CN104975005A - 一种提取木本植物基因组dna的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，属于生物技术领域。本发明所述的提取木本植物基因组DNA的试剂盒，包括木本植物组织的前处理，DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱具体步骤。常规的木本植物基因组DNA提取步骤繁琐，耗时长，一般需要15h左右才能提取到木本植物基因组DNA，一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒与常规的木本植物基因组DNA提取方法相比仅需3h左右的时间即可提取到木本植物基因组DNA，不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到木本植物基因组DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，属于生物技术领域。
技术背景
DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。DNA提取技术的不断发展，为全基因组测序等多项应用创造了有利条件。随着现代分子生物学的发展，DNA分离技术也层出不穷.DNA已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来，也可以从痕量材料获得DNA。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。
然而在进行木本植物DNA水平遗传多样性研究时，首先遇到的问题是如何快速获得较完整、纯度较高的基因组DNA。由于植物细胞与动物细胞不同，具有一层坚硬的细胞壁，且含有较多的多糖、色素、脂质和多酚等物质，给植物DNA提取带来很多困难，特别是多糖和多酚类物质不易与DNA分开。相对于草本植物，多年生木本植物的次生代谢类物质含量更高，高质量的DNA提取难度更大。大多数植物DNA提取方法所提取得到的DNA粗提物中往往含有大量蛋白质、多糖、单宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去，大多数蛋白质可通过酚-氯仿-异戊醇处理后变性、沉淀除去。但大多数木本植物富含多糖、多酚类物质，DNA常受到严重的多酚污染，造成DNA沉淀物难以溶解或溶液色深；多糖污染直接影响基因组DNA的限制性核酸内切酶的酶切效果。多酚类、多糖物质的污染会造成AFLP酶切连接等后续实验效果差。
因为木本植物基因组DNA是研究木本植物分子生物学的基础，如不能有效的完成木本植物DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。因此需要研制一种适用于木本植物基因组DNA提取的方便、快捷的方法，要能保证提取到木本植物基因组DNA，才能进一步开展木本植物基因组研究。
发明内容：
本发明提供一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，与传统方法相比，利用该方法能够快速提取木本植物基因组DNA。
一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，包括木本植物组织的前处理，DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，具体步骤如下：
植物组织样品的前处理：称取0.2-1g植物组织样品，用液氮研磨成粉末DNA的游离与杂蛋白的抽除：将样品粉末装入2ml的离心管中，加入300-800μl Buffer A，振荡器震荡30-60s后，在60-70℃水浴锅中温育5-15min，每5-6min震荡一次。4℃，10000-13000rpm/min离心10-30min，将上清移至新的离心管中，加入1/3体积的5-10mol/LBuffer B，4℃静置30-60min。4℃，10000-13000rpm/min离心5-10min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的抽提液震荡30-60s，4℃静置30-60min。4℃，10000-13000rpm/min离心10-30min，将上清移至新的离心管中。加入等体积的抽提液震荡30-60s，4℃静置30-60min。4℃，10000-13000rpm/min离心10-20min。将上清移至新的离心管中。
DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min离心1-2min，弃废液，加入300-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min离心1min，弃废液，加入300-600μl漂洗液，10000-13000rpm/min离心1min，弃废液，加入300-600μl漂洗液，10000-13000rpm/min离心1-5min，弃废液，10000-13000rpm/min离心1-5min，静置吹干。
DNA洗脱：往吸附柱中加入20-50μl洗脱液，10000-13000rpm/min离心1-5min，所得液体为基因组DNA。取3-6μl DNA水溶液，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
试剂的配方如下：
DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
Buffer A：50-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷PH＝8-9，10-100mmol/L乙二胺四乙酸PH＝8.0-9.0，500-1000mmol/L氯化钠(NaCL)，1.5-2％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS)，2-3％体积体积比的巯基乙醇。
Buffer B:5-10mol/L醋酸钾。
抽提液：氯仿:异戊醇的体积比为24:1。
沉淀剂：70-80％无水乙醇。
去蛋白液：3-6M盐酸胍，10-30mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝6.0-7.0，用前加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为30-40％。
漂洗液：20-50mM氯化钠(NaCL)，2-5mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝7.0-8.0，80-90％比重无水乙醇，10-20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.0-9.0。
本发明的显著优点：
常规的木本植物基因组DNA提取步骤繁琐，耗时长，一般需要15h左右才能提取到木本植物基因组DNA，一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒与常规的木本植物基因组DNA提取方法相比仅需3h左右的时间即可提取到木本植物基因组DNA，不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到木本植物基因组DNA。
附图说明
图1为利用本方法提取的木本植物基因组DNA的电泳检测图。
具体实施例
图1中，泳道1，2，分别是葡萄树叶片的基因组DNA检测图、橘子树叶片的基因组DNA检测图，泳道3是TAKARA公司的DL4500Marker。
一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，具体步骤如下：
(1)植物组织样品的前处理：分别称取0.5g葡萄树叶片、橘子树叶片，用液氮研磨成粉末。
