CN111718928A - 一种黄精叶绿体dna提取优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于以黄精叶片为材料，用高盐低pH法分离叶绿体，SDS法提取叶绿体基因组DNA（cpDNA），并通过L9（33）正交试验，以缓冲液中的NaCl浓度、叶片用量及去核离心力为考察因素，优化黄精cpDNA提取工艺。结果表明，当缓冲液中NaCl浓度为1.50 mol/L，叶片用量为10 g，去核离心力为600 g时，提取的cpDNA没有核基因组污染，质量好，产率高，为该实验的最适条件。该方法简便快速，对实验仪器要求不高，成本低，产率高，能够为黄精属植物cpDNA的提取提供参考。
Description
一、技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种黄精叶绿体DNA提取优化方法。
二、背景技术
叶绿体是绿色植物进行光合作用的关键场所，具有相对独立的遗传物质-即叶绿体基因组DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)。高等植物叶绿体基因组大多数在120-160kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。Hans和Walter于1962年证实了叶绿体基因组的存在\。1986年，首次报道了烟草(Nicotiana tabacum)、地钱((Marchantiapolymorpha)的叶绿体基因组全序列。近年来，随着高通量测序技术在叶绿体全基因组测序中的广泛应用，叶绿体全序列基因组的数量急剧增加。然而，由于传统的提取方法难以在叶绿体DNA的质量和产量之间取得平衡，高效的cpDNA提取技术成为制约其应用的主要瓶颈。
叶绿体基因组因其在基因含量和结构上具有特殊的保守性，为全基因组进化研究提供了充分的信息。许多研究已经证明了其在解决不同分类层次的系统发育关系以及利用叶绿体全基因组序列了解结构和功能进化方面的潜力。目前分离植物叶绿体的方法主要有以下三种：蔗糖密度梯度离心法、Percoll密度梯度离心法和高盐低pH法。现有研究表明，高盐低pH法因其具有操作简单，成本低，产率高等优点而得到广泛应用，目前已成功应用于小麦、松柏、茶树、割手密、尾叶桉、芒果、甘薯等多种植物。
黄精中多糖、多酚等次生物质含量较高，影响其cpDNA提取的质量。目前对于黄精cpDNA提取方法还未见报道。本研究通过借鉴其他高等植物cpDNA的提取方法，通过正交试验，初步筛选出适合黄精cpDNA提取的方案，为黄精高质量cpDNA提取和叶绿体基因组功能研究奠定基础。
三、发明内容
技术问题
为了快速、有效地获得黄精cpDNA，本发明采用高盐低pH法，并结合黄精本身的生物学特性进行研究，成功获得了质量好，产率高，无核基因组污染的cpDNA，为黄精属植物高质量cpDNA提取和叶绿体基因组功能研究奠定了基础。
技术方案
本发明所述的黄精叶绿体DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用正交试验优化叶绿体分离：将黄精叶片黑暗处理，用液氮研磨，加入缓冲液A，混匀，过滤，收集滤液，进行第一次离心，取上清；对上清液进行第二次离心，保留沉淀；向沉淀中加入缓冲液B，混匀，进行第三次离心，保留沉淀，重复此步骤，即得纯化的黄精叶绿体。
(2)裂解叶绿体：向步骤(1)中的叶绿体加入缓冲液C和蛋白酶K，混匀，37℃温育4-5h。
(3)提取叶绿体DNA：将步骤(2)中的裂解混合溶液先用Tris饱和酚抽提，再用氯仿-异戊醇多次抽提；加入异丙醇，于-20℃沉淀DNA；离心，溶解，加入RNase，37℃孵育30min-60min，即得叶绿体DNA。
所述步骤(1)中，选取缓冲液中NaCl浓度、叶片用量、去核离心力为考察因素，采用正交试验进行优化，筛选黄精叶绿体分离的最佳条件；其中，缓冲液中NaCl浓度为1.25-1.75mol/L、叶片用量为5-15g、去核离心力为200-600g。
所述步骤(1)中黄精叶片的处理方法是：将叶片置于4℃黑暗处理24-48h以消化叶片中的淀粉。所述的过滤方法是：利用6-8层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中。
所述步骤(1)中第一次离心温度为4℃，转速为200-600g，时间为8min；第二次离心和第三次离心温度为4℃，转速为2500g，时间为12min。
所述缓冲液A的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，0.25mmol/L抗坏血酸，1.5％PVP，pH＝3.6；
所述缓冲液B的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.1％牛血清蛋白BSA，pH＝8.0；
所述缓冲液C的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，2.0％SDS，pH＝8.0。
所述黄精叶绿体分离的最佳条件为：缓冲液中NaCl浓度为1.50mmol/L，叶片用量为10g，去核离心力为600g。
所述步骤(3)中氯仿-异戊醇的体积比为(23-25)：1；所述离心条件为：4℃下12000g离心10-15min。
所述实验操作均在冰上进行，实验所用的试剂、仪器等都需进行预冷处理。
有益效果
本发明通过高盐低pH法可以快速、有效地获得黄精cpDNA，提取的cpDNA电泳条带完整单一，无拖尾现象，无核DNA的污染，可用于基因克隆等后续分子实验。该方法简单易行，成本低，产率高，能够为黄精属植物高质量cpDNA提取和叶绿体基因组结构、功能的研究奠定基础。
