CN105255857A - 一种茶树dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及茶树DNA的提取方法,具体步骤如下:(1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放研磨成粉末状;(2)取粉末放入离心管,依次加入水浴的提取液,β-巯基乙醇,60℃-70℃,水浴15-25min,得粗样品;(3)加入RNase-A混匀后,40℃水浴5min,得粗样品;(4)取出离心管先后加入Tris平衡酚和氯仿/异戊醇,混匀后离心得上清液;(5)将上清液用-20℃预冷无水乙醇,清洗两次;(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45℃预热去离子水,放入45℃水浴锅中溶解,重复步骤(5)的操作一至两次,蒸发剩余乙醇,在加入200μL去离子水后获得DNA。本发明提取的茶树叶片的基因组DNA浓度高、提取时间短。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种茶树DNA的提取方法。
背景技术
茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科山茶属茶亚属茶种植物,起源于我国西南地区,经长期的引种、传播,我国茶树生长区域从N18°30′-35°13′,E94°-122°,南至热带边缘,北至暖温带。我国是茶树的主要原产地,至今已有3000多年的人工栽培历史,经过几千年的人工或自然育种,形成了非常丰富的茶树种质资源。
DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多样性、品种鉴定的一个重要工具。目前常见的茶树DNA提取方法主要是CTAB法和SDS法,这两种方法已有很多研究,也有很多优化方案。由于茶树组织中含有大量的多糖多酚,而多糖多酚又容易与DNA结合,所以茶树DNA的提取一直没有理想的方法。而通过对已有的优化方法进行重复发现:若要提取高纯度的DNA则单样提取周期长,反之,若缩短提取时间,所提的DNA纯度较低。试剂盒法提取茶树DNA,虽然提取纯度高,但因膜过滤使提取量降低。所以,如何提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法是目前急需解决的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于:提供一种获取的DNA浓度高、提取时间短的茶树DNA的提取方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:
一种茶树DNA的提取方法,具体步骤如下:
(1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状;
(2)将步骤(1)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后,加入650μL水浴的提取液,所述的提取液由pH8.0;100mmol/L的Tris-盐酸、pH8.0;20mmol/L的EDTA、1.0mol/L的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成,漩涡震荡充分混匀后,再加入15μL的β-巯基乙醇,60℃-70℃,水浴15-25min,每隔5min混匀一次,得到粗样品;
(3)水浴结束后加入10μL,10mg/mL的RNase-A混匀后,40℃水浴5min,得到粗样品;
(4)取出离心管先后加入PH8.0;400μL的Tris平衡酚和400μL氯仿/异戊醇,漩涡震荡充分混匀后10000rpm离心10min,获得上清液;
(5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中,加入3倍上清液体积的-20℃预冷无水乙醇,混匀,此时有DNA析出,倒去上清液,后再用1ml-20℃预冷无水乙醇清洗一次,倒去上清液;
(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45℃预热的去离子水,再放入45℃水浴锅中溶解,重复步骤(5)的操作一至两次,10000rpm离心1min后,去上清后再次空转10000rpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇,待沉淀微白时取出,加入200μL去离子水后获得DNA,后将提取的DNA放置-20℃冰箱中备用。
优选地,步骤(2)中CTAB/SDS的体积比为1:6。
优选地,步骤(4)中氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
本发明的有益效果在于:
1、提取的茶树叶片的基因组DNA浓度高。
2、提取时间短,在1-2小时内可以完成,且所用试剂价格便宜,降低了成本。通过反复实验验证,在提取试剂中加入可以结合多酚的试剂,同时简化操作步骤。使提取的DNA的质量与含量都较高的同时将提取单个样品的时间控制在100min以内,大大节省了操作的时间,由于提取试剂可以自行配制降低实验的成本。
附图说明
图1是本发明提取的茶树DNA的电泳图;
图2是本发明提取的茶树DNA进行PCR扩增的电泳图。
具体实施方式
茶树DNA的提取方法,具体步骤如下:
(1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状;
