CN102796733B - 一种安全快速提取茶树老叶片基因组dna的方法 - Google Patents

一种安全快速提取茶树老叶片基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤：将茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μL预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴30min；加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；待反应充分后，离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，离心1min；将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，离心1min，弃废液；向吸附柱加入800μL的70％乙醇，离心1min，弃废液；再次加入800μL的70％乙醇，离心1min，弃废液；重新将吸附柱装入收集管中，离心3min，除去剩余乙醇；取出吸附柱，于50℃放置5min；将吸附柱放入新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，离心3min；离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。安全、快速提取茶树叶片基因组DNA。

Description

一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及的是一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。
背景技术
DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多样性、品种鉴定的一个重要工具。而进行这些研究的先决条件是高质量基因组DNA的提取。由于茶树叶片富含酚类物质，鲜叶中酚类物质含量可达干物质总量的18％～36％，且含有大量的生物碱及其它多种次生物质，这就给为DNA的提取带来了极大困难，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。
目前常见的茶树基因组DNA提取方法有SDS法及CTAB法，虽然这些方法可以成功地从茶树幼叶、成熟叶片提取基因组DNA，但是这些提取方法通常使用有毒试剂氯仿/苯酚去除DNA上残留蛋白质及其他污染物，而且这些方法的操作步骤繁琐，耗时过长，通常在3小时以上。另外，由于茶树不同叶龄间次生代谢产物的异质程度都较高，导致了上述这些提取方法往往不能很好地应用于茶树老叶片基因组DNA提取，而且目前现有技术还没有专门针对茶树老叶片基因组DNA提取的方法的报道。
因此，我们迫切地需要构建一个安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在不适合老叶片、使用有毒试剂及耗时长的缺点和不足，针对茶树老叶富含多酚、多糖的特点，提供一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。
本发明的技术方案如下：
一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将0.3g茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μL预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴30min；所述DNA提取缓冲液由1.5％(w/v)SDS(pH 5.5)，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，40mmol/L EDTA(pH8.0)，1mol/L NaCl，2.5％PVP，10mmol/L β-巯基乙醇组成；所述茶树叶片为新鲜的茶树老叶片；
(2)加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；
(3)待反应充分后，1.2×104r/min离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min；
(4)将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(5)向吸附柱加入800μL的70％乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(6)再次加入800μL的70％乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(7)重新将吸附柱装入收集管中，1.2×104r/min离心3min，除去剩余乙醇；
(8)取出吸附柱，于50℃放置5min；
(9)将吸附柱放入新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，1.2×104r/min离心3min；离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。
所述的方法，步骤(1)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取缓冲液。
茶树老叶富含次生代谢物质，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。为了消除这些影响，采取以下做法：①改变DNA提取缓冲液组成，加入2.5％PVP、10mmol/L β-巯基乙醇来防止茶树叶片中的多酚化合物氧化褐变，加入1mol/L NaCl来增加提取液中DNA的含量；②在裂解后，加入5mol/L KAC去除大量多糖；③采用吸附柱特异结合DNA来纯化所提DNA，进一步控制了所提DNA溶液中的多糖含量及防止酚类物质进入所提DNA溶液。因此，本发明的方法可以从茶树老叶片提取高质量的基因组DNA，满足后续的PCR分析。
(1)本发明可以从新鲜茶树老叶片提取高质量的基因组DNA。
(2)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以通过特异性结合DNA的吸附柱纯化DNA，消除有毒有害试剂酚/氯仿的使用，保护操作人员的身体安全。
(3)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以快速提取茶树叶片基因组DNA，用时短，在2小时内可以完成，而已有方法用时3～4小时。
附图说明
图1为采用本发明方法提取茶树老叶片DNA的电泳图。
图2为采用本发明方法提取茶树老叶片DNA的RAPD电泳图。
图3为采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的ISSR电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1材料与方法
1)材料
新鲜的茶树老叶片采自种植在四川农业大学、省级名山良种场内12个茶树栽培品种(系)，分别为安吉白茶、青心乌龙、古蔺牛皮茶、乌牛早、蜀永307、南江4号、福鼎大白茶、黔湄502、龙井43、蒙山11号、铁观音及英红2号。
2)DNA提取方法
取将0.3g茶树老叶片，加液氮没过叶片表面，研磨至粉末状，置于1.5mL离心管中，再立即加入800μL预热DNA提取缓冲液(DNA提取缓冲液由1.5％(W/V)SDS(pH5.5)，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，40mmol/L EDTA(pH8.0)，1mol/L NaCl，2.5％PVP，10mmol/L β-巯基乙醇组成)，摇匀后于65℃水浴30min；加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；待反应充分后，1.2×104r/min离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min；将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min，弃废液；向吸附柱加入800μL的70％(V/V)乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液。；再次加入800μL的70％(V/V)乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液；重新将吸附柱装入收集管中，12000r/min离心3min，除去剩余乙醇；取出吸附柱，于50℃放置5min；将吸附柱放入1.5mL新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，1.2×104r/min离心3min。离心管中液体为提取的茶树老叶片基因组DNA。
