CN102586230A

CN102586230A - 基于pcr的玉米半粒种子dna快速提取方法

Info

Publication number: CN102586230A
Application number: CN2012100525316A
Authority: CN
Inventors: 张春庆; 温大兴
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明涉及一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，是将玉米种子纵切，取一半(必须含有胚)放入1.5mL离心管中，加入500μL提取液(0.03mol/L～0.05mol/LKOH或NaOH溶液)，提取1min～48h，混匀，即为DNA提取液样品。取0.5～5μL该DNA样品可以直接用于PCR扩增，该方法的主要用途是玉米种子纯度或GMO高通量检测，和基于PCR的玉米种子DNA快速提取主要用于玉米种子DNA的快速提取，提取后的DNA满足PCR扩增。

Description

基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法

一、技术领域

本发明涉及一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，属于分子生物技术领域，具体涉及玉米半粒种子DNA快速提取，提取后的DNA适用于PCR扩增。

二、背景技术

目前，植物DNA 提取已经发展了很多方法，可以从植物叶片、果实和种子等组织器官中提取DNA，但大多数方法提取时间较长，这些方法大多应用于科学研究，难以应用于快速检测领域。在提取植物DNA的过程中，需要根据植物组织材料的外在性质(来源、部位、形态等)和内在特点(化学成分、组织结构等)的差异，选择适宜的方法或作一些特殊的处理。

传统的DNA提取方法(SDS法和CTAB法)是在裂解细胞的基础上，用等体积的酚氯仿或酚氯仿异戊醇(25:24:1)抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，核酸留在水相，从而达到分离核酸的目的；加入RNA酶可以去除RNA；然后加入异丙醇或乙醇沉淀DNA；用70%乙醇漂洗沉淀，去除残留的有机溶剂和盐离子，以免影响DNA溶解和后续实验，最后用TE或ddH₂O溶解DNA备用。自从SDS法和CTAB法报道以来，国内外很多学者对这两种方法作了许多改进。经典的DNA提取方法不需要昂贵的仪器和药品，提取的DNA能够满足一般分子生物学研究的需要，已成为分子生物学实验室提取DNA最常用的方法。但这些方法也存在着很多不足，如操作步骤复杂、耗时长、易交叉污染、苯酚和氯仿等有机溶剂易造成环境污染并且有损操作者健康等。今后，DNA提取方法研究的发展方向：①用无毒的有机溶剂或无机溶剂代替有毒的有机溶剂；②简化操作步骤，朝着批量提取的方向发展；③提取过程朝着自动化方向发展，将DNA提取与其他分子生物学技术(毛细管电泳、基因芯片技术等)相结合，实现从样品处理到分析的过程全部自动化。

由于目前的DNA提取方法提取时间较长，在短时间内不能进行基于PCR的大量样品的检测，难以在基于PCR的快速检测中应用。为了突破DNA提取时间较长这个瓶颈，国内外很多研究者加入了DNA提取研究的行列，并取得了一些成绩。近年来有很多DNA快速提取方法的报道，提取时间缩短了很多，少数方法可以用于快速检测，但提取速度还不是很快，有待进一步加快。

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法。

一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取技术，是先将玉米种子沿胚纵切，取含有胚的半粒种子放入1.5mL离心管中，再加入200μL～1000μL 提取液，所述的提取液为0.03M～0.2M氢氧化钾（ KOH）或氢氧化钠（NaOH）溶液，提取时间1min～48h，混匀提取液，混匀后的提取液即为DNA样品，用于PCR扩增。用于PCR扩增时DNA模板量为0.5μL～5μL，综合考虑DNA样品中杂质含量和加样的操作方便性，通常优先选择2μL作为DNA模板。

本发明提取过程简便，不研磨、不离心、不转管、不使用有毒试剂，最主要的是提取速度非常快。用SSR引物对该方法提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物用9%PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)检测，结果显示PCR扩增产物良好。

四、附图说明

图1 提取液浓度和体积对PCR扩增产物的影响(材料：郑单958)

由图1可知，PCR扩增产物主要受提取液浓度影响，提取液体积200μL～1000μL的样品间差异不显著。提取液浓度0.01～0.02M的样品有较弱的目标带，0.03～0.05M的样品有中等亮度的目标带，0.06～0.2M的样品有清晰的目标带，0.3M的样品无目标带。

