CN105368814A - 一种转基因植株dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种转基因植株DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)先将CTAB提取液预热；(2)取转基因植株叶片置于研钵中，将其研磨成匀浆液；(3)吸取匀浆液加入到离心管中，水浴，轻摇；(4)待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入氯仿，混匀，然后将离心管在常温下离心；(5)吸取离心管中的上清液加入到新的离心管中，再加入异丙醇，混匀，沉淀，离心；(6)去除上清，用酒精洗涤沉淀，移除酒精，然后在常温下离心，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置；(7)往离心管中加入的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，溶解完全，即得转基因植株DNA提取液。本发明的提取方法得到DNA的质量和得率都大大提高，适合于大规模转基因拟南芥或烟草DNA的提取。

Description

一种转基因植株DNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体的说是涉及一种转基因植株DNA的提取方法。

背景技术

目前，拟南芥和烟草是最常用模式植物，在基因功能研究中起到举足轻重的作用。在转基因工作中，经常需要提取转基因植株的DNA，比如转基因鉴定、插入位点检测、拷贝数分析等。由于每个转基因株系的插入位点和拷贝数存在差异，通常需要提取几十株甚至几百株植株的DNA，工作量巨大。因此如何一次性获得质量好且量足够的转基因植株DNA，是转基因研究工作开展的前提。

常规拟南芥和烟草提取DNA的方法由以下两种：SDS法和CTAB法。

SDS法，步骤如下：(1)取新鲜的拟南芥叶片2-3片加入2mL的离心管中，加入液氮，玻璃棒研碎；(2)研磨以后，加入600-700μL的提取液，混匀，然后在60℃下水浴20-60min；(3)4℃下12000r/min离心10min；(4)取上清液至一新管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，4℃下12000r/min离心7min；(5)取上清液至一新管，加入70％体积的异丙醇，混匀，4℃下12000r/min离心15min；(6)弃上清，70％乙醇洗2次沉淀，吹干；(7)溶于20-30μL含有0.1mg/mLRNase的ddH₂O中。

CTAB法，步骤如下：(1)取一片大小为0.5cm×2cm的新鲜叶子用液氮快速冷冻后放置于1.5mL的eppendorf管中用末端烧溶合蓝枪头碾碎；(2)研磨以后，加入600μL的提取液,颠倒离心管数次混匀，然后在65℃下水浴60min；(3)取出后加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提液，混匀，用Eppendorf离心机于4℃，10000r/min离心5min。(4)将上清液转至新的离心管中，加入RNaseA至终浓度为1μg/mL，在37℃下放置30min。再加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提液抽提一次，同样用Eppendorf离心机于4℃，10000r/min离心5min；(5)将上清液转至新的离心管中，用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。将水相转至新的离心管中，加入1/10体积3mol/L的NaAc(pH5.2)，3倍体积的100％乙醇后-70℃放置8～12min，沉淀DNA；(6)4℃，10000r/min离心10min。弃去上清液，用70％乙醇洗涤DNA沉淀两次；(7)放置于室温晾干后，加入20μLTE缓冲液溶解DNA后保存于-20℃用于PCR实验。

上述两种DNA的提取方法主要存在的缺陷或不足之处为：

(1)现行方法存在使用大量有毒试剂的问题，比如β-巯基乙醇、异戊醇和饱和酚，这些试剂均有毒且发出难闻的气味，对实验操作者带来风险，并且容易污染环境。

(2)直接在1.5mL或2mL的eppendorf管中利用枪头对样品进行研磨，通常研磨不充分，容易导致DNA提取失败，并且不适合大规模转基因样品DNA的提取。

(3)DNA提取率低，难以满足多项实验检测的需要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有拟南芥和烟草提取DNA的方法的不足，本发明的目的是提供一种适合于大规模转基因拟南芥和烟草DNA的提取方法。

本发明提供的技术方案为：

一种转基因植株DNA的提取方法，包括以下步骤：

(1)先将2％CTAB提取液置于65℃水浴锅中预热，在使用前摇匀；

(2)取转基因烟草或拟南芥叶片1-2g置于研钵中，向研钵中加入预热后的CTAB提取液2.4mL，再加入1-2g石英砂，将其研磨成匀浆液，得到匀浆液；

(3)吸取1.0mL匀浆液加入到2mL离心管中，置于65℃水浴1h，每20min轻摇1次；

(4)待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入0.6mL氯仿，混匀，然后将离心管在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(5)吸取离心管中的上清液0.7mL加入到另一个新的2mL离心管中，再加入0.5mL的异丙醇，混匀，于-20℃沉淀20min，在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(6)去除上清，用1mL70％的酒精洗涤沉淀1次，移除酒精，然后在常温、转速为10000r/min下离心1min，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置5-10min；

