CN101914522A

CN101914522A - 红树植物dna的提取方法

Info

Publication number: CN101914522A
Application number: CN2010101074485A
Authority: CN
Inventors: 陈少波; 丁文勇; 仇建标; 陈骁; 刘伟成; 艾为明; 谢起浪; 李尚鲁; 王成义; 王广银; 郑春芳; 池伟; 黄丽
Original assignee: Zhejiang Mariculture Research Institute
Current assignee: Zhejiang Mariculture Research Institute
Priority date: 2010-01-30
Filing date: 2010-01-30
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明涉及红树植物的DNA提取方法，包括以下步骤：(1)、取叶片研磨，加入预热的2％CTAB提取液溶解，然后加入2％体积的PVP；(2)、温浴后加入少量RNase保温，再加入氯仿-异戊醇混合液后，常温下高速离心；(3)、取上清液转入离心管，加入预热的2％CTAB提取液，再加入氯仿-异戊醇混合液混合后，常温下高速离心；(4)、取上清液再转入离心管，加入NaCl溶液，并加入冰冷异丙醇混合后，低温条件下放置沉淀DNA；(5)、低温下高速离心，弃上清液，回收沉淀，用乙醇洗涤风干后加入TE缓冲液，置于低温下保存，本发明能有效除去DNA提取过程中产生的多糖和单宁，得到的红树植物DNA含量大、纯度高。

Description

红树植物DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种植物DNA的提取方法，具体来说，是针对富含多糖和单宁酸的红树植物的DNA提取方法。

背景技术

红树林(mangrove)是一种稀有的木本胎生植物，生长于热带和亚热带陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。全世界的红树林植物有23科、34属、81种，我国红树林共有13科、24种，主要分布在海南、广东和福建沿海。由于红树林生长在陆海交界处，是陆地的天然屏障，对减少台风等自然灾害造成的破坏有重要的意义；红树林生态系统还具有吸收积累重金属元素、清除有机氯农药改善环境质量的作用；能净化水体过滤陆地径流和内陆带出的有机物质和污染物，降解污染物；在多样性保护方面，它为许多海洋动物、鸟类提供栖息和觅食的理想生境，保护生物多样性和防治病虫害，素有“海底森林”、“水上绿洲”和“潮汐森林”之称，其生物资源量非常丰富，是至今世界上少数几个物种最多样化的生态系统之一。同时，红树林生态系统还具有生态旅游、科学研究、文化教育等重要价值。另外，红树林植物还是重要的化工原料及药物来源。

随着科学技术的发展以及人们对生态环境保护意识的加强，红树林生态系统也越来越成为人们研究和开发的热点，分子水平上对红树林植物的研究也越来越多。但是，由于红树植物的特殊性，分子水平上的研究也存在一些难点，其中之一就是红树植物的DNA提取，原因在于：红树植物因其富含单宁酸而出名，其细胞壁含有大量的单宁和多糖等物质，在核酸提取过程中，大量的单宁和多糖的存在，使得其与DNA形成共沉淀，从而影响了核酸的纯度，虽然一般陆地植物的DNA提取方法已经非常成熟，如常见的有经典的CTAB法、SDS法等，而这些方法不能很好地处理多糖的问题，从而不能得到较纯的DNA，目前国内外最常采用的除多糖的方法是采用经典的CsCl超速离心的方法，但此方法对实验设备和操作技术要求较高，而且花费较高，另外也有研究人员采用诸如柱过滤等纯化方法，虽然较好地纯化了基因组DNA，但在纯化过程中易造成基因组DNA的损失和断裂，不能够满足如酶切连接等对DNA具有高要求的操作，另外，对于DNA提取过程中如何除去单宁的方法报道甚少；若要进一步开展种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究，由于需要处理的实验样品较多，对于以上所采用的物理或化学方法，其烦琐、昂贵的缺陷更加显得不利于实验研究的进行，而对于对DNA具有高要求的操作如分子克隆、转基因等更是无法顺利进行。

发明内容

针对红树林植物DNA提取过程中存在的单宁和多糖等杂质含量过高而带来的诸多不便，本发明提供一种可提取高质量的全基因组DNA，并且经济、简便、易行、快速的红树植物DNA的提取方法。

本发明所提供的红树植物DNA的提取方法，包括以下步骤：

(1)、取叶片用液氮充分研磨成粉末，加入预热的2％CTAB提取液溶解，然后加入2％体积的PVP；

(2)、在55℃～65℃下温浴45min～90min，加入少量RNase，37℃保温1小时～2小时，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液混合后，常温下高速离心；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液混合后，常温下高速离心；

(4)、取上清液再转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇混合后，低温条件下放置90min以上沉淀DNA；

(5)、低温下高速离心，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤2～4次，风干后加入TE缓冲液，置于低温下保存。

上述步骤(1)和步骤(3)所使用的2％CTAB提取液包括2％CTAB、0.1mol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及1％的β-巯基乙醇，所述TrisHCl的PH值为8.0。

