程较长，容易出现RNA降解。
无论采用上述哪种策略，其第一步都是破碎植物组织、细胞，将全部核酸从细胞中释放出来。由于植物组织中有大量的内源RNA酶，因此需要将RNA酶完全抑制住，避免RNA的降解。这一步中往往使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、异硫氰酸胍等强烈去污剂，一方面帮助打开细胞，另一方面抑制RNA酶。另外，乙二胺四乙酸(EDTA)也是经常使用的RNA酶抑制剂。由于植物组织中常常含有丰富的多糖、多酚等代谢物质，不利于RNA的分离纯化，因此，在这一步中还经常使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、β-巯基乙醇(β-ME)等去除多糖，抑制多酚氧化酶，以提取较高纯度的RNA。
对于低分子量RNA的提取，不仅要求无RNA酶降解、无多酚多糖等污染，还要求没有DNA、高分子量RNA残留。因此需要采用各种方法将DNA、高分子量RNA去除干净，而且还尽量减少低分子量RNA的损失。常规方法通过分级分离的方法，经过数次沉淀才能提取比较纯净的分子量RNA，而且还有被降解的风险。
发明内容
本发明正是为了解决上述技术问题而设计的一种植物中低分子量RNA的快速提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种植物低分子量RNA的快速提取方法，提取缓冲液配比为：2％PVP、2％CTAB、0.1M至0.6M醋酸钠、25mM EDTA、2％的β-ME，提取缓冲液pH值范围是4.0-8.0；植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步骤实现：
①将提取缓冲液于65℃预热30分钟；
②取植物新鲜的组织样品，于液氮中迅速研磨成粉末；
③按每1mL提取缓冲液中0.1g新鲜样品的比例，将磨好的样品粉末迅速转移到提取缓冲液中，于65℃水浴20分钟，其间不断震荡；
④冰上冷却后，加入等体积的配比为25:24:1的水饱和酚:氯仿:异戊醇，混匀，剧烈涡漩1-2分钟，于4℃，20000g离心5分钟；
⑤取上清，加入等体积配比为24:1的氯仿:异戊醇，剧烈混匀后，于4℃，20000g离心5分钟；
⑥取上清，加入等体积异丙醇，混匀后冰上放置10分钟后，于4℃，20000g离心20分钟；
⑦弃上清，用80％酒精洗涤2次，超净台上放置至乙醇完全挥发；
⑧用20μl DEPC水充分溶解RNA，—70℃低温保存。
所述提取缓冲液使用低浓度盐为0.1至0.6M的醋酸钠溶液。
所述提取缓冲液pH值为5.2。
本发明的有益效果是提供了一种全新的低分子量RNA提取方法，其核心思想是在0.1～0.6M的NaAC低盐环境中沉淀、去除DNA和高分子量RNA，再通过醇沉淀回收低分子量RNA。根据分光光度分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，表明提取的的分子量RNA完整性好、纯度高、提取产率大。本发明实验过程简单快速，适合各种植物组织的低分子量RNA提取。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
一种植物低分子量RNA的快速提取方法，提取缓冲液配比为：2％PVP、2％CTAB、0.1M至0.6M醋酸钠、25mM EDTA、2％的β-ME，提取缓冲液pH值范围是4.0-8.0。
本实例中使用的植物组织是新鲜、幼嫩的番木瓜、拟南芥、木薯和橡胶树的叶片。
植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步骤实现：
①将提取缓冲液于65℃预热30分钟；
②取植物新鲜的组织样品，于液氮中迅速研磨成粉末；
③按每1mL提取缓冲液中0.1g新鲜样品的比例，将磨好的样品粉末迅速转移到提取缓冲液中，于65℃水浴20分钟，其间不断震荡；
④冰上冷却后，加入等体积的配比为25:24:1的水饱和酚:氯仿:异戊醇，混匀，剧烈涡漩1-2分钟，于4℃，20000g离心5分钟；
⑤取上清，加入等体积配比为24:1的氯仿:异戊醇，剧烈混匀后，于4℃，20000g离心5分钟；
⑥取上清，加入等体积异丙醇，混匀后冰上放置10分钟后，于4℃，20000g离心20分钟；
⑦弃上清，用80％酒精洗涤2次，超净台上放置至乙醇完全挥发；