(2)将步骤(1)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后,加入650μL水浴的提取液,所述的提取液由pH8.0;100mmol/L的Tris-盐酸、pH8.0;20mmol/L的EDTA、1.0mol/L的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成,漩涡震荡充分混匀后,再加入15μL的β-巯基乙醇,60℃-70℃,水浴15-25min,每隔5min混匀一次,得到粗样品;
(3)水浴结束后加入10μL,10mg/mL的RNase-A混匀后,40℃水浴5min,得到粗样品;
(4)取出离心管先后加入PH8.0;400μL的Tris平衡酚和400μL氯仿/异戊醇,漩涡震荡充分混匀后10000rpm离心10min,获得上清液;
(5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中,加入3倍上清液体积的-20℃预冷无水乙醇,混匀,此时有DNA析出,倒去上清液,后再用1ml-20℃预冷无水乙醇清洗一次,倒去上清液;
(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45℃预热的去离子水,再放入45℃水浴锅中溶解,重复步骤(5)的操作一至两次,10000rpm离心1min后,去上清后再次空转10000rpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇,待沉淀微白时取出,加入200μL去离子水后获得DNA,后将提取的DNA放置-20℃冰箱中备用。
其中,步骤(2)中CTAB/SDS的体积比为1:6;步骤(4)中氯仿/异戊醇的体积比为24:1。
1、DNA核酸定量
测定上述方法提取的茶树DNA在230nm,260nm、280nm的光密度值,通过计算得到以下数据:A260/A280=2.00,A260/A230=1.98,DNA浓度=577.7ng/μL。
以上数据可以看出:本发明的方法提取的DNA浓度高,纯度高,受RNA、碳水化合物和盐类的污染较少。
2、琼脂糖凝胶电泳分析
称取2g琼脂糖粉末于锥形瓶中,加入0.5×TBE电泳缓冲液20ml;随即用微波炉加热至粉末完全溶化,稍摇匀,待溶液完全透明,冷却至60℃左右,倒入已经在一端插好梳子的有机玻璃胶槽中。当胶凝固后,拔起梳子,将加样孔端放进电泳槽阴极段。在电泳槽内加0.5×TBE缓冲液至液面覆盖过胶面。用移液枪取2μl本发明提取的DNA原液和1μlloadingbuffer,充分混匀后加进点样孔;在0.5×TBE缓冲液中用100V电压,电泳40min,最后将凝胶置于紫外光与凝胶成像系统上观察,并保存图像,如图1所示。
从图1中可以看出:使用本发明的方法提取的基因组DNA电泳呈现一条较粗且明亮的条带,点样孔有一点微微的发亮,表明提取的DNA样品浓度较高。
3、PCR扩增及电泳分析
PCR的扩增检测,所用引物是上海生工公司生产引物S82,反应仪器S1000TMPCR仪。PCR反应总体积为11μl,其中模板DNA2.0μl,PCRbuffer1.0μl,MgCl21.0μl,dNTP0.9μl,引物0.5μl,taqDNA聚合酶0.1μl。
PCR循环程序:95℃预变性1分钟,98℃变性15秒,57℃退火25秒;然后72℃延伸20秒,一共35个循环,最后延伸10分钟,4℃条件下保存。PCR结束后,用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,在100V电压下电泳45min,最后置于凝胶成像系统下观察,并保存图片,如图2所示。
从图2中可以看出:对本发明提取的基因组DNA进行PCR扩增,获得清晰的扩增条带。说明高效提取法提取的基因组DNA活性良好,可作为PCR反应的模板,满足PCR反应对DNA质量需求。
Claims (3)
1.一种茶树DNA的提取方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)取茶树嫩叶、成熟叶或茶树嫩根放置于液氮中研磨成粉末状;
(2)将步骤(1)的粉末中取出0.2克放入2mL的离心管后,加入650μL水浴的提取液,所述的提取液由pH8.0;100mmol/L的Tris-盐酸、pH8.0;20mmol/L的EDTA、1.0mol/L的氯化钠、w/v比例为4%的PVP、w/v比例为2%的CTAB/SDS组成,漩涡震荡充分混匀后,再加入15μL的β-巯基乙醇,60℃-70℃,水浴15-25min,每隔5min混匀一次,得到粗样品;
(3)水浴结束后加入10μL,10mg/mL的RNase-A混匀后,40℃水浴5min,得到粗样品;
(4)取出离心管先后加入PH8.0;400μL的Tris平衡酚和400μL氯仿/异戊醇,漩涡震荡充分混匀后10000rpm离心10min,获得上清液;
(5)将步骤(4)的上清液移至一个新的2mL的离心管中,加入3倍上清液体积的-20℃预冷无水乙醇,混匀,此时有DNA析出,倒去上清液,后再用1ml-20℃预冷无水乙醇清洗一次,倒去上清液;
(6)将步骤(5)得到的沉淀物中加入45℃预热的去离子水,再放入45℃水浴锅中溶解,重复步骤(5)的操作一至两次,10000rpm离心1min后,去上清液后再次空转10000rpm离心30s后放在常温真空干燥器中蒸发剩余乙醇,待沉淀微白时取出,加入200μL去离子水后获得DNA,后将提取的DNA放置-20℃冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的茶树DNA的提取方法,其特征在于,步骤(2)中CTAB/SDS体积比为1:6。
3.根据权利要求1所述的茶树DNA的提取方法,其特征在于,步骤(4)中氯仿/异戊醇体积比为24:1。
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