(2)DNA的游离与杂蛋白的抽除：将样品粉末装入2ml的离心管中，加入600μl BufferA，振荡器震荡30s后，在65℃水浴锅中温育10min，每5min震荡一次。4℃，12000rpm/min离心10min，将上清移至新的离心管中，加入1/3体积的Buffer B，4℃静置30min。4℃，12000rpm/min离心10min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的抽提液震荡30s，4℃静置30min。4℃，12000rpm/min离心10min，将上清移至新的离心管中。加入等体积的抽提液震荡30s，4℃静置30min。4℃，12000rpm/min离心10min。将上清移至新的离心管中。
(3)DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，12000rpm/min离心1min，弃废液，加入500μl去蛋白液，12000rpm/min离心1min，弃废液，加入500μl漂洗液，12000rpm/min离心1min，弃废液，加入500μl漂洗液，12000rpm/min离心1min，弃废液，12000rpm/min离心2min，静置吹干。
(4)DNA洗脱：往吸附柱中加入30μl洗脱液，12000rpm/min离心2min，所得液体为基因组DNA。取5μl DNA水溶液，于1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
试剂的配方如下：
下表是木实施例提取的植物基因组DNA纯度的检测结果。
| 泳道1 | 泳道2 | |
| OD(260:280) | 1.79 | 1.78 |
Buffer A：100mmol/L三羟甲基氨基甲烷PH＝8.3，50mmol/L乙二胺四乙酸PH＝8，500mmol/L氯化钠(NaCL)，1.5％质量体积比的十二烷基硫酸钠(SDS),2％体积体积比的巯基乙醇
Buffer B:5mol/L醋酸钾
抽提液：氯仿:异戊醇的体积比为24:1
沉淀剂：70％无水乙醇
去蛋白液：5M盐酸胍，20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Ph＝6.6，使用前加入乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为38％。
漂洗液：20mM氯化钠(Nacl)，2mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝7.5，85％比重无水乙醇。
洗脱液：10mM T三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH＝8.5。
DNA吸附柱为硅胶模吸附柱，购自北京天恩泽公司。
一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒检测见图1，其中泳道1，2，分别是葡萄树叶片的基因组DNA检测图、橘子树叶片的基因组DNA检测图，泳道3是TAKARA公司的DL4500Marker。从图1中看出利用本方法可以快速提取木本植物基因组DNA。木本植物基因组DNA的纯度见表1，从表1可看出利用本方法提取到的木本植物基因组DNA的OD(260:280)值在1.78-1.79之间，可见本方法不仅可以快速提取到木本植物基因组DNA，同时提取到的木本植物基因组DNA还具有较高的纯度。
Claims (7)
1.一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，包括木本植物组织的前处理，DNA的游离与杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除和DNA洗脱，其特征是：
植物组织样品的前处理
称取0.2-1g植物组织样品，用液氮研磨成粉末；
DNA的游离与杂蛋白的抽除
将样品粉末装入2ml的离心管中，加入300-800μl Buffer A，振荡器震荡30-60s后，在60-70℃水浴锅中温育5-15min，每5-6min震荡一次；4℃，10000-13000rpm/min 离心10-30min，将上清移至新的离心管中，加入1/3体积的5-10mol/L Buffer B，4℃静置30-60min；4℃10000-13000rpm/min 离心5-10min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的抽提液震荡30-60s，4℃静置30-60min；4℃，10000-13000rpm/min 离心10-30min，将上清移至新的离心管中，加入等体积的抽提液震荡30-60s，4℃静置30-60min；4℃，10000-13000rpm/min 离心10-20min，将上清移至新的离心管中；
DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除
往离心管中加入两倍体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min 离心1-2min，弃废液，加入300-600μl去蛋白液，10000-13000rpm/min 离心1min，弃废液，加入300-600μl漂洗液，10000-13000rpm/min 离心1min，弃废液，加入300-600μl漂洗液，10000-13000rpm/min 离心1-5min，弃废液，10000-13000rpm/min 离心1-5min，静置吹干；
DNA洗脱
往吸附柱中加入20-50μl洗脱液，10000-13000rpm/min 离心1-5min，所得液体为基因组DNA，取3-6μl DNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是DNA吸附柱为硅胶模吸附柱。
3.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是所述的Buffer A：PH=8-9的50-200 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷， PH=8.0-9.0的10-100 mmol/L乙二胺四乙酸，500-1000 mmol/L氯化钠，1.5-2%质量体积比的十二烷基硫酸钠，2-3% 体积体积比的巯基乙醇；所述的Buffer B: 5-10mol/L 醋酸钾。
4.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是所述的抽提液：氯仿:异戊醇的体积比为24:1。
5.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是所述的沉淀剂：70-80%无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是所述的去蛋白液：3-6M盐酸胍，pH=6.0-7.0的10-30 mM的三羟甲基氨基甲烷，用前加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的终浓度为30-40％。
7.根据权利要求1所述的一种提取木本植物基因组DNA的试剂盒，其特征是所述的漂洗液：20-50mM氯化钠，pH=7.0-8.0的2-5mM的三羟甲基氨基甲烷，80-90%比重无水乙醇，pH =8.0-9.0 的10-20mM的三羟甲基氨基甲烷。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110452904A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-11-15 | 长江大学 | 一种大豆基因组dna提取试剂盒及提取方法 |
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| CN102796733A (zh) * | 2012-08-24 | 2012-11-28 | 四川农业大学 | 一种安全快速提取茶树老叶片基因组dna的方法 |
| CN104531680A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-22 | 福建师范大学 | 快速提取动物粪便微生物基因组dna的试剂盒及提取方法 |
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2015
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