⑧用20μl DEPC水充分溶解RNA，—70℃低温保存。
所述提取缓冲液使用低浓度盐为0.1至0.6M的醋酸钠溶液。
所述提取缓冲液pH值为5.2。
本发明提供了一种快速、高效的低分子量RNA提取方法，其基本原理是:在破碎细胞后，基因组DNA和大分子量RNA分别与蛋白质形成DNA-蛋白质复合物和RNA-蛋白复合物，这些DNA-蛋白复合物和RNA-蛋白复合物在酸性、低盐环境中不溶解，可以通过酸酚抽提去除。低分子量RNA则留在上清溶液中，可以通过乙醇或异丙醇沉淀回收。该提取方法快速、高效，经过酚抽提后只需一步沉淀就可以回收低分子量RNA。该方法提取的低分子量RNA纯度高，可用于低分子量RNA的克隆和Northern印迹杂交检测。
常规的低分子量RNA提取通常采用分步抽提的方法，依次从细胞抽提液中除去蛋白质、DNA、高分子量RNA等，最后再通过异丙醇等沉淀回收小RNA，步骤多而且繁琐，一方面降低了低分子量RNA的得率，另一方面增加了RNA降解的几率。因此，我们发明了一种小RNA的快速提取方法，其核心部分是在0.1-0.6M的低浓度醋酸钠(NaAC)缓冲液中，DNA和大分子量RNA分别与蛋白质结合形成不溶的DNA-蛋白复合物以及RNA-蛋白复合物，通过酚/氯仿抽提除去这些DNA-蛋白复合物和RNA-蛋白复合物后，即可从上清液中沉淀回收低分子量的RNA。该方法简便快速，适用于各种组织材料的提取。
由于DNA和RNA在不同浓度的盐溶液中溶解度不同，因此不同醋酸钠盐浓度的提取缓冲液的提取效果差别很大。通过测试不同材料，在0.4M的浓度下，多数植物材料都可以高效的提取低分子量RNA，然而，由于各组织内的缓冲环境不同，部分材料可能会出现基因组DNA和大分子量RNA残留，可以通过降低NaAC浓度的方法来去除。如在无菌培养基上生长的拟南芥幼苗的最合适NaAC浓度是0.3M，而在土壤中培养的拟南芥叶片则需要0.4M NaAC；对于薄荷、三角梅等植物叶片，0.1M的NaAC已经足够，稍高一些就会有DNA残留；而对于橡胶树幼嫩叶片，0.4～0.6M的浓度都可以提取出干净的低分子量RNA。
另外，提取缓冲液的pH值也会影响到提取效果。通过本方法，提取缓冲液的pH在4.0～8.0之间都可以有效的提取出低分子量RNA，但pH在5.2时提取效果最好，因此采用pH5.2的NaAC缓冲体系。
由于植物组织都含有内源RNA酶以及多糖、多酚类物质，因此提取缓冲液中还添加了2％的CTAB以及EDTA等RNA酶抑制剂，并在提取缓冲液中添加2％PVP和2％的β-巯基乙醇(β-ME)，从而有效的防止褐化。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下得出的其他任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于：提取缓冲液配比为：2％PVP、2％CTAB、0.1M至0.6M醋酸钠、25mM EDTA、2％的β-ME，提取缓冲液pH值范围是4.0-8.0；植物中低分子量RNA的提取方法是按如下步骤实现：
①将提取缓冲液于65℃预热30分钟；
②取植物新鲜的组织样品，于液氮中迅速研磨成粉末；
③按每1mL提取缓冲液中0.1g新鲜样品的比例，将磨好的样品粉末迅速转移到提取缓冲液中，于65℃水浴20分钟，其间不断震荡；
④冰上冷却后，加入等体积的配比为25:24:1的水饱和酚:氯仿:异戊醇，混匀，剧烈涡漩1-2分钟，于4℃，20000g离心5分钟；
⑤取上清，加入等体积配比为24:1的氯仿:异戊醇，剧烈混匀后，于4℃，20000g离心5分钟；
⑥取上清，加入等体积异丙醇，混匀后冰上放置10分钟后，于4℃，20000g离心20分钟；
⑦弃上清，用80％酒精洗涤2次，超净台上放置至乙醇完全挥发；
⑧用20μl DEPC水充分溶解RNA，—70℃低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于：提取缓冲液使用低浓度盐为0.1至0.6M的醋酸钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种植物低分子量RNA的快速提取方法，其特征在于：提取缓冲液pH值为5.2。
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