(7)往离心管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，使之溶解完全，所得溶液即为转基因烟草或拟南芥DNA提取液，将其置于-20℃下保存，备用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本方案提取液中不用有毒难闻的试剂β-巯基乙醇，并且在提取的过程中也不用有毒难闻的药品异戊醇和酚，减少实验对操作者和环境的影响。

(2)样品研磨采用石英砂+2.4ml提取液+转基因植物叶片共同研磨成匀浆的方式，可以保证每个样品研磨充分(加入大体积的提取液体2.4ml，是为了更好的匀浆，加入石英砂是为了增加摩擦系数)，并且适合于大批量、大规模提取转基因植株DNA。

(3)优化实验步骤，本方案只用氯仿抽提一次即可，不用有毒且难闻的酚和异戊醇，减少有毒试剂的使用量，降低对环境的污染。

(4)研磨后吸取匀浆液1ml，而不是常用方法中的600μL，主要是为了增加样品的量，便于提取更多的DNA，每20min轻摇一次，主要是为了让提取液在水浴过程中与样品的充分混匀。

(5)加氯仿离心后，吸取上清液最多0.7ml，吸取时尽量远离中间层，减少蛋白质的污染。

(6)采用0.7倍体积的异丙醇在-20℃条件下沉淀DNA，20分钟即可，可以缩短实验操作的时间。

(7)用酒精洗涤DNA沉淀后，采用再次离心1min的方式将残留酒精完全离心到管底，利用移液枪将其移除，可以加快DNA沉淀中酒精的挥发，节省实验操作时间。

(8)200μL的TE缓冲液溶解沉淀，而不是常规方法中的20-30μL溶解沉淀，可以充分溶解DNA。

(9)本方案提取过程中不用液氮，降低实验成本。

(10)本实验方案中，全部采用常温离心，离心速度定为10000r/min，降低DNA提取对实验条件的限制，并有助于能耗的降低。

附图说明

图1为本发明方法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图；

有关附图标记的说明：

A-提取拟南芥DNA的琼脂糖凝胶电泳图；B-提取烟草DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：本发明转基因植株DNA的提取方法(分别提取转基因拟南芥和烟草各2株)

1.1主要试剂：提取液2％CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，10mmol/LEDTA；其他试剂：异丙醇、氯仿、TE缓冲液。

1.2主要仪器：移液枪、离心机、水浴锅、冰箱、电泳系统、美国quawellQ3000超微量紫外分光光度计等。

1.3提取方法包括如下步骤：

(1)先将2％CTAB提取液置于65℃水浴锅中预热，在使用前摇匀；

(2)取转基因烟草或拟南芥叶片1-2g置于研钵中，向研钵中加入预热后的CTAB提取液2.4mL，再加入1-2g石英砂，将其研磨成匀浆液，得到匀浆液；

(3)吸取1.0mL匀浆液加入到2mL离心管中，置于65℃水浴1h，每20min轻摇1次；

(4)待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入0.6mL氯仿，混匀，然后将离心管在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(5)吸取离心管中的上清液0.7mL加入到另一个新的2mL离心管中，再加入0.5mL的异丙醇，混匀，于-20℃沉淀20min，在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(6)去除上清，用1mL70％的酒精洗涤沉淀1次，移除酒精，然后在常温、转速为10000r/min下离心1min，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置5-10min；

(7)往离心管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，使之溶解完全，所得溶液即为转基因烟草或拟南芥DNA提取液，将其置于-20℃下保存，备用。

对比实施例2：SDS法提取转基因植株DNA的方法(分别提取转基因拟南芥和烟草各2株)

2.1主要试剂：提取液0.2mol/LTris-HCl(pH7.5)、0.5％SDS、0.25mol/LNaCl、1％β-巯基乙醇；其他试剂：异丙醇、氯仿、异戊醇、液氮。