附图说明
图1黄精叶绿体DNA电泳检测。
M：DL15000 Marker，1-9：各试验号所提取的cpDNA。
图2叶绿体基因组特异性引物ITSWF4对cpDNA的扩增结果。
M：DL2000 Marker，1-9：以各试验号提取的cpDNA为模版得到的扩增产物。
图3核基因组特异性引物SX10对cpDNA的扩增结果。
M：DL2000 Marker，1-9：以各试验号提取的cpDNA为模版得到的扩增产物。其中1、5、9的去核离心力为200g，2、6、7的去核离心力为400g，3、4、8的去核离心力为600g。
五、具体实施方法
结合具体实例来进一步说明本发明，但并不对其内容做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1材料与方法
1.1供试材料
多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)，采自千岛湖黄精基地。
1.2实施例所用缓冲液的组分及配比
缓冲液A(pH＝3.6)：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，0.25mmol/L抗坏血酸，1.5％(w/v)PVP；
缓冲液B(pH＝8.0)：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.1％(w/v)牛血清蛋白BSA；
缓冲液C(pH＝8.0)：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，2.0％(w/v)SDS。
其中，DTT和牛血清蛋白BSA需现用现加。
1.3试验方法
1.3.1正交试验设计
选择缓冲液中的NaCl浓度、叶片用量及去核离心力为考察因素，进行L9(33)的正交试验，各因素的水平设计如表1。
表1正交试验设计表
1.3.2黄精叶绿体分离
所有实验操作均在冰上进行，实验所用的试剂、仪器等都需进行预冷处理。
(1)黄精新鲜叶片用无菌水洗净，滤纸吸干水分，纱布包裹，置于4℃冰箱黑暗处理24-48h。
(2)称取适量黄精叶片，用液氮快速充分研磨，加入50mL预冷的缓冲液A，充分混匀，用6层纱布过滤，收集滤液，置于新的50mL离心管中。
(3)4℃下200g、400g或600g离心8min，小心移取上清液于新的50mL离心管中。
(4)4℃下2500g离心12min，弃上清，保留沉淀。
(5)向沉淀中加入25mL预冷的缓冲液B，小心充分悬浮沉淀，4℃下2500g离心12min，弃上清，保留沉淀。
(6)重复上一步骤，所得绿色沉淀即为纯化的黄精叶绿体。
1.3.3黄精叶绿体裂解
向步骤(6)中得到的叶绿体加入1mL预冷的缓冲液C，悬浮沉淀，再加入20μL10mg/mL的蛋白酶K(使其终浓度为20μg/mL)，充分混匀，水浴锅中37℃温育4h，期间摇晃混匀多次，使叶绿体充分裂解，释放DNA。
1.3.4黄精cpDNA提取
(1)向上述溶液中加入1mL Tris饱和酚，上下充分混匀，4℃下12000g离心10min，取上清。
(2)加入1mL氯仿-异戊醇(24：1)，上下充分混匀，4℃下12000g离心10min，取上清。重复此步直至界面抽提干净。
(3)加入70％体积的异丙醇，充分混匀，置于-20℃冰箱沉淀1h。
(4)在4℃下12000g离心10min，去上清，得cpDNA沉淀。
(5)沉淀用75％乙醇和无水乙醇分别洗涤两次，室温干燥。
(6)沉淀溶于50μL无菌水中，加入1μL RNase，37℃孵育30min，降解RNA杂质。将cpDNA置于-20℃冰箱保存备用。
1.3.5黄精cpDNA质量和电泳检测
利用Thermo NanoDrop2000核酸微量测定仪检测黄精cpDNA浓度和纯度；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳，电压120V电泳30min，检测cpDNA的质量。
1.3.6叶绿体特异性引物和核特异性引物PCR扩增
利用Primer5.0软件设计引物，根据黄精叶绿体的trnV-atpE基因间隔区序列设计叶绿体特异性引物ITSWF4，根据黄精转录组数据Cluster-61548.194409序列设计核特异性引物SX10。利用叶绿体特异性引物ITSWF4和核特异性引物SX10对提取的cpDNA进行PCR扩增，检测其中是否存在核基因组污染。
PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix(Biomed)5μL，正向/反向引物各0.2μL，DNA模板(50ng/μL)1μL，ddH2O 3.6μL。总反应体系10μL。
PCR反应程序：94℃变性3min；94℃变性30s，Tm退火30s，72℃1kb/min，35个循环；72℃延伸5min。其中，引物ITSWF4的退火温度为55℃，延伸时间为40s；引物SX10的退火温度为60℃，延伸时间为30s。
表2叶绿体特异性引物和核特异性引物及其序列
2结果与分析
2.1黄精cpDNA电泳检测
采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，提取的cpDNA条带清晰单一，无拖尾现象，无明显的降解现象，说明提取的DNA样品质量较好，能够用于后续基因克隆等分子实验(图1)。
2.2黄精cpDNA质量检测
