CN102994493A - 一种海参体壁总dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参体壁总DNA提取方法。它包括样品预处理、样品的裂解、样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成；用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。因此利用本发明的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种海参体壁总DNA提取方法。
背景技术：
海参体壁中含有丰富的胶原、黏多糖和多种微量元素，具有较高的营养价值和药用价值。在我国被认为是传统的美味和滋补品。全球可供食的海参种类约50多种，作为名贵的海产品，市场上海参通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品，大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。
根据海参线粒体DNA片段如COI和16S rDNA序列，可以从分子水平鉴定海参种类和开发出简便的种类鉴别方法。由于海参含有丰富的黏多糖和蛋白质，造成DNA的提取比较困难，尤其是高质量DNA的获得，DNA中多糖等杂质过多会影响后续PCR扩增等分子生物学实验，进而影响了海参种类的分子鉴定。另外，干海参经过加工处理，其核基因组DNA已降解，与核基因组DNA相比，线粒体DNA结构简单、稳定，拷贝数多，可以用于海参种类的分子鉴定。
发明内容：
本发明的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供一种能对海参酒精保存样品和干品均适用的海参体壁总DNA提取方法，该方法提取的DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
本发明的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）样品预处理：第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为：200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0；
（b）样品的裂解：将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65℃消化30~60min，每隔5~10min混匀一次，待样品消化彻底后，12000g/min离心2~3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水；
（c）样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成；
（d）用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。
所述的步骤（a）的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精优选为取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的固液分离是在10000-12000g/min离心1-2min，弃上清液；重复操作2次。
所述的步骤（c）的样品消化液用氯仿：异戊醇抽提优选为样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇中，充分混匀，静止1-2min，12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2-3次。
本发明中的PBS溶液是现有技术中的产品，其为137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，余量为水，pH7.2。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）使用PBS置换出酒精保存样品中酒精和浸发干海参样品，可提高提取DNA的获得量；
（2）在高盐缓冲液中剪碎组织样品，可除去样品中胞外多糖和色素等，降低它们对提取DNA的影响；
（3）样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液，即可快速的裂解组织，又有利于去除多糖；
（4）异丙醇高盐溶液沉淀DNA，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，消除多糖对DNA质量的影响；
因此利用本发明的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
附图说明：
图1是本发明的实施例1和3提取并纯化出的海参体壁总DNA琼脂糖电泳图。M：DNA Marker(DL15000),1-4：花刺参酒精保存样品提取的DNA，5-8：墨西哥刺参干品提取的DNA。
图2是以本发明的实施例1和3提取DNA为模板COI扩增产物的琼脂糖电泳图。M：DNAMarker(DL2000)，1-4：花刺参酒精保存样品提取DNA为模板的COI扩增产物，5-8：墨西哥刺参干品提取DNA为模板的COI扩增产物。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）样品预处理
材料为花刺参（Stichopus monotuberculatus）酒精保存样品，用剪刀取样品40mg，放入1.5ml离心管中，加入800μl PBS溶液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/L KH2PO4，余量为水，pH 7.2），放置3min，期间更换PBS溶液2次，得到处理后的样品。随后剪取处理后的样品60mg，放入1.5ml离心管中，加入1000μl高盐缓冲液中（200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0，%指的是质量体积分数），充分剪碎样品，12000g/min离心1min，弃上清液；重复操作2次，取沉淀，得到的沉淀即为预处理后的样品。
（2）样品裂解
样品裂解液为添加了SDS的CTAB抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水，%指的是质量体积分数)，加热至65℃，混匀；向预处理后的样品中加入800μl预热的裂解液和20μl 20mg/ml蛋白酶K，放置在65℃金属浴上，消化40min，每5min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心2min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的离心管中。
（3）氯仿：异戊醇抽提
向样品消化液中加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1），充分混匀，静止1min，12000g/min离心15min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作2次，得上清液。
（4）异丙醇高盐沉淀DNA
向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液（异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成），混匀，-20℃下放置20min；12000g/min离心15min，弃上清，底部沉淀有DNA。
（5）洗盐和溶解DNA
向沉淀有DNA的离心管中加入800μl体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤DNA沉淀，12000g/min离心3min，弃上清；重复操作2次；取DNA沉淀，在42℃金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入100μl 0.1×TE溶解DNA，-20℃保存。
本实施例提取并纯化出的花刺参酒精保存样品体壁总DNA的琼脂糖电泳如图1（1-4道）所示，DNA呈主带，质量好；以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳如图2（1-4道）所示，COI带型清晰，稳定，说明此DNA能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
实施例2：
（1）样品预处理
材料为花刺参（Stichopus monotuberculatus）酒精保存样品，用剪刀取样品40mg，放入1.5ml离心管中，加入1000μl PBS溶液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/LNa2HPO4，2mmol/L KH2PO4，余量为水，pH7.2），放置6min，期间更换PBS溶液2次，得到处理后的样品。随后剪取处理后的样品60mg，放入1.5ml离心管中，加入1000μl高盐缓冲液中（200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0），充分剪碎样品，10000g/min离心2min，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。
（2）样品裂解
样品裂解液为添加了SDS的CTAB抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水)，加热至65℃，混匀；向预处理后的样品中加入800μl预热的裂解液和20μl 20mg/ml蛋白酶K，放置在65℃金属浴上，消化30min，每10min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心3min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的离心管中。