上述2％CTAB提取液所包含的各试剂分别是：CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是阳离子表面活性剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物；TrisHCl即三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，提供一个pH值缓冲环境，具有缓冲pH值作用；EDTA即乙二胺四乙酸，是金属螯合剂，可螯合镁离子或锰离子，抑制DNA酶的活性；1.4mol/L的NaCl提供高盐环境，使核酸充分溶解；β-巯基乙醇是抗氧化剂，能有效防止酚氧化成为醌，避免褐变，有利于酚的去除。

上述步骤(1)中所使用的PVP即聚乙烯吡咯烷酮，是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚类物质，减少DNA中酚的污染；同时能与多糖结合，能有效去除多糖。

上述步骤(2)所使用的Rnase即RNA酶，用于催化降解其中的RNA。

上述步骤(2)和步骤(3)抽提时所使用的氯仿-异戊醇混合液，其氯仿与异戊醇可设为24∶1的最佳剂量配比。

上述步骤(5)中所使用的TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0。

本发明的红树植物DNA的提取方法的优点在于：

1、在步骤(1)中加入了2％体积的PVP，PVP是一种抗氧化剂，能与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚类物质，这对于含有较多酚类物质的干制材料具有非常明显的除酚作用，从而能够有效地减少提取DNA过程中酚的污染，并且PVP能与多糖集合，对于含有大量多糖和单宁类物质的红树植物，能够起到非常有效祛除多糖的效果；

2、在步骤(2)中所加入的Rnase即RNA酶，能够有效充分地去除RNA，从而使得提取的DNA纯度更高，也能避免了RNA对后续实验的干扰；

3、步骤(3)在步骤(2)的第一次抽提之后再进行二次抽提，能够进一步提高DNA的纯度，并保证后续程序的可靠性；

4、在步骤(2)与步骤(3)进行抽提时所加入的氯仿-异戊醇混合液，氯仿可使蛋白质变性，并有助于液相和有机相的分离，而异戊醇则可以消除抽提过程中出现的气泡。

5、在步骤(4)中所添加的5mol/L的NaCl溶液，可有效创造更高的高盐环境，尤其对于含有大量多糖和单宁的红树植物而言，可有效地溶解多糖，避免提取因得到的DNA呈现凝胶状而对后续实验造成很大的影响，加入2/3体积的冰冷异丙醇则能够有效地防止多糖的沉淀，以保证DNA纯度，冰冷异丙醇配合NaCl溶液使用能增强红树植物提取过程的DNA中多糖杂质的祛除效果。

6、步骤(5)使用的TE缓冲液中含有的EDTA可抑制DNA酶的活性，并且TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有保护作用，使DNA更好的保存。

7、DNA的提取操作过程用时少，全部完成约为8个小时。

上述技术方案中可将步骤(2)、步骤(3)以及步骤(5)中所涉及的高速离心步骤的转速均设置为10000转/分，持续10分钟，特别设置的离心转速和时间，能够带来在适宜的时长前提下最大限度地提高抽提时液相和有机相的分离效果，保证后续程序顺利进行。

上述技术方案可进一步在步骤(1)的叶片研磨时加入少量石英砂，石英砂具有良好的破细胞壁作用，可提高研磨的效果，使得样品DNA的提取质量得到提高。另外，提取DNA时，选用新鲜的红树植物样本可以有效提高所得到的DNA质量。

附图说明

图1是使用本发明方法从10个秋茄干制样本、1个木榄、1个桐花以及1个白壤新鲜样本中提取的DNA中取样，电泳染色后于紫光灯下拍照所得的图片(1～10为秋茄干样本基因组DNA，11～14依次为新鲜的秋茄、木榄、桐花、白骨壤样本基因组DNA，M为1Kbp DNA Ladder Marker，箭头指向处为基因组DNA条带所处位置)。

图2是从10个秋茄干制样本中中提取的DNA中随机抽取4个与经典CTAB法所提取的4个秋茄干制样本进行DNA电泳，染色后于紫光灯下拍照所得的比较图片(1～4为采用经典的CTAB法提取的秋茄干样本基因组DNA，5～8为采用本方法提取的秋茄干样本基因组DNA，M为100bp DNAMarker，箭头指向处为基因组DNA条带所处位置)。

具体实施方式

实施例1、选用10个秋茄干制样本分别进行10次下述提取作业：

(1)、取0.1g叶片放入研钵中，加入少量石英砂，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的0.5ml2％CTAB提取液溶解，2％CTAB提取液包括2％CTAB、0.1mol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及1％的β-巯基乙醇，所述TrisHCl的PH值为8.0，再加入50μl2％PVP，装入1.5ml离心管，总体积约为0.5ml；

(2)、放入水浴锅中55℃温浴60min，加入2μl RNase，37℃保温1小时，再加入约0.5ml的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，常温下8000转/分离心15分钟；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，2％CTAB提取液与前述步骤(1)中一致，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液后混合，常温下8000转/分离心15分钟；