利用Thermo NanoDrop2000核酸微量测定仪测定cpDNA浓度及纯度，试验号4、5、9提取的cpDNA的OD260/280在1.7-1.8之间，表明其cpDNA质量较好，其他试验号提取的cpDNA的OD260/280略低于1.7，存在极少量的蛋白质、酚类污染(表3)。
表3黄精cpDNA质量检测
2.3黄精cpDNA的PCR扩增
以提取的黄精cpDNA为模板，黄精总DNA作为对照，PCR扩增叶绿体编码的trnV-atpE基因间隔区序列，结果显示所有模板都可以扩增出清晰、亮度高的条带，且片段长度在547bp左右(图2)。
以提取的黄精cpDNA为模板，黄精总DNA作为对照，用核特异性引物SX10进行PCR扩增，结果显示试验号1，5，9可以扩增出条带，片段长度在270bp左右，与核基因组PCR扩增产物一致。说明当去核离心力为200g时，提取的cpDNA中存在核DNA污染。其他试验号未扩增出条带，说明当去核离心力为400g、600g时，细胞核的DNA已去除干净，提取的cpDNA中不存在核DNA污染(图3)。
2.4正交试验结果分析
从表4中可以看出，极差RC＞RA＞RB，表明去核离心力对试验结果的影响最大，其次为缓冲液中NaCl浓度和叶片用量。从表5方差分析可知，去核离心力对cpDNA提取具有显著影响(P＜0.05)。由此可知，各因素的最优水平分别为A2，B2，C1。但去核离心力为200g时，以提取的cpDNA为模板，可以扩增出核基因片段(图3)，表明该离心力不能完全分离核DNA，提取的cpDNA中存在核DNA污染。当去核离心力为400g、600g时，以提取的cpDNA为模板，仅扩增出叶绿体基因片段但不能扩增出核基因片段(图2和图3)，表明cpDNA中的核DNA已去除干净。综合分析，A2B2C3为较优水平组合，此时缓冲液中NaCl的浓度为1.50mol/L，叶片用量为10g，去核离心力为600g，由此获得的cpDNA浓度为503.1ng/μL，产率为2.515μg/g。
表4正交试验结果
表5正交试验方差分析表
本发明的黄精叶绿体DNA提取优化方法已经通过具体的实例进行了描述，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用正交试验优化黄精叶绿体分离：将黄精叶片黑暗处理，用液氮研磨，加入缓冲液A，混匀，过滤，收集滤液，进行第一次离心，取上清；对上清液进行第二次离心，保留沉淀；向沉淀中加入缓冲液B，混匀，进行第三次离心，保留沉淀，重复此步骤，即得纯化的黄精叶绿体。
(2)裂解叶绿体：向步骤(1)中的叶绿体加入缓冲液C和蛋白酶K，混匀，37℃温育4-5h。
(3)提取叶绿体DNA：将步骤(2)中的裂解混合溶液先用Tris饱和酚抽提，再用氯仿-异戊醇多次抽提；加入异丙醇，于-20℃沉淀DNA；离心，溶解，加入RNase，37℃孵育30min-60min，即得叶绿体DNA。
2.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中选取缓冲液中NaCl浓度、叶片用量、去核离心力为考察因素，采用正交试验进行优化，筛选黄精叶绿体分离的最佳条件；其中，缓冲液中NaCl浓度为1.25-1.75mol/L、叶片用量为5-15g、去核离心力为200-600g。
3.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中黄精叶片的处理方法是：将叶片置于4℃黑暗处理24-48h以消化叶片中的淀粉。所述的过滤方法是：利用6-8层纱布过滤匀浆至预冷的烧杯中。
4.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(1)中第一次离心温度为4℃，转速为200-600g，时间为8-12min；第二次离心和第三次离心温度为4℃，转速为2500g，时间为12-20min。
5.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述缓冲液A的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，0.25mmol/L抗坏血酸，1.5％PVP，pH＝3.6。
6.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述缓冲液B的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.1％牛血清蛋白BSA，pH＝8.0。
7.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述缓冲液C 的组分及配比如下：1.25-1.75mol/L NaCl，50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，2.0％SDS，pH＝8.0。
8.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：步骤(1)所述黄精叶绿体分离的最佳条件为：缓冲液中NaCl浓度为1.50mol/L，叶片用量为10g，去核离心力为600g。
9.如权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法，其特征在于：所述步骤(3)中氯仿-异戊醇的体积比为(23-25)：1；所述离心条件为：4℃下12000g离心10-15min。
10.权利要求1所述的黄精叶绿体DNA提取优化方法或权利要求2-9任一项所述的方法在黄精叶绿体DNA提取中的用途。
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