（3）氯仿：异戊醇抽提
向样品消化液中加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1），充分混匀，静止2min，13000g/min离心12min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作2次，得上清液。
（4）异丙醇高盐沉淀DNA
向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液（异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成），混匀，-20℃下放置20min；13000g/min离心12min，弃上清，底部沉淀有DNA。
（5）洗盐和溶解DNA
向沉淀有DNA的离心管中加入800μl体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤DNA沉淀，13000g/min离心3min，弃上清；重复操作3次；取DNA沉淀，在42℃金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入100μl 0.1×TE溶解DNA，-20℃保存。
由此获得花刺参酒精保存样品体壁总DNA，该DNA质量好，以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳显示COI带型清晰，稳定，说明此DNA能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
实施例3：
（1）样品预处理
材料为墨西哥刺参（Isostichopus fucus）干品，用剪刀取体壁组织8mg，放入1.5ml离心管中，加入800μl PBS溶液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH7.2），放置60min，期间更换PBS溶液2次，得到浸发的样品。剪取60mg浸发的样品，放入1.5ml离心管中，加入1000μl高盐缓冲液中（200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0），充分剪碎样品，12000g/min离心1min，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。
（2）样品裂解
样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水)，加热至65℃，混匀；向预处理后的样品中加入800μl预热的裂解液和20μl 20mg/ml蛋白酶K，放置在65℃金属浴上，消化50min，每5min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心2min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的1.5ml离心管中。
（3）氯仿：异戊醇抽提
向样品消化液中加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1），充分混匀，静止1min，13000g/min离心15min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作3次，得上清液。
（4）异丙醇高盐沉淀DNA
向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液（异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成），混匀，-20℃下放置20min；12000g/min离心15min，弃上清，底部沉淀有DNA。
（5）洗盐和溶解DNA
向沉淀有DNA的离心管中加入1000μl体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤，13000g/min离心3min，弃上清；重复操作2次；取DNA沉淀，在42℃金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入60μl 0.1×TE溶解DNA，-20℃保存。
本实施例提取并纯化出的墨西哥刺参干品体壁总DNA的琼脂糖电泳如图1（5-8道）所示，无明显的DNA主带；但以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳如图2（5-8道）所示，COI带型清晰，稳定，说明此DNA中有完整的线粒体DNA，能满足对线粒体DNA片段PCR扩增等分子生物学实验的要求。
实施例4：
（1）样品预处理
材料为墨西哥刺参（Isostichopus fucus）干品，用剪刀取体壁组织8mg，放入1.5ml离心管中，加入1000μl PBS溶液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4，pH7.2），放置30min，期间更换PBS溶液2次，得到浸发的样品。剪取60mg浸发的样品，放入1.5ml离心管中，加入1000μl高盐缓冲液中（200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8.0），充分剪碎样品，10000g/min离心2min，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。
（2）样品裂解
样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水)，加热至65℃，混匀；向预处理后的样品中加入800μl预热的裂解液和20μl 20mg/ml蛋白酶K，放置在65℃金属浴上，消化60min，每10min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心3min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的1.5ml离心管中。
（3）氯仿：异戊醇抽提
向样品消化液中加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24:1），充分混匀，静止2min，12000g/min离心12min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作3次，得上清液。
（4）异丙醇高盐沉淀DNA
向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液（异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成），混匀，-20℃下放置20min；13000g/min离心12min，弃上清，底部沉淀有DNA。
（5）洗盐和溶解DNA
向沉淀有DNA的离心管中加入1000μl体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤，12000g/min离心5min，弃上清；重复操作3次；取DNA沉淀，在42℃金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入60μl 0.1×TE溶解DNA，-20℃保存。
由此获得墨西哥刺参干品体壁总DNA，该DNA质量好，以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳显示COI带型清晰，稳定，说明此DNA中有完整的线粒体DNA，能满足对线粒体DNA片段PCR扩增等分子生物学实验的要求。
Claims (3)
1.一种海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）样品预处理：第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为：200mmol/L Tris-HCl,50mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl,0.2%β-巯基乙醇，余量为水，pH8.0；
（b）样品的裂解：将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65℃消化30~60min，每隔5~10min混匀一次，待样品消化彻底后，12000g/min离心2~3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP，1%SDS，0.2%β-巯基乙醇，余量为水；
（c）样品消化液用氯仿：异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3：1混合而成；
（d）用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。
2.根据权利要求1所述的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，所述的步骤（a）的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精是取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤（a）的固液分离是在10000-12000g/min离心1-2min，弃上清液；重复操作2次。
3.根据权利要求1所述的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，所述的步骤（c）的样品消化液用氯仿：异戊醇抽提是将样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿：异戊醇中，充分混匀，静止1-2min，12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2-3次，得到含有DNA的上清水相。
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