3)DNA纯度、得率及电泳分析
测定茶树老叶片DNA在260nm、280nm的光密度值，并分别通过A260、A260/A280来计算所提DNA的纯度及得率。所提取DNA在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。
4)PCR扩增及电泳分析
(1)RAPD-PCR扩增
PCR反应体系为25μL，其中包括2ng/μL DNA，0.2μmol/L引物(引物序列为ACCGCGAAGG)，2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN)。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后41个循环(94℃变性50s，36℃退火40s，72℃延伸90s)，最后72℃延伸7min。
(2)ISSR-PCR扩增
PCR反应体系为25μL，其中包括10ng DNA，0.6μmol/L引物(引物序列为CTCTCTCTCTCTCTCTCTGG)，2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN)。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后41个循环(94℃变性45s，45℃退火1min，72℃延伸1min)，最后72℃延伸7min。
RAPD扩增产物、ISSR扩增产物在2.5％琼脂糖凝胶上电泳。
2、结果与分析
1)茶树老叶片DNA纯度及得率
采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的A260/A280比值在1.61～1.86之间，得率在34.18μg/g～59.98μg/g之间，表明所提取DNA纯度及产量较高，见表1。采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的的分子量大小约为23kb，条带清晰、完整，而且无可见DNA降解或RNA污染，见图1。
表1  12个茶树品种(系)老叶片DNA的得率及纯度
2)PCR扩增
采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA为模板，进行RAPD-PCR、ISSR-PCR扩增，条带清晰，而且12个茶树品种(系)呈现多态性差异，表明该DNA完全适用于后续PCR分析，见图2及图3。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μL预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴30min；所述DNA提取缓冲液由w/v比例为1.5％的SDS，其pH5.5；100mmol/L Tris-HCl，其pH8.0，40mmol/L EDTA，其pH8.0，1mol/L NaCl，2.5％PVP，10mmol/L β-巯基乙醇组成；所述茶树叶片为新鲜的茶树老叶片；
(2)加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；
(3)待反应充分后，1.2×104r/min离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min；
(4)将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(5)向吸附柱加入800μL的70％乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(6)再次加入800μL的70％乙醇，1.2×104r/min离心1min，弃废液；
(7)重新将吸附柱装入收集管中，1.2×104r/min离心3min，除去剩余乙醇；
(8)取出吸附柱，于50℃放置5min；
(9)将吸附柱放入新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，1.2×104r/min离心3min；离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骡(1)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取缓冲液。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104531681A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 广东粤检生物科技有限公司 提取茶叶核酸的试剂及用该试剂提取茶叶核酸的提取方法
CN108048449B (zh) * 2015-02-11 2021-10-08 杭州百迈生物股份有限公司 一种提取基因组dna的试剂盒
CN104975005A (zh) * 2015-07-28 2015-10-14 福建师范大学 一种提取木本植物基因组dna的试剂盒
CN105255857A (zh) * 2015-09-02 2016-01-20 安徽农业大学 一种茶树dna的提取方法
CN107475248B (zh) * 2017-09-06 2020-06-30 成都晟博源生物工程有限公司 一种植物基因组dna快速提取方法
CN107502605A (zh) * 2017-09-06 2017-12-22 成都晟博源生物工程有限公司 一种石蜡包埋组织基因组dna快速提取方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101586102A (zh) * 2009-07-10 2009-11-25 山东省花生研究所 花生叶片dna微量快速提取方法
CN101914525A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 河南中医学院 一种提取连翘叶片dna的方法
CN101914522A (zh) * 2010-01-30 2010-12-15 浙江省海洋水产养殖研究所 红树植物dna的提取方法
CN101985618A (zh) * 2009-12-28 2011-03-16 陈珂 一种能源植物小桐子基因组dna提取方法
CN102533729A (zh) * 2012-01-11 2012-07-04 福建农林大学 一种从成熟红麻叶片中提取dna的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101586102A (zh) * 2009-07-10 2009-11-25 山东省花生研究所 花生叶片dna微量快速提取方法
CN101985618A (zh) * 2009-12-28 2011-03-16 陈珂 一种能源植物小桐子基因组dna提取方法
CN101914522A (zh) * 2010-01-30 2010-12-15 浙江省海洋水产养殖研究所 红树植物dna的提取方法
CN101914525A (zh) * 2010-08-03 2010-12-15 河南中医学院 一种提取连翘叶片dna的方法
CN102533729A (zh) * 2012-01-11 2012-07-04 福建农林大学 一种从成熟红麻叶片中提取dna的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于得水等.翦股颖属植物基因组DNA提取方法的比较.《广东农业科学》.2009,(第12期),164-167.
单志等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究.《广东农业科学》.2011,(第8期),113-115.
改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究;单志等;《广东农业科学》;20111231(第8期);第113页1.1和1.2.1 *
翦股颖属植物基因组DNA提取方法的比较;于得水等;《广东农业科学》;20091231(第12期);164-167 *

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