2.2主要仪器：移液枪、离心机、冰箱、电泳系统等。

2.3方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜的拟南芥叶片2-3片加入2mL的离心管中，加入液氮，玻璃棒研碎；

(2)研磨以后，加入600-700μL的提取液，混匀，然后在60℃下水浴20-60min；

(3)4℃下12000r/min离心10min；

(4)取上清液至一新管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，4℃下12000r/min离心7min；

(5)取上清液至一新管，加入70％体积的异丙醇，混匀，4℃下12000r/min离心15min；

(6)弃上清，70％乙醇洗2次沉淀，吹干；

(7)溶于20-30μL含有0.1mg/mLRNase的ddH₂O中。

对比实施例3：CTAB法提取转基因植株DNA的方法(分别提取转基因拟南芥和烟草各2株)

3.1主要试剂：提取液2％CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，10mmol/LEDTA，2％β-巯基乙醇；其他试剂：异丙醇、酚、氯仿、异戊醇、液氮。

3.2主要仪器：移液枪、离心机、冰箱、电泳系统等。

3.3方法，包括以下步骤：

(1)取1片大小为0.5cm×2cm的烟草新鲜叶子用液氮快速冷冻后放置于1.5mL的eppendorf管中用末端烧溶合蓝枪头碾碎；

(2)研磨以后，加入600μL的提取液,颠倒离心管数次混匀，然后在65℃下水浴60min；

(3)取出后加等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提液，混匀，用Eppendorf离心机于4℃，10000r/min离心5min。

(4)将上清液转至新的离心管中，加入RNaseA至终浓度为1μg/mL，在37℃下放置30min。再加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提液抽提一次，同样用Eppendorf离心机于4℃，10000r/min离心5min；

(5)将上清液转至新的离心管中，用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。将水相转至新的离心管中，加入1/10体积3mol/L的NaAc(pH5.2)，3倍体积的100％乙醇后-70℃放置8～12min，沉淀DNA；

(6)4℃，10000r/min离心10min。弃去上清液，用70％乙醇洗涤DNA沉淀两次；

(7)放置于室温晾干后，加入20μLTE缓冲液溶解DNA后保存于-20℃用于PCR实验。

表1本发明的提取方法提取转基因拟南芥和烟草DNA的质量和提取率测定

标准DNA的分光比值OD_260/280应介于1.8-1.9之间。如表1所示，本实验方案的两个实施例1提取的转基因拟南芥和烟草DNAOD_260/280比值分别介于1.81-1.89和1.85-1.88，DNA得率介于46.1-50.09μg和53.28-58.18μg之间；而对比实施例2的比值分别介于1.66-1.71和1.59-1.65，DNA得率介于6.1-7.22μg和5.49-6.25μg之间；对比实施例3的比值分别介于5.65-6.71μg和4.65-5.92μg。因此通过比较可以看出，本实施方法获得的DNA质量高于对比实施例，而DNA得率也远高于对比实施例。

综上所述，本发明的提取方法提取的转基因拟南芥和烟草DNA质量和得率都明显提高，成功率高，非常适合于大规模转基因植株DNA的提取。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (1)

1.一种转基因植株DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)先将2％CTAB提取液置于65℃水浴锅中预热，在使用前摇匀；

(2)取转基因烟草或拟南芥叶片1-2g置于研钵中，向研钵中加入预热后的CTAB提取液2.4mL，再加入1-2g石英砂，将其研磨成匀浆液，得到匀浆液；

(3)吸取1.0mL匀浆液加入到2mL离心管中，置于65℃水浴1h，每20min轻摇1次；

(4)待水浴结束后取出离心管，向每管匀浆液中加入0.6mL氯仿，混匀，然后将离心管在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(5)吸取离心管中的上清液0.7mL加入到另一个新的2mL离心管中，再加入0.5mL的异丙醇，混匀，于-20℃沉淀20min，在常温、转速为10000r/min下离心8min；

(6)去除上清，用1mL70％的酒精洗涤沉淀1次，移除酒精，然后在常温、转速为10000r/min下离心1min，再用移液枪吸取离心管中剩余的酒精，在室温下放置5-10min；

(7)往离心管中加入200μL的TE缓冲液溶解沉淀，摇匀，使之溶解完全，所得溶液即为转基因烟草或拟南芥DNA提取液，将其置于-20℃下保存，备用。