图2 提取时间对PCR扩增产物的影响

由图2可知，提取1min～48h的样品间差异不显著，提取3d的样品目标带亮度开始减弱，提取4d的样品目标带已经很弱。

图3 DNA模板量对PCR扩增产物的影响

由图3可知，各处理间差异不显著，说明该方法有很宽的DNA模板量适应范围。

图4 不同公司的Mix对PCR扩增产物的影响(材料：郑单958)

由图4可知，提取液浓度0.01～0.02M的样品，两个公司的Mix都扩增出较弱的目标带；提取液浓度0.03～0.05M的样品，两个公司的Mix都扩增出中等亮度的目标带；但BioTeke公司的Mix对提取液浓度为0.06M～0.20M的样品的扩增都显示很亮的目标带，而天根公司的Mix对提取液浓度为0.06M～0.10M的样品扩增显示很亮的目标带，0.02M的样品就已经开始不出带；提取液浓度为0.3M的样品两个公司的Mix都未扩增出目标带。

图5提取液浓度0.03M，提取液体积500ml的 PCR扩增产物

有图5可知，提取液浓度0.03M，提取液体积500ml,提取10min,能保证得到较好的PCR产物。

图1、图4中：图上方是对应的提取液(KOH溶液)浓度编号：1～2：0.01M；3～4：0.02M；5～6：0.03M；7～8：0.04M；9～10：0.05M；11～12：0.06M；13～14：0.07M；15～16：0.08M；17～18：0.09M；19～20：0.1M；21～22：0.2M；23～24：0.3M。

图2中：图上方是对应的提取时间编号：1～2：1min；3～4：5min；5～6：10min；7～8：20min；9～10：40min；11～12：60min；13～14：12h；15～16：24h；17～18：36h；19～20：48h；21～22：3d；23～24：4d

图3中：图上方是对应的DNA模板量编号(1～12：郑单958)：1～2：0.5μL；3～4：1μL；5～6：2μL；7～8：3μL；9～10：4μL；11～12：5μL。

图5中：图上方1、2、3、4对应4个重复。

图1中：图左侧是对应的提取液体积。

图2中：图左侧是对应的玉米品种。

图4中：图左侧是对应的提供Mix的公司。

图3中：Marker的大小(从上到下)：200bp，180bp，160bp，140bp，120bp，100bp。

五、具体实施方式

以玉米商品种子(郑单958、先玉335)为材料，通过实施例对本发明做进一步的描述。

实施例统一采用20μL PCR扩增体系，具体组分及程序如下 (引物：phi065；Mix：北京BioTeke公司、北京天根公司)。取2μL PCR扩增后产物，浓度9%PAGE电泳检测。

本发明中的所述的浓度单位M是指摩尔浓度mol/L。

实施例1

说明所用的提取液浓度和体积对PCR扩增的影响。

(1) 提取液浓度和体积参数

提取液(KOH溶液)浓度分别为：0.01M，0.02M，0.03M，0.04M，0.05M，0.06M，0.07M，0.08M，0.09M，0.1M，0.2M，0.3M；提取液体积分别为：200μL，400μL，600μL，800μL，1000μL；共设定60种浓度、体积组合，如：设定KOH溶液浓度0.01M，体积分别为200μL，400μL，600μL，800μL，1000μL；以此类推。

(2) DNA提取

将120粒玉米种子逐粒沿胚纵切（60种浓度、体积提取组合，2次重复），将含胚的半粒种子分别放入1.5mL离心管中，不同浓度提取液按以上5种提取液体积分别加入离心管中，为保证结果的可靠，每种浓度、体积组合两次重复，提取10min后，将1.5 mL离心管中提取液逐个混匀，即为DNA提取样品。

(3) PCR扩增

取2μL上述DNA样品进行PCR扩增，用9%PAGE检测PCR扩增产物。

(4)结果检测

由图1(材料：郑单958)可知，PCR扩增产物主要受提取液浓度影响，提取液体积200μL～1000μL的样品间差异不显著。提取液浓度0.01～0.02M的样品有较弱的目标带，0.03～0.05M的样品有中等亮度的目标带，0.06～0.2M的样品有清晰的目标带，0.3M的样品无目标带。说明该方法的PCR扩增产物有较宽的提取液浓度适应范围(0.03～0.2M)，而且有很宽的提取液体积适应范围(200μL～1000μL都可以)，保证了该方法的可靠性和实用性。