(4)、取上清液转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，-20℃条件下放置90min；

(5)、4℃下8000转/分离心15分钟，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤2次，风干后加入50μl TE缓冲液，TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0，置于-20℃条件下保存。

实施例2、选用新鲜秋茄样本：

(1)、取0.1g新鲜嫩叶片放入研钵中，加入少量石英砂，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的0.5ml2％CTAB提取液溶解，2％CTAB提取液包括2％CTAB、0.1mol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及1％的β-巯基乙醇，所述TrisHCl的PH值为8.0，再加入50μl2％PVP，装入1.5ml离心管，总体积约为0.5ml；

(2)、放入水浴锅中55℃温浴45min，加入2μl RNase，37℃保温1.5小时，再加入约0.5ml的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，常温下12000转/分离心10分钟；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，2％CTAB提取液与前述步骤(1)中一致，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液后混合，常温下12000转/分离心10分钟；

(4)、取上清液转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，-30℃条件下放置90min；

(5)、1℃12000转/分离心10分钟，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤4次，风干后加入50μlTE缓冲液，TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0，置于-30℃条件下保存。

实施例3、选用新鲜木榄样本：

(1)、取0.2g新鲜叶片放入研钵中，加入少量石英砂，用液氮充分研磨成粉末，加入预热的1ml2％CTAB提取液溶解，2％CTAB提取液包括2％CTAB、0.1mol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及1％的β-巯基乙醇，所述TrisHCl的PH值为8.0，再加入100μl2％PVP，装入5ml离心管，总体积约为1ml；

(2)、放入水浴锅中60℃温浴80min，加入6μl RNase，37℃保温2小时，再加入约1ml的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，常温下10000转/分离心10分钟；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，2％CTAB提取液与前述步骤(1)中一致，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液后混合，常温下10000转/分离心10分钟；

(4)、取上清液转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，-40℃条件下放置110min；

(5)、10℃10000转/分离心10分钟，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤3次，风干后加入100μl TE缓冲液，TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0，置于-40℃条件下保存。

实施例4、选用新鲜桐花样本：

(2)、放入水浴锅中65℃温浴90min，加入2μl RNase，37℃保温2小时，再加入约0.5ml的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，常温下10000转/分离心15分钟；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，2％CTAB提取液与前述步骤(1)中一致，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液后混合，常温下10000转/分离心15分钟；

(4)、取上清液转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，-15℃条件下放置120min；

(5)、5℃10000转/分离心15分钟，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤2次，风干后加入50μl TE缓冲液，TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0，置于-15℃条件下保存。

实施例5、选用新鲜白骨壤样本：

(2)、放入水浴锅中65℃温浴90min，加入2μl RNase，37℃保温2小时，再加入约0.5ml的氯仿-异戊醇混合液后混合，氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1，常温下10000转/分离心10分钟；

(3)、取上清液转入离心管，加入1/2体积预热的2％CTAB提取液，2％CTAB 提取液与前述步骤(1)中一致，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液后混合，常温下10000转/分离心10分钟；

(4)、取上清液转入离心管，加入1/5体积的5mol/L的NaCl溶液，并加入2/3体积的冰冷异丙醇后混合，-50℃条件下放置100min；

(5)、4℃10000转/分离心10分钟，弃上清液，回收沉淀，用70％乙醇洗涤4次，风干后加入50μl TE缓冲液，TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0，置于-50℃条件下保存。

检测分析：

如图1所示，通过上述各实施例所提取的DNA通过电泳检测后，观察可见清晰的条带，可见从上述各实施例中所提取的红树植物DNA含量大、纯度高；

如图2所示，可见经典CTAB法所提取的基因组DNA电泳未跑出条带，而采用本发明方法所提取的基因组DNA电泳可得清晰的条带。

Claims

1.一种红树植物DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述2％CTAB提取液包括2％CTAB、0.1mol/L的TrisHCl、20mmol/L的EDTA、1.4mol/L的NaCl以及1％的β-巯基乙醇，所述TrisHCl的PH值为8.0。

3.根据权利要求1或2所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述TE缓冲液包括10mmol/L的TrisHCl和1mmol/L的EDTA，所述TE缓冲液的PH值为8.0。

4.根据权利要求1或2所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1。

5.根据权利要求3所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的配比为24∶1。

6.根据权利要求1或2所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述各离心步骤中的转速均设置为10000转/分，持续10分钟。

7.根据权利要求3所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述各离心步骤中的转速均设置为10000转/分，持续10分钟。

8.根据权利要求4所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述各离心步骤中的转速均设置为10000转/分，持续10分钟。

9.根据权利要求5所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述各离心步骤中的转速均设置为10000转/分，持续10分钟。

10.根据权利要求1或2所述的红树植物DNA的提取方法，其特征在于：所述叶片研磨时加入少量石英砂。