实施例2

说明提取时间对PCR扩增的影响。

(1) DNA提取

取24粒郑单958玉米种子（12种时间处理，两次重复），沿胚纵切，取含胚的半粒种子放入1.5mL离心管中，加入500μL 0.05M KOH溶液，在25℃培养箱中提取：1min，5min，10min，20min，40min，60min，12h，24h，36h，48h，3d，4d，到提取时间后混匀，即为DNA提取样品，用于PCR扩增。

(2) PCR扩增

取2μL上述DNA提取样品，进行PCR扩增，用PAGE检测PCR扩增产物。

(3) 结果检测

由图2可知，提取1min～48h的样品间差异不显著，提取3d的样品目标带亮度开始减弱，提取4d的样品目标带已经很弱。因此，说明该方法有很宽的提取时间适应范围1min～48h，足以保证该方法的可行性。

实施例3

说明DNA模板用量对PCR扩增的影响。

(1) DNA提取

将种子沿胚纵切，取一半放入1.5mL离心管中，加入500μL提取液(0.05M KOH溶液)，提取10min后混匀提取液。

(2) PCR扩增

分别取0.5μL，1μL，2μL，3μL，4μL，5μL DNA样品作为DNA模板进行PCR扩增，两次重复。

(3) 结果检测

实施例4

鉴定不同公司的Mix对本发明提取的DNA的PCR扩增产物的影响。

(1) DNA提取

将种子沿胚纵切，取一半放入1.5mL离心管中，分别加入0.01M，0.02M，0.03M，0.04M，0.05M，0.06M，0.07M，0.08M，0.09M，0.1M，0.2M，0.3M提取液500μL，两次重复，提取10min后混匀，用于PCR检测。

(2) PCR扩增

取2μL DNA提取样品进行PCR扩增，PCR扩增体系中的Mix分别购自北京的BioTeke公司和天根公司，两次重复。

(3) 结果检测

由图4(材料郑单958)可知，提取液浓度0.01～0.02M的样品，两个公司的Mix都扩增出较弱的目标带；提取液浓度0.03～0.05M的样品，两个公司的Mix都扩增出中等亮度的目标带；但BioTeke公司的Mix对提取液浓度为0.06M～0.20M的样品的扩增都显示很亮的目标带，而天根公司的Mix对提取液浓度为0.06M～0.10M的样品扩增显示很亮的目标带，0.2M的样品就已经开始不出带；提取液浓度为0.3M的样品两个公司的Mix都未扩增出目标带。因此，说明不同公司的Mix由于成分不同会导致扩增结果略有差异，但结论是一致的，提取液浓度为0.03 M～0.20M，提取时间1min～2d，均可满足PCR要求。

实施例5

证明本发明实用性。

(1) DNA提取

将4粒种子沿胚纵切，各取一半分别放入4个1.5mL离心管中，并分别加入0.03M提取液500μL，两次重复，提取10min后混匀，用于PCR检测。

(2) PCR扩增

取2μL DNA提取样品进行PCR扩增，PCR扩增体系中的Mix分别购自北京的BioTeke公司。

(3) 结果检测

由图5(材料先玉335)可知，提取液扩增显示很亮的目标带。因此，提取液浓度在本发明浓度范围内，提取适合的时间（1min～2d），均可满足PCR要求。

Claims

1.一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，其特征在于：先将玉米种子沿胚纵切，取含有胚的半粒种子放入1.5mL离心管中，再加入200μL～1000μL 提取液，所述的提取液为0.03M～0.2M氢氧化钾 KOH或氢氧化钠NaOH溶液，提取时间1min～2d，混匀提取液，混匀后的提取液即为DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为0.5μL～5μL。

2.根据权利要求1所述的一种基于PCR的玉米半粒种子DNA快速提取方法，其特征在于：用于PCR扩增时所述的DNA样品